Mẫu được thủy phân (lysed) 30 phút trong dung dịch đệm và proteinase K. Sau đó ta lọc dung dịch qua màng silica.
Tiếp theo phần dung dịch sau lọc được đem đi ly tâm, thu được DNA được làm sạch một phần. DNA được rửa lại bằng dung dịch đệm rổi đem đi ly tâm.
Hình 4.30: Sơ đồ trích ly DNA
b) Các thành phần khác
− Dung dịch đệm Tagman: gồm 10 ống 1.2ml chứa 500mM HCl, 100mM Tris- HCl, 0.1mM EDTA, 600nM chất đối chứng (passive reference ), pH =8.3
− Enzyme polymerase: AmpliTaq Gold® DNA Polymerase có đặc tính cắt nucleotide đầu 5’ của đoạn dò .
− Đoạn mồi (primer) : Các oligonucleotid được dùng cho PCR được tổng hợp bởi MWG Bitotech, Ebersberd, Đức
Đoạn mồi thuận (forward primer) :
AR-58 F, 5’-GCAGCACTGGGA ACTCCAAGGAGACA-3’ Đoạn mồi ngược (reverse primer)
AR-143 R, 5’-GCATGAGATGTTGCTCGCAG-3’
− Nucleotide: dNTP
− Uracil- N glycosylae (UNG) : dùng để
− Đoạn dò TaqMan (probe) AR-103 T: 5’-CGAGAGGGCGAACCTGAGGCC- 3’ (modifications: 5’-FAM, 3’-TAMRA).
Đoạn dò được thiết kế với chất phát huỳnh quang ở đầu 5’(reporter dye) và chất dập tắt hùynh quang ở đầu 3’(quencher dye).
1.Trích ly DNA Thủy phân dịch trích bằng proteinase K 2.DNA được lọc qua màng silica Ly tâm dịch lọc 3.Tinh sạch DNA bằng màng silica Ly tâm dịch lọc 4.Tách rửa DNA Ly tâm dịch rửa
c) Tiến hành:
Chuẩn bị 9ml hỗn hợp gồm:
1 x TaqMan buffer A
20 µg/mL BSA ( bovine seruma albumin) được dùng để làm sạch các nuclase và DNAase của lần trước đó.
5mM MgCl2
200 µM dATP, dCTP, dGTP 400 µM dUTP
300 nM oligonucleotide (đoạn mồi) 200 nM đoạn dò Tagman
Hỗn hợp được chia thành 20 phần , mỗi phần 442.5 µL, trữ ở 40C. Mỗi phần sẽ có 10 phản ứng
Sau đó thêm vào hỗn hợp trên 2.5µL Tag- polimerase (5U/ µL) và 5µL uracil- N-glycosylase (UNG, 1u/µL)
45 µL hỗn hợp trên (có cả tag-polimerase và UNG) và 5µL mẫu DNA được cho vào thiết bị
Ta chuẩn bị thêm 6 mẫu trắng ( nontemplate control- NTC) và 2 mẫu dương tính để theo dõi độ tinh sạch của hỗn hợp.
Điều kiện tiến hành
Ta chỉnh thông số cho máy theo chế độ nhiệt như sau:
Bảng 4.3: Điều kiện tiến hành khuếch đại Ara h2
Giai đoạn Điều kiện
Hoạt hóa UNG 50oC/ 2 phút Hoạt hóa polymerase 95oC / 2 phút PCR (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
(55 chu kì)
Biến tính 95oC/ 30 giây Gắn mồi 620C / 1 phút Kéo dài 700C/ 30 giây
4.4.6. Ứng dụng phương pháp PCR real time phân tích Gly m1
Chuẩn bị dịch trích protein đậu nành:
Chuẩn bị tương tự như trong phương pháp Elisa Trích ly DNA
Mẫu được thủy phân 30 phút trong bằng proteinase K. Sau đó ta lọc dung dịch qua màng silica.
Tiếp theo phần dung dịch sau lọc được đem đi ly tâm, thu được DNA được làm sạch một phần. DNA được rửa lại bằng dung dịch đệm rổi đem đi ly tâm.
Chuẩn bị đoạn mồi
Đoạn mồi xuôi (F): 5’-GCC CTC TAC TCC ACC CCC ATC C-3’
Đoạn mồi ngược (R): 5’-GCC CAT CTG CAA GCC TTT TTG TG-3’ [] pcr for soy
Chuẩn bị hỗn hợp
Ta chuẩn bị hỗn hơp gồm các thành phần như sau
− 2µL dịch trích DNA
− 36.6 µL nước cất hai lần
− 5µL dung dịch đệm GeneAmp PCR gồm 500mM KCl, 100mM Tris- HCl (pH 8.3), 15mM MgCl và 0.01% w/v gelatin
− 2 µL mỗi primer ( nồng độ 10 µM )
− 2 µL dung dịch dNTP (5 mM)
− 0.4 µL AmliTag DNA polymerase (5U/µL)
− 5µL uracil-N-glycosylase (UNG, 1u/µL)
Điều kiện tiến hành
Ta chỉnh thông số theo chế độ nhiệt như sau
Bảng 4.4: Điều kiện tiến hành khuếch đại Ara h2
Giai đoạn Điều kiện
Hoạt hóa UNG 50oC/ 2 phút Họat hóa polymerase 95oC / 2 phút PCR
(55 chu kì)
Biến tính 95oC/ 20 giây Gắn mồi 600C / 30 giây Kéo dài 720C/ 60 giây
Chương 5