c) Tiến hành la
4.4.3.6. Dung dịch đệm
Dung dịch đệm 10X (100mM KCl, 100mM (NH4)2SO4, 200mM Tris-Cl pH 8.8, 20mM MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100)
4.4.3.7. Ion Mg2+
Nồng độ ion Mg2+ cũng là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR và nó tuỳ thuộc vào từng phản ứng. Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 150-200 μM. Người ta thấy rằng nếu nồng độ DNA quá cao thì enzyme polymerase sẽ gây ra nhiều lỗi hơn
4.4.4. Tiến hành
Trích ly DNA : cần phá vỡ thành tế bào thường sửdụng enzym để xúc tác
Tạo dòng In-vitro : để làm tăng số lượng bản mẫu
Phương pháp PCR bao gồm một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, thường là 20- 35 chu kỳ.Mỗi chu kỳ có 3 bước:
Bước 1: Biến tính ( denaturation phase)
Nhiệt độ tăng lên 90-95°C , thời gian 1-2 phút. Bước này gọi là biến tính vì nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA làm 2 sợi DNA tách ra. Tất cả các phản ứng enzyme trong giai đoạn này đều bị dừng lại (ví dụ: phản ứng tổng hợp DNA từ chu kỳ truớc đó).
Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn.
Bước 2 : Gắn mồi (annealing phase)
Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào đoạn mồi và thường là 40-65oC, thời gian 1-2 phút
Trong giai đoạn này các primer gắn vào các vị trí có trình tự tương đồng ở DNA khuôn mẫu. Các primer bị lắc nhẹ chung quanh do chuyển động Brown vì thế các liên kết ion được tạo thành và bị đứt gãy liên tục giữa primer sợi đơn và DNA khuôn mẫu sợi đơn. Các liên kết ion ổn định hơn tạo thành một đoạn nhỏ (các primer đã lắp ráp chính xác) và trên các đoạn nhỏ DNA sợi đôi đó (khuôn mẫu và primer) DNA-polymerase có thể bắt đầu quá trình sao chép khuôn mẫu.
Ở giai đoạn này phạm vi nhiệt đó được sử dụng rất rộng tùy thuộc vào trình tự nucleotide của primer. Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện.
Bước 3: Kéo dài (extension phase)
Nhiệt độ khoảng 70-72oC. Đây là khoảng nhiệt độ tối thích cho Taq pol tiến hành tổng hợp DNA bằng cách bổ sung các dNTP bắt đầu từ các vị trí có primer theo chiều 5’3’. Các primer có một vài base gắn vào khuôn mẫu có mối liên kết ion mạnh hơn lực phá vỡ các liên kết này sẽ không bị gãy đứt. Các primer ở các vị trí không bắt cặp chính xác lại bị rời ra (do nhiệt độ cao) khỏi khuôn mẫu đã không tổng hợp được DNA.
Tuỳ theo độ dài của trình tự DNA cần khuyếch đại mà thời gian có thể kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Hình 4.24: Sơ đồ các bước tạo dòng trong in-vitro
Hình 4.25: Các chu kỳ của PCR
Phát hiện sự có mặt của DNA
Có 3 phương pháp để phát hiện sự có mặt của DNA. Đó là điện di trên gel, PCR- Elisa và Real time PCR.
Chu kỳ 1: Biến tính Chu kỳ 1: Gắn mồi
Sợi đôi DNA
Sợi đơn DNA
Điện di trên gel agarose
Phương pháp này phát hiện DNA vào thời điểm kết thúc của phản ứng khuếch đại
Sản phẩm PCR có thể được nhận biết bằng kích thước của chúng qua việc sử dụng điện di trên gel agarose. Sắc ký gel agarose là phương pháp bao gồm việc nhỏ mẫu sản phẩm PCR của DNA vào gel agarose và sau đó chạy điện di trên gel. Kết quả là các đoạn DNA nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn các đoạn lớn qua gel từ cực âm đến cực dương. Sau khi điện di, đoạn gel được nhuộm màu với ehidium bromide. Chất màu sẽ gắn vào các acid nucleic và sản phẩm của PCR có thể Kích thước của sản phẩm PCR có thể được xác định bằng việc so sánh vói DNA. Thang này có chứa các DNA đã biết trước kích thước, cũng nằm trong gel
Ưu điểm và nhược điểm của phương pháp
.
Ưu điểm
Ưu điểm của phương pháp này là gel được rót dễ dàng, không gây biến tính
mẫu, và bền vật lý hơn polyacrylamide. Mẫu cũng dễ thu hồi.
So với các phương pháp phát hiện DNA khác thì phuơng pháp này dễ thực hiện và thiết bị đơn giản, rẻ tiền hơn
Nhược điểm
Phương pháp này chỉ có thể định tính, không thể định luợng được nồng độ chất cần phân tích .
Gel agarose có thể bị nóng chảy trong quá trình điện di, đệm có thể bị tiêu hao, và các dạng khác nhau của DNA có thể chạy không ổn định
Kết quả của điện di trên gel agarose sẽ được lấy ở điểm cuối của phản ứng PCR. Việc này sẽ làm tốn khá nhiều thơi gian, có thể lên đến vài ngày.
Kết quả thu được dựa trên đặc điểm kích thước DNA. Điều này có thể dẫn đến không chính xác.
Với những mẫu khuếch đại khác nhau ở mức độ nhỏ hơn 10 lần, điện di trên gel không thể phân biệt được. Chính vì vậy có thể nói phương pháp này có độ nhạy thấp, độ phân giải thấp.
Các bước tiến hành không hoàn toàn tự động mà cần thao tác thủ công. Nếu thao tác không cẩn thận có thể làm kết quả không được chính xác
PCR-Elisa
− Nguyên tắc:
Sau khi được khuếch đại sản phẩm của PCR được phát hiện một cách đặc hiệu nhờ vào kỹ thuật elisa.
− Tiến hành
Trong quá trình khuếch đại đoạn mồi được biotinyl hóa tạo thành sản phẩm PCR được biotinyl hóa. Sản phẩm sẽ được làm biến tính tạo thành 2 mạch đơn
Khi dùng kỹ thuật elisa, các sản phẩm sẽ có thể kết hợp với các streptavidin (enzyme) được phủ sẵn trên giếng.(do biotin và avidin có thể liên kết đặc hiệu với nhau) [41]
Tiếp theo đoạn dò đặc hiệu với DNA được cho vào. Nhờ có sự đánh dấu của đoạn dò khi các kháng thể có gắn enzyme có thể phát hiện ra sản phẩm [41].
Thêm cơ chất vào, phản ứng do enzyme xúc tác diễn ra tạo thành sản phẩm có màu. Màu sẽ được đo trên đầu đọc ở một bước sóng nhất định và cho kết quả.
− Ưu nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm
Phương pháp này ít tốn thời gian hơn và chính xác hơn điện di trên gel agarose do có sự liên kết có chọn lọc
Nhược điểm
Cũng như điện di trên gel phương pháp này chỉ dùng để định tính mà không thể định lượng chính xác nồng độ DNA có trong mẫu
So với PCR real time thì nó tốn nhiều thời gian hơn
Do vẫn có công đoạn sử dụng thao tác bằng tay nên kết quả không chính xác bằng PCR real time.
PCR real time (PCR thực thời)
Hình 4.26: Sơ đồ tiến hành phân tích PCR real time [51]
− Nguyên tắc:
Trong PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện nhờ sự phân tích đầu cuối (end-point) bằng cách chạy điện di DNA trên agarose gel sau khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, phương pháp real-time PCR cho phép phát hiện và định
lượng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự tăng lên về số lượng DNA tương ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang [ 40,42].
Trong real-time PCR, người ta thường sử dụng các loại thuốc nhuộm liên kết DNA sợi đôi (SYBR Green) để phát huỳnh quang hoặc các probe đặc hiệu chuỗi (trình tự) được đánh dấu huỳnh quang (TaqMan PCR) [40 ]
Thiết bị ổn nhiệt chu kỳ (máy PCR) đặc biệt được gắn với một module phát
hiện tín hiệu huỳnh quang để theo dõi tiến trình phản ứng khi sự khuếch đại xảy ra.
Tín hiệu huỳnh quang đo được phản ánh số lượng sản phẩm được khuếch đại trong
mỗi chu kì [40 ]
Hình 4.27: Thiết bị điều nhiệt tuần hoàn [ 51]
− Cơ chế phát huỳnh quang
Cơ chế phát hùynh quang của đoạn dò (probe)
Để có được tín hiệu huỳnh quang, một đoạn dò có thể phát huỳnh quang sẽ được thiết kế để có thể gắn với sản phẩm của PCR trong quá trình phản ứng. Đoạn dò được thiết kế với chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ (reporter dye) và chất dập tắt hùynh quang ở đầu 3’ (quencher dye) [18,40].
Khi mẫu dò còn nguyên vẹn, sự có mặt kề nhau của của reporter dye và quencher dye sẽ ngăn cản sự phát huỳnh quang. Khi Tag polymerase sao chép sợi khuôn mà trên đó có gắn mẫu dò thì hoạt tính 5’ exonuclease của nó sẽ phân hủy
mẫu dò, hoạt tính của quencher không còn nữa thì reporter dye sẽ phát huỳnh quang. Sự phát huỳnh quang tăng lên theo mỗi chu kỳ tỷ lệ với số phân tử DNA được tổng hợp. Đó là cơ sở để định lượng chất cần phân tích [18,40].
Ngoài ra để để việc đo tín hiệu hùynh quang được chuẩn, khi thiết kế hệ đệm, nhà sản xuất thêm vào một chất làm đối chứng (passive reference). Khi đo tín hiệu huỳnh quang do reporter phát ra, máy sẽ dựa trên tín hiệu của Passive reference.
Hình 4.28: Hoạt động của đoạn dò [40 ]
Cơ chế phát huỳnh quang của thuốc nhuộm SYBR Green
Thuốc nhuộm này có thể len vào các rãnh nhỏ giữa các chuỗi DNA. Khi được gắn với sợi đôi DNA thì nó có thể phát tín hiệu hùynh quang. Khi các sợi đôi DNA được khuếch đại thì cường độ của tín hiệu sẽ tăng lên. Hoạt động của SYBR Green được thể hiện trong sơ đồ dưới đây:
Đoạn mồi xuôi
Đoạn mồi ngược Thay thế chuỗi
Cắt đứt
Hình 4.29: Sơ đồ hoạt động của thuốc nhuộm SYBR Green. [ ] SYBR Green gắn vào khi có sợi đôi DNA
Khi DNA bị biến tính thì SYBR Green sẽ trôi tụ do
Pha kéo dài bắt đầu khi các primer gắn mồi
Khi một chu kỳ hoàn thành SYBR Green lại gắn với sản phẩm DNA sợi đơn và phát hùynh quang
− Ưu nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm
Real-time PCR có ưu điểm chính so với PCR truyền thống là cho phép chúng ta định lượng số copy khởi đầu của khuôn mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao trên một phạm vi động học lớn.
Các kết quả của real-time PCR có thể là chất lượng (sự có mặt hoặc không của trình tự đích) hoặc định lượng (số bản copy của DNA). Real-time PCR định lượng còn được biết như là qPCR. Số liệu của real-time PCR có thể đánh giá mà không cần điện di gel, thời gian thí nghiệm được rút ngắn và số lượng nguyên liệu đưa vào quá trình được tăng lên.
Cuối cùng, do các phản ứng được chạy và số liệu được đánh giá trong một hệ thống tube đóng kín, nên các cơ hội nhiễm bẩn được giảm thiểu và sự cần thiết của các thao tác hậu khuếch đại được loại bỏ
Nhược điểm
Thiết bị rất đắt tiền và kỹ thuật viên phải được huấn luyện kỹ lưỡng.
Kết quả
− Nếu không phát hiện trình tự DNA cần tìm trên gel chứng tỏ mẫu thực phẩm ban đầu không chứa chất gây dị ứng có trình tự DNA cần tìm.
− Nếu phát hiện trình tự DNA cần tìm trên gel chứng tỏ sự có mặt chất gây dị ứng
