Khả năng liên kết của 2F7 với Ara h 1 khi nhân tố ức chế là Ara h 1 từ đậu phộng tươi và rang tương đương nhau là vì các epitope gắn với 2F7 trên Ara h 1 khôn gbị biến đổi bởi quá trình rang. Mặt khác, rang làm biến đổi cấu trúc các epitope gắn với 2C12 dẫn đến làm giảm khả năng nhận diện ra Ara h1.
Vì epitope 2F7 không bị biến đổi trong khi rang nên trong phương pháp Elisa dùng 2F7 như là kháng thể bắt hay kháng thể phát hiện có thể giảm để định lượng Aea h 1 được trích từ đậu phộng rang sẽ cho kết quả độc lập với sự biến đổi của epitope gắn với kháng thể.
4.2.5. Ứng dụng Elisa phân tích Ara h2
Ta sử dụng phương pháp Elisa không cạnh tranh [49 ]
4.2.5.1.Tiến hành
Phân tích Ara h 2 cơ bản tương tự như phân tích Ara h1. Điểm khác ở đây là ở kháng thể bắt và kháng thể phát hiện được sử dụng. Kháng thể bắt đặc hiệu với Ara h 2 là 4996D3, kháng thể phát hiện được dùng là 5048B3 [49 ]
Do đó ở khâu chuẩn bị dịch chiết, chất chuẩn, kháng thể bắt, kháng thể phát hiện và enzyme thao tác hoàn toàn tương tự như phân tích Ara h1 [49].
Hình 4.20: Quy trình xác định hàm lượng Ara h 2 trong đậu phộng . Ủ qua đêm ở 4oC Rửa Ủ trong 1 giờ ở 37oC Rửa Ủ trong 1 giờ ở 37oC Rửa Ủ trong 10 phút Dừng phản ứng ezyme Đo OD 450nm nghiền Trích ly Ly tâm lấy phần nổi 12g đậu phộng DD PBS, NaCl 1M, pH 7.4 100 µl mAb 4996D3 100µl 5048B3 -bitotin 100µl O- pheylenediamine 50µl HCl Kết quả 100µl HPR- avidin Ủ trong 1 giờ ở 37oC Rửa 100 µl 16000 v/ph 5 phút
Ta sẽ tiến hành thí nghiệm như sau:
100µl kháng thể bắt 4996D3 được pha loãng trong dung dịch đệm được cho vào mỗi giếng và ủ qua đêm ở 40C. Kháng thể bắt sẽ gắn chặt lên giếng. Sau đó ta rửa giếng 4 lần bằng dung dịch rửa để loại bỏ những kháng thể không gắn được lên giếng.
100µl chất chuẩn hay chất cần phân tích được thêm vào giếng. Sau khi ủ trong 1 giờ ở 370C, giếng được rửa 4 lần. Những chất không kết hợp với kháng thể bắt sẽ bị rửa trôi.
100 µl kháng thể phát hiện 5048B3 đã biotin hóa được thêm vào và ủ trong 1 giờ ở 37oC. Tiếp tục ta rửa 4 lần để loại đi những kháng thể không liên kết.
100 µl dung dịch enzyme HRP-avidin được cho vào, ủ trong 1 giờ ở 37oC. Lúc này avidin trên enzyme sẽ liên kết vói biotin trên kháng thể phát hiện. Những enzyme không liên kết với kháng thể sẽ bị rửa khỏi giếng sau đó.
100 µl dung dịch citrat có chứa O-pheylenediamine (cơ chất của enzyme) được thêm vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 5-10 phút. Phản ứng xảy ra làm dung dịch từ không màu chuyển thành màu nâu/ cam/ vàng. Để dừng phản ứng ta sử
4.2.5.2. Kết quả
Mật độ quang ở mỗi giếng sẽ được đo bởi một đầu đọc ở bước sóng 450nm (thiết bị spectramax 340 của Đức) [49]. Một đường cong chuẩn được xây dựng dựa trên sự thay đổi mất độ quang của dãy nồng độ chất chuẩn. Nồng độ của chất mẫu cần phân tích có thể xác định dựa trên đường chuẩn bằng phần mềm tính tóan của thiết bị.
4.2.6. Ứng dụng Elisa xác định Gly m 1
Trong thí nghiệm này ta phân tích bằng Elysa system kit để phân tích Gly m1. Đây là loại kit thường dùng để xác định nhanh chất gây dị ứng. Nó có thể phát hiện các protein của đậu nành trong các sản phẩm thực phẩm như bánh cookie, bánh cracker, sữa, chocolate, thịt…với giới hạn phát hiện là 0,2ng/mL, giới hạn định lượng là 0.4ng/mL.
4.2.6.1. Tiến hành
Chuẩn bị dịch chiết protein đậu nành
Đậu nành đã ngâm qua đêm với nước cất sẽ được nghiền trong dung dịch 0,1 M Tris-HCl (pH 8,6). Hỗn hợp được lọc và dịch sau lọc đem ly tâm trong 20 phút với tốc độ 53000 vòng/phút ở 40C. Lớp trên cùng sẽ được thu hồi và rửa lần nữa torng 0,1M Tris-HCl; 0,5M NaCl (pH 8.6) và ly tâm như điều kiện ở trên
Ta tiếp tục thu hồi lớp trên và cho vào dung dịch NaCO3 0,1M rồi ly tâm như trên.
Cuối cùng, lớp trên cùng được đem thẩm tích qua màng.
Hình 4.21: Sơ đồ chuẩn bị dịch trích đậu nành từ hạt đậu nành
Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Chuẩn bị mẫu chuẫn có nồng độ 0.1-10 ng/ml. (Tùy thuộc điều kiện thí nghiệm mà có thể thay đổi dãy nồng độ của chất chuẩn).
Thực hiện trên thiết bị
100µl kháng thể bắt mAb-6G1 với nồng độ 5µg/ml trong dung dịch đệm được cho vào mỗi giếng và ủ qua đêm ở 40C. Sau đó ta rửa giếng 4 lần bằng dung dịch rửa để loại bỏ những kháng thể không gắn được lên giếng.
100µl chất chuẩn hay mẫu cần phân tích được thêm vào giếng. Sau khi ủ trong 1 giờ ở 370C, giếng được rửa 4 lần. Những chất không kết hợp với kháng thể bắt sẽ bị rửa trôi.
100 µl kháng thể phát hiện mAb-1G10 đã biotin hóa được thêm vào và ủ trong 1 giờ ở 37oC. Tiếp tục ta rửa 4 lần để loại đi những kháng thể không liên kết.
100 µl dung dịch enzyme streptavidin peroxidase được cho vào .Hỗn hợp được ủ trong 1 giờ ở 37oC để avidin trên enzyme sẽ liên kết vói biotin trên kháng thể phát hiện. Những enzyme không liên kết với kháng thể sẽ bị rửa khỏi giếng sau đó.
100 µl dung dịch O-pheylenediamine (cơ chất của enzyme) được thêm vào mỗi giếng và ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 5-10 phút. Phản ứng xảy ra làm dung dịch từ không màu chuyển thành màu nâu/cam/vàng. Để dừng phản ứng ta sử dụng HCl.