Phương pháp lai phân tử

ỨNG DỤNG VÀO THỰC TẾKẾT LUẬN CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN PHÉP LAI PHÂN TỬ NỘI DUNG... Thường protein-sử dụng Antibody protein có gắn phóng xạ hoặc gắn lưu huỳnh để phát hiện protein M

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HỒ CHÍ MINH

GVBM : NGUYỄN THỊ MỸ LỆ

SVTH: NHÓM 12PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

ỨNG DỤNG VÀO THỰC TẾ

KẾT LUẬN

CÁC PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN

PHÉP LAI PHÂN TỬ NỘI

DUNG

*Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá nhiệt độ nóng chảy thì hai mạch sẽ tách rời nhau

do sự phá vỡ liên kết H giữa 2 mạch.

*Sau khi 2 mạch tách rời nhau, nếu nhiệt độ phản ứng đươc làm giảm xuống từ từ cùng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại Và hiện tượng này gọi là sự lai phân tử.

Đ NH  Ị

NGHĨA

+ Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy

ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung với nhau.

+ Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay DNA-RNA

ĐẶC ĐIỂM

LAI TẠI

CHỖ

LAI TRONG PHA RẮN

LAI TRONG PHA LỎNG CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

Ph ng  Phân ti ch đinh l ươ ́ ̣ ượ ng ca c phân t  lai: ́ ử

pha p  ́

du ng  ̀ quang  phô kế ̉

Ph ng  ươ pha p  ́

du ng  ̀ Nuclease 

S1

Ph ng  ươ pha p să c ki   ́ ́ ́

trên  hydroxylapati

te

t ng  ng v i s   ươ ư ́ ơ ́ ự

tăng sô  l ng ca c  ́ ượ ́

phân t  mach đôi  ử ̣

chuyên tha nh mach  ̉ ̀ ̣

đ n ơ

Dung dich phan  ng  ̣ ̉ ư ́ lai đ c tri ch ra môt  ượ ́ ̣ phâ n, đem x  ly  v i  ̀ ử ́ ơ ́ Nuclease S1. Ca c  ́

mach đ n đê u se  bi  ̣ ơ ̀ ̃ ̣ thuy giai, s n ph m  ̉ ̉ ả ẩ

c a ph n  ng là  ủ ả ứ oligonucleotides ho c  ặ nho m nucleotide 5'  ́ phosphoryl

Ki  thuât na y s   ̃ ̣ ̀ ử

dung  ̣

đê lai v i DNA, RNA  ̉ ơ ́ hoăc v i ca c protein  ̣ ơ ́ ́  trong ca c tê  ba o  ́ ́ ̀

ở

ma  không câ n ta ch  ̀ ̀ ́ chiê t ́

 nô ng đô muô i cao,  ̀ ́

chi nh ng nucleic  ̉ ư ̃ mach đôi m i gă n  ̣ ơ ́ ́

va o gia  thê,phâ n  ̀ ́ ̉ ̀ nucleic không gă n  ́

va o gia  thê se  đ c  ̀ ́ ̉ ̃ ượ thu nhân.   ̣

ỨNG DỤNG

 Ti nh ti lê % ca c tri nh t  giô ng  ́ ̉ ̣ ́ ̀ ự ́

nhau   hai loa i gâ n nhau ở ̀ ̀

+DNA co  nguô n gô c t  hai loa i gâ n  ́ ̀ ́ ư ̀ ̀ ̀

nhau, co  thê lai đ c v i nhau. Đê  ́ ̉ ượ ơ ́ ̉

tra nh s  ta i bă t căp gi a 2 mach  ́ ự ́ ́ ̣ ư ̃ ̣

cua cu ng môt phân t  ban đâ u, DNA  ̉ ̀ ̣ ử ̀

cua 2 loa i phai co  nô ng đô râ t kha c  ̉ ̀ ̉ ́ ̀ ̣ ́ ́

nhau.

+Ty lê % ca c phân t  lai co  thê đ c  ̉ ̣ ́ ử ́ ̉ ượ

xem nh  t ng  ng v i ty lê % ca c  ư ươ ư ́ ơ ́ ̉ ̣ ́

tri nh t  giô ng nhau gi a 2 loa i đo   ̀ ự ́ ư ̃ ̀ ́

Ty lê ca ng cao thi  2 loa i ca ng gâ n  ̉ ̣ ̀ ̀ ̀ ̀ ̀

nhau trong cây tiê n hoa ́ ́

 Phân ti ch ca c tri nh t  lăp lai ́ ́ ̀ ự ̣ ̣

+Trong 1 dung dich DNA, môt tri nh  ̣ ̣ ̀

t  lăp lai nhiê u lâ n se  co  nhiê u c   ự ̣ ̣ ̀ ̀ ̃ ́ ̀ ơ

may găp mach bô sung h n so v i môt  ̣ ̣ ̉ ơ ơ ́ ̣

tri nh t  duy nhâ t ̀ ự ́

 So sa nh ki ch th ́ ́ ươ ́ c ca c bô gen  ́ ̣

không ch a tri nh t  lăp lai ư ́ ̀ ự ̣ ̣

Dot (SLot)  blot.

LAI  TRÊN  PHA 

R N Ắ

MỤC ĐÍCH: Phương pháp này dùng để định vị những trình

tự đặc biệt trên DNA bộ gen, hay những DNA kích thước nhỏ

Southe

rn blot

blot

Mục đích:

Nhằm xác định kích thước và hàm lượng của một RNA thông tin cụ thể (mRNA

blot.

Là quá trình protein kết hợp đặc hiệu với nhau Thường

protein-sử dụng Antibody protein có gắn phóng

xạ hoặc gắn lưu huỳnh

để phát hiện protein

Mục đích: là phương pháp dùng để phát hiện protein

Southern blot Northern blot Western blot.

Trích DNA từ tế bào Trích RNA từ tế bào Trích protein từ tế bào

Cắt với enzyme giới hạn Làm biến tính với

formaldehyde Làm biến tính SDS

Chạy trên gel (dùng

agarose) Chạy trên gel (dùng agarose) Chạy trên gel (dùng polyacrylamide)

Chuyển lên màng nitrocellulose( thường di chạy điện di)

Tắc nghẽn với DNA dư Tắc nghẽn với RNA dư Tắc nghẽn với protein dư

Lai với mẫu dò DNA được

đánh dấu Lai với mẫu dò DNA được đánh dấu Lai với mẫu dò kháng thể được đánh dấu

ĐIỂM KHÁC NHAU CỦA 3 PHƯƠNG PHÁP

Southern blot Northern blot Western blot.

Rửa sạch khỏi mẫu dò

chưa được liên kết ( dưới

sự kiểm soát nghiêm ngặt)

Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên kết ( dưới

sự kiểm soát nghiêm ngặt)

Rửa sạch khỏi mẫu dò chưa được liên kết

ca c gen  c chê  qua  ́ ứ ́ ́tri nh ung th  khi so ̀ ư

hi n kháng th  ch ng ệ ể ốHIV trong m t m u ộ ẫhuy t thanh c a con ế ủ

ng i. ườ+Western blot cũng có 

th  đ c s  d ng nh  ể ượ ử ụ ư

m t th  nghi m xác ộ ử ệminh v  nhi m viêm ề ễgan B

+M t Western blot ộcũng đ c s  d ng nh  ượ ử ụ ư

ki m tra xác đ nh cho ể ị

b nh não   bò ệ ở

Lai trên khuẩn lạc.

Lai trên tế bào và mô.

LAI TRÊN  NST

Các NST ở giai đoạn trung kì được xử

lí bằng các kỹ thuật tế bào học trên

lame.

NST cố định trên lame được đem lai

với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ.

Để phát hiện phân tử lai, người ta sẽ

phủ lên lame một huyền dịch

(emulsion) nhạy cảm với tia xạ

Sau một thời gian cho tia xạ tác động lên

huyền dịch Lame được quan sát dưới

kính hiển vi, kết quả thể hiện thành những

hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị

trí có phân tử lai.

LAI TRÊN KHUẨN LẠC

 Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai.

 Màng lai sẽ được xử lí bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khuẩn

MỤC ĐÍCH:

Trong tế bào và mô, các RNA, đặc

biệt là các mRNA có sự phân bố

không gian xác định Sự phân bố

không gian này liên quan đến chức

năng điều hòa cũng như tương tác

giữa mRNA với các thành phần

khác của tế bào và mô Để nghiên

cứu trên mRNA đã tách chiết và

tinh sạch không cho phép thu nhận

các thông tin vừa kể, người ta

dùng phương pháp lai trên tế bào

và mô.

Mô được xử lí bằng phương pháp mô học (cố định, khử nước ; tẩm parafin, cắt thành những lát mỏng từ 7 đến 10 micromet trải trên lame) Kết quả được đọc trực tiếp trên lame nhờ kính hiển vi.

LAI TRÊN TẾ BÀO VÀ MÔ

mRNA và protein của nó, từ đó xác định được mối tương quan giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen.

 Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần như đồng nhất) với nhiều mẫu dò khác nhau, người ta có thể xác định vị trí, sự phân

bố và tương tác giữa các mRNA cùng tham gia vào một quá trình sống.

1) Chăn nuôi

Trong ngành thuỷ sản, phương pháp lai tại chỗ thường dùng để chẩn đoán bệnh của virut đốm trắng của tôm.

- Virus đốm trắng thuộc họ Nimaviridae, giống Whispovirus, có tên

khoa học Systemic Ectodermal and Mesodorma Baculoviras (SEMBV)

- Là một trong những virus được xếp vào nhóm gây chết cấp tính trên tôm nuôi

ỨNG DỤNG VÀO THỰC TẾ

2) Trong thực phẩm :

Dùng để kiểm tra thực phẩm biến đổi gen.

    Thực phẩm biến đổi gen (GMF - Genetically Modified Foods) là thực

phẩm mà bản thân chúng được tạo ra từ các cơ thể sinh vật mang các gen tái tổ hợp được chuyển vào một cách nhân tạo nhằm phục vụ một số lợi ích kinh tế.

THỰC PHẨM BIẾN ĐỔI GEN

Thực phẩm biến đổi gen ???

XÁC ĐỊNH BIỂU HIỆN GEN

Biểu hiện gen có ý nghĩa quan trọng, là mục đích của chuyển gen Nếu gen được đưa vào genome mà không được biểu hiện thì coi như không có giá trị.

Quá trình biểu hiện gen được thể hiện qua 2 giai đoạn:

 Phiên mã từ DNA sang mRNA

 Dịch mã từ mRNA tổng hợp các phân tử protein thông qua bộ máy ribosome

Và để xác định sự có mặt của sản phẩm phiên mã

có thể thực hiện phép lai Northern hoặc lai tại chỗ Còn muốn đánh giá sự có mặt của protein do gen chuyển tạo ra có thể thực hiện phép lai Western

hoặc ELISA.

 LAI TẠI CHỖ

Mục đích: xác định gen chuyển

trong các bộ phận khác nhau của

cây chuyển gen

Thực hiện:lai giữa một đoạn đơn

đánh dấu bổ sung với trình tự

Kết quả: xuất hiện mẫu gen chọn

lọc trên mẫu mô, chứng tỏ gen

chuyển đã được biểu hiện.

 LAI WESTERN

Mục đích: phát hiện protein dựa trên phản ứng miễn dịch giữa kháng nguyên (là sản phẩm protein cần tìm) và kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên đó.

Quá trình hiển thị sản phẩm lai có thể được thực hiện thông qua phản ứng tạo màu với phosphatase kiềm hay hiện phim thông qua phản ứng

dạ quang ECL.

 Công nghệ lai phân tử hiện nay có rất nhiều ứng dụng quan trọng và được phổ biến rộng rãi như ứng dụng trong dược phẩm, nông nghiệp, các vật nuôi đã biến đổi di truyền Góp phần nâng cao chất lượng cuộc sống.

 Ngoài ra thì kỹ thuật này đã góp phần không nhỏ vào lĩnh vực xét nghiệm y khoa, và đang được dùng để kiểm

tra các khiếm khuyết di truyền ở người Đây cũng

chính là 1 bước ngoặc mới cho ngành công nghệ vi sinh