Giới thiệu về gel polyacrylamide
Acrylamide là một monomer có cấu trúc như sau :
Hình 4.1: Cấu trúc acrylamide [51]
Khi có mặt các gốc tự do, được cung vấp bởi ammonium persuphate và ổn định bởi TMED (N,N,N’,N’- tetramethylethylene- diamie), phản ứng chuỗi được bắt đầi trong đó các acrylamide monomer được polymer hóa (trùng hợp) thành một chuỗi dài. Khi bisacrylamide (N,N’-methylenebisacrylamide) được bổ sung trong phản ứng polymer hóa, các chuỗi sẽ liên kết chéo (cross-linking) để tạo thành dạng gel. Độ xốp của gel được xác định bởi chiều dài của chuỗi và mức độ liên kết chéo. Chiều dài của chuỗi polyacrylamide được xác định bằng nồng độ acrylamide trong phản ứng polymer hóa ( giửa 3.5% và 20%) [51,52].
Phạm vi kích thước phân tử và độ phân giải của quá trình phân tách tùy thuộc vào nồng độ của acrylamide và bis-acrylamide (và tỷ lệ của chúng) do chúng tạo ra khuôn gel với các phần trăm khác nhau của acrylamide và bậc của liên kết chéo. Nồng độ thấp tạo ra các lỗ có kích thước lớn hơn và vì thế có thể phân tách các phân tử lớn hơn. Liên kết chéo của các monomer và các tác nhân liên kết có thể được điều chỉnh để kiểm soát mức độ xốp của khuôn gel. Điều này cho phép tối ưu hóa một khuôn gel để phân tách một phạm vi kích thước đặc biệt của các phân tử protein [51].
Ưu điểm của gel polyacrylamide :
− Bằng cách thay đổi nồng độ các chất tạo gel có thể thay đồi kích thước mạng lưới lỗ trong một phạm vi rộng.
− Ta có thể tạo gel đồng nhất trong những ống chuẩn và như thể nhân được những kết quả phiên bảng.
− Nhiều loại dung dịch đệm có thể được sử dụng.
− Không hấp phụ ánh sáng cực tím ở bước sóng 270nm do đó có thể định vị các protein ở khoảng độ dài sóng này.
− Ta có thể nhuộm màu và định lượng bằng quang kế hay kết hợp với sắc kí khối phổ.
Gel polyacrylamide gồm hai thành phần:
Gel phân tách: (separating gel/ running gel)
Loại gel này có nồng độ acrylamide tương đối cao (5-30%). Nồng độ của gel phân tách phụ thuộc vào độ lớn của protein cần phân tách. Nồng độ acrylamide càng cao thì phân tách được các phân tử protein càng nhỏ. Gel 5% acrylamide phân tách được protein có phân tử lượng 60 - 200 kDa, 10% thì 16 đến 70 kDa, 15% thì 12 đến 45 kDa. Ngoài ra, gel có nồng độ cao hơn có thể phân tách các protein nhỏ với chất lượng cao hơn [49,52 ]
Gel tập trung (stacking gel)
Loại gel này thì có nồng độ acrylamide thấp (2-4%), có tác dụng làm nguyên liệu tập trung tạo nên một băng mẫu vật gọn, mảnh (các thành phần của mẫu nằm sát nhau nên có cùng điểm xuất phát), trước khi chúng đi vào lớp gel phân tách [ 49]
Hình 4.2: Sơ đồ và hình ảnh của buồng điện di polyacrylamide gel [51]
Các phuơng pháp điện di trên gel polyacrylamide
Điện di SDS-PAGE
Điện di trên polyacrylamide gel với sự có mặt của SDS (sodium dodecyl sulfate) là kỹ thuật dùng trong hóa sinh, di truyền và sinh học phân tử để phân tách các protein theo tính linh động điện di của chúng (phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi
polypeptide hoặc khối lượng phân tử, cấu hình (xoắn) của protein, các biến đổi hậu dịch mã và các nhân tố khác). Điện di SDS cho phép phân ly các phân tử protein có khối lượng khác nhau. SDS có điện tích âm rất lớn và có khả năng liên kết với mạch peptide để biến tính các cấu trúc bậc hai và bậc ba (không liên kết bằng cầu disulfide) của protein bằng cách bọc xung quanh khung polypeptide. Như vậy, số lượng SDS tương tác với protein tỷ lệ với khối lượng/kích thước phân tử protein và điện tích của SDS bám vào có thể làm bất cứ phân tử protein nào cũng chuyển động trong điện trường từ cực âm (-) sang cực dương (+). Do đó, bằng phương pháp điện di, có thể phân tách riêng biệt các phân tử protein có khối lượng phân tử khác nhau [32,49,51].
Không có SDS, các protein khác nhau có khối lượng phân tử tương tự sẽ dịch chuyển khác nhau do sự khác nhau về cuộn xoắn, bởi vì những khác nhau trong các kiểu cuộn xoắn sẽ làm cho một vài phân tử protein thích hợp tốt hơn với khuôn gel so với những phân tử protein khác. Bổ sung SDS giúp giải quyết vấn đề này, vì nó làm cho các phân tử protein trở thành mạch thẳng sao cho chúng có thể phân tách hoàn toàn theo khối lượng phân tử cấu trúc sơ cấp, hoặc số lượng (và kích thước) của các amino acid. SDS liên kết với protein theo tỷ lệ khoảng 1,4 g SDS trên 1,0 g protein (mặc dù tỷ lệ liên kết có thể thay đổi từ 1,1-2,2 g/SDS/g protein) tạo ra một tỷ lệ khối lượng/điện tích thống nhất cho mọi phân tử protein để sự dịch chuyển qua gel chỉ liên quan đến kích thước của protein. Một loại thuốc nhuộm vết có thể được bổ sung vào dung dịch protein cho phép theo dõi tiến độ của dịch chuyển protein qua gel trong suốt quá trình điện di [32,49,51].
Hình 4.3 : Kết quả điện di protein bằng kỹ thuật SDS-PAGE và nhuộm bằng Coomassie blue [49 ]
WM: Chuẩn khối lượng phân tử của protein. Các đường 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 và 8: Mẫu protein.
Khử SDS-PAGE
Bên cạnh việc bổ sung SDS, protein có thể được đun nóng nhanh gần đến sôi với sự có mặt của một tác nhân khử, ví dụ như dithiothreitol (DTT) hoặc 2- mercaptoethanol (BME), để biến tính thêm protein bằng cách khử các liên kết disulfide, vì thế khắc phục được một vài dạng cuộn xoắn bậc ba của protein, và bẻ gãy cấu trúc bậc bốn của protein (các tiểu đơn vị oligomer). Phương thức này được xem như là khử SDS-PAGE, và được sử dụng phổ biến nhất [49,51].
Trường hợp không khử SDS-PAGE (không đun sôi và không có tác nhân khử) có thể được dùng khi cấu trúc nguyên thể là quan trọng trong phân tích về sau (chẳng hạn như hoạt tính enzyme, được trình bày bằng việc sử dụng zymogram).
4.1.2. Ứng dụng điện di để phân tích các chất gây dị ứng
Nghiên cứu của Koppelman và cộng sự để định lượng Ara h 1 và Ara h 2 trong các giống đậu phộng
4.1.2.1. Nguyên liệu
Các giống đậu phộng khác nhau được cung cấp bởi Imko Nut Products (Doetinchem, Hà Lan) và được trữ ở 100C cho đến khi sử dụng. Bảng dưới đây sẽ tóm tắt các giống , nguồn gốc, và kích cỡ hạt đậu phộng tính bằng số lượng hạt ăn được trên 100 gram [47]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 4.1 : Đặc điểm của các mẫu đậu phộng được sử dụng [47]
STT Giống Nguồn gốc Kích thước
1 Runner USA 60-70 2 Runner USA 40-50 3 Runner Argentina 38-42 4 Runner Argentina 28-32 5 Virginia USA 21-26 6 Virginia USA 36-45 7 Virginia China 25-29 8 Virginia China 60-70 9 Spanish USA 60-70
10 Spanish Nam Phi 60-70
11 Spanish Nicaragua 60-70
12 Valencia China 60-70
Ta có thể sử dụng hạt đậu phộng hoặc dịch trích đậu phộng. Để chuẩn bị dịch trích đậu phộng ta làm như sau :
− 1g đậu phộng đã nghiền được cho vào 20ml Tris 20mM (pH 8.2).
− Sau 2 giờ khuấy trộn ở nhiệt độ phòng, ta đem ly tâm hai lần : lần đầu là 3000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt độ phòng ; lần hai là 10000 vòng/phút trong 15 phút ở nhiệt độ phòng để loại bỏ chất béo và các phần không tan.
− Dịch trích được trữ ở -20OC cho đến khi được sử dụng. Hàm lượng protein của đậu phộng nghiền và dịch trích đậu phộng được xác dịnh bằng phương pháp Kieldahl.
Bảng dưới đây sẽ cho thấy hàm lượng protein tổng và protein trích được trong đậu phộng.
Bảng 4.2 : Hàm lượng protein tổng và protein trích ly được trong 13 giống đậu phộng [47]. Thứ tự mẫu Protein tổng (%) Proteint trích được (%) 1 24 20 2 24 22 3 28 26 4 26 22 5 28 26 6 29 18 7 26 24 8 28 20 9 28 26 10 27 25 11 29 23 12 26 18 13 29 24 4.1.2.1. Tiến hành
Hình 4.4 Sơ đồ điện di SDS-PAGE phân tích Ara h 1 và Ara h 2
Thiết bị sử dụng là BioRad Mini Protean II System (BioRad, Hercules, CA,USA)