50g đậu phộng giống Jumbo tươi hay rang ỏ 177oC trong 15 phút được nghiền. Hỗn hợp này được hòa tan bằng acetone đã được làm lạnh ở 4oC và được lọc qua giấy lọc Whatman (Công ty Whatman, Maidstone, UK). Phần paste được rửa với 20 w/v aceton (4oC) và để khô qua đêm ở nhiệt độ phòng. Bột đậu phộng khô được trích 30
phút trong 1L pBS, 1M NaCl ở 60 C rồi đem ly tâm với tốc độ 14000 vòng/phút trong 15 phút ở nhệt độ phòng. Sau đó phần nổi được lọc và trữ ở 40C [27].
Ara h 1 được tinh sạch từ dịch trích đậu phộng được đưa qua cột có 2F7 được cân bằng bởi PBS. Ara h 1 được nối sẽ được tách rửa với 0,1M glycine, 150 mM NaCl, pH 2,5 và mẫu sau khi tách được trung hòa với 2M Tris pH 8. Ara h 1 tinh sạch được tập trung và thẩm tích bởi PBS một lần nữa [27].
e) Tiến hành:
Thí nghiệm kiểm tra sự hạn chế của 2F7 khi nối với các epitope trên Ara h 1 của 2F7
Hình 4.15: Quy trình thí nghiệm kiểm tra sự hạn chế của 2F7 khi nối với các epitope trên Ara h 1 của 2F7
Ủ qua đêm ở 4oC Rửa Ủ trong 1 giờ ở 37oC Rửa Ủ trong 2 giờ ở 37oC Rửa Ủ trong 10 phút Dừng phản ứng ezyme Đo OD 450nm Ara h 1 tinh sạch từ đậu phộng rang/tươi mAb 2C12 100µl 2F7 -bitotin 100µl ABTS 50µl HCl Kết quả 100µl streptavidin- peroxidase Ủ trong 1 giờ ở 37oC Rửa Ara h 1 tinh sạch từ đậu phộng rang Ủ trong 2,5 giờ ở 37oC Pha loãng
Cho 200 ng/giếng kháng thể đơn dòng 2C12 trong dung dịch đệm 0.005 M carbonate- bicarbonate, pH 9.6 qua đêm ở 4oC.
Kháng thể đơn dòng 2F7 được biotyl hóa (tỉ lệ 1:1000) và được ủ 2.5 giờ với Ara h 1 được tinh sạch từ đậu phộng tươi hay rang đã được pha loãng ( từ 50 µg/mL xuống còn 49 ng/mL)
Giếng được ủ 1 giờ với 2µg/mL Ara 1 từ đậu phộng rang và sau đó là 2 giờ với 2F7 biotyl hóa .
Sau đó giếng được ủ với streptavidin-peroxidase và màu được phát hiện khi bổ sung cơ chất ABTS (2,20-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)
Hình 4.16: Sơ đồ phân tích Elisa kiểm tra sự hạn chế của 2F7 nối với Ara h 1 từ đậu phộng rang bởi nhân tố hạn chế là Ara h 1 từ đậu phộng rang (hình tròn
được tô) hay từ đậu phộng tươi (hình tròn không tô)[].
Hình 4.17: Quy trình thí nghiệm kiểm tra sự hạn chế của 212 khi nối với các epitope trên Ara h 1 của 2C12.
Ủ qua đêm ở 4oC Rửa Ủ trong 1 giờ ở 37oC Rửa Ủ trong 2 giờ ở 37oC Rửa Ủ trong 10 phút Dừng phản ứng ezyme Đo OD 450nm Ara h 1 tinh sạch từ đậu phộng rang/tươi mAb 272 100µl 2C12 -bitotin 100µl ABTS 50µl HCl Kết quả 100µl streptavidin- peroxidase Ủ trong 1 giờ ở 37oC Rửa Ara h 1 tinh sạch từ đậu phộng rang/tươi Ủ trong 2,5 giờ ở 37oC Pha loãng
Giếng được phủ 1µg/ giếng kháng thể đơn dòng 2F7. Sau đó ủ giếng với 2
µg/m Ara h 1 tinh sạch từ đậu phộng tươi (thí nghiệm a) hoặc đậu phộng rang ( thí nghiệm b).
Tiếp theo ta ủ giếng trong 30 phút với 2C12 được botinyl hóa ( tỉ lệ 1:10000) mà 2C12 trước đó đã ủ trong 2.5 giờ với Ara h 1 tinh sạch từ đậu phộng tươi hay luộc đã pha loãng ( pha loãng hai lần bắt đầu với 165 và 1850 µg/mL Ara h 1 ứng với từ đậu phộng tươi hay rang) cho mỗi thí nghiệm a và b.
Hình 4.18: Sơ đồ Elisa kiểm tra sự hạn chế của của 2C12 được biotyl hóa nối với Ara h 1 từ đậu phộng rang hay tươi với nhân tố hạn chế là đậu phộng rang
( hình tròn tô đen) hay tươi (hình tròn không tô).[] f) Kết quả
Hình 4.19: Đồ thị thể hiện sự ức chế của các mAb gắn với Ara h 1
Nhân tố ức chế là Ara h 1 từ đậu phộng tươi (-♦-) hay rang (- - ) a) Sự ức chế 2F7 gắn với Ara h 1 từ đậu phộng rang
b) Sự ức chế 2C12 gắn với Ara h 1 từ đậu phộng rang c) Sự ức chế 2C12 gắn với Ara h 1 từ đậu phộng tươi
Kết quả cho thấy việc liên kết của 2F7 với Ara h 1 từ đậu phộng tươi hay luộc là tương tự như nhau. Điều này có thể thấy trên đồ thị: hai hình dạng cho hai nhân tố ức chế ( Ara h 1 từ đậu phộng tươi và rang) là gần giống nhau.
Đường cong ức chế cả 2C12 gắn với Ara h 1 dịch về bên phải khi nhân tố ức chế là Ara h 1 từ đậu phộng rang thay vì đậu phộng tươi. Điều đó có nghĩa là 2C12 liên kết với Ara h 1 từ đậu phộng tươi tốt hơn so với Ara h 1 từ đậu phộng rang.
Đồ thị cũng cho thấy rằng khả năng liên kết của 2C12 tăng lên đến 150% (đối với Ara h 1 từ đậu phộng tươi) và 120% (đối với Ara h 1 từ đậu phộng tươi) nhân tố ức chế là Ara h 1 từ đậu phộng rang khi.
Như vậy ta có thể thấy 2F7 và 2C12 liên kết với Ara h 1 rất khác nhau (có thể thấy trên đồ thị) và khả năng liên kết của 2C12 ít hơn 2F7 khoảng 100 lần ( đường cong của 2C12 dịch sang phải so với 2F7).