Nguyên tắc
Đây là một phương pháp kiểm tra khá nhạy để định tính hay định lượng của những protein hòa tan đặc hiệu. Sandwich Elisa nhạy hơn vì kháng thể kết hợp với kháng nguyên ở hai epitope trở lên [37].
Tiến hành
Trong phương pháp này kháng thể đặc hiệu sẽ được cố định lên bề mặt đáy giếng (kháng thể bắt - capture antibody), tiếp theo dịch mẫu cần kiểm tra sẽ được cho vào và ủ một thời gian để kháng nguyên kết hợp với kháng thể bắt. Sau đó người ta đổ dịch mẫu đi, rửa và cho tiếp kháng thể có gắn enzyme (còn gọi là kháng thể phát hiện- dectector antiboy) vào để phát hiện ra các kháng nguyên bị giữ lại. Sau một thời gian ủ, người ta rửa và thêm vào dung dịch chứa cơ chất của enzyme [37].
Hình 4.9: Sơ đồ tiến hành phân tích sandwich Elisa [37]
Kết quả phân tích:
Nếu kháng nguyên có trong mẫu sẽ có sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể phát hiện. Khi đó enzyme sẽ xúc tác cho phản ứng hóa học làm cơ chất không màu chuyển thành sản phẩm có màu và có hể nhận thấy bằng mắt thường hay được đo bằng quang phổ kế. Ta có thể định lượng chất gây dị ứng thông qua việc xây dựng đường cong chuẩn của mật độ quang (OD) theo nồng độ chất đó. Nồng độ chất gây dị ứng trong mẫu cần xác định có thể được nội suy từ đồ thị [37].
Việc này được thực hiện thông qua phần mềm dựng đồ thị của máy tính được nối với đầu đọc của thiết bị phân tích theo phương pháp elisa. Sau khi máy tính xử lý, số liệu về nồng độ chất cần phân tích sẽ được in ra [37].
Phủ kháng thê giữ lên bề mặt giếng
Thêm chất cần phân tích
Thêm kháng thể bắt có gắn enzyme
Hình 4.10: Kết quả sau khi phân tích Elisa [14].
Nhũng giếng có màu là những giếng có chứa chất gây dị úng (vói nồng độ khác nhau tùy thuộc độ đậm nhạt của màu)
b) Phương pháp Elisa cạnh tranh (competive)
Nguyên tắc:
Phương pháp này dựa vào sự cạnh tranh của kháng nguyên được định danh (được gắn trên giếng) và kháng nguyên không được định danh (chất cần kiểm tra) để liên kết với một lượng kháng thể nhất định.
Kháng thể được sử dụng chỉ có 1 vị trí gắn với kháng nguyên Tiến hành
Kháng thể thứ nhất được ủ với dịch mẫu cần kiểm tra để hình thành liên kết giữa kháng thể thứ nhất- kháng nguyên chất gây dị ứng
Cho phức hợp kháng thể - kháng nguyên này vào giếng đã gắn các kháng nguyên khác
Giếng được rửa sạch để loại bỏ các kháng thể không được nối ( càng nhiều kháng nguyên chất gây dị ứng trong mẫu, càng ít kháng thể liên kết với các kháng nguyên gắn trên giếng)
Thêm vào giếng kháng kháng thể thứ hai có gắn enzyme đặc hiệu với kháng thể thứ nhất
Hình 4.11: Sơ đồ tiến hành Elisa cạnh tranh [37]
Kết quả phân tích
Khác với elisa không cạnh tranh, trong phương pháp này nồng độ chất gây dị ứng càng cao thì màu càng nhạt ( OD càng thấp ), đường cong chuẩn sẽ là đường dốc đi xuống. Máy tính cũng sẽ đo mật độ quang ở bước sóng 450 nm , sau đó xử lý dữ liệu và in kết quả nồng độ chất dị ứng cần phân tích
4.2.3. Ưu và nhược điểm của phương pháp
− Ưu điểm
Phương pháp này dễ sử dụng, đơn giản và đặc biệt có thể tự động.
Độ nhạy cao (trong vùng nồng độ thấp), kết quả khá chính xác khi sử dụng các liên kết đặc hiệu của kháng nguyên- kháng thể để phát hiện ra chất cần phân tích.
− Nhược điểm:
Nhược điểm chủ yếu của phương pháp là thời gian phân tích khá dài và không
Kháng thể thứ nhất (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kháng nguyên hay chất gây dị ứng
Kháng thể thứ hai có gắn enzyme Cơ chất của enzyme
4.2.4. Ứng dụng Elisa phân tích Ara h1
Nghiên cứu của Koppleman và cộng sự
Mục đích của nghiên cứu: Khảo sát sự ảnh hưởng của quá trình rang đến Ara h 1
Các thí nghiệm gồm có:
Thí nghiệm xác định hàm lượng Ara h 1 trong dịch trích đậu phộng rang và đậu phộng tươi
Thí nghiệm xác định hàm lượng Ara h 1 thay đổi trong quá trình rang
Thí nghiệm xác định khả năng gắn kết với IgE của các epitope trong Ara h 1 tinh sạch từ động phộng tươi và đậu phộng rang.
4.2.4.1. Thí nghiệm 1: Xác định hàm lượng Ara h 1 trong dịch trích đậuphộng rang và đậu phộng tươi. phộng rang và đậu phộng tươi.