CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì 2 mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hidro nối liền 2 mạch.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC BÀI BÁO CÁO CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ NHÓM THỰC HIỆN: • LÊ THỊ THÚY DUNG • PHẠM MINH DUY • DƯƠNG NGỌC KIỀU THI • HỒ NAM VIỆT Thành phố Hồ Chí Minh Tháng 05/2008 1 CÁC PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ I. CƠ SỞ CỦA SỰ LAI PHÂN TỬ: 1. Khái niệm về “nhiệt độ nóng chảy” của DNA: Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt độ nóng chảy” (Tm) thì 2 mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hidro nối liền 2 mạch. Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xảy ra đột ngột sau khi nhiệt độ dao động rất ít xung quanh Tm, do tính “cộng hưởng” của pjản ứng. Hiện tượng “cộng hưởng” này giống như trên một dây kéo, khi ta tác động một lực kéo dưới một ngưỡng nhất định thì hoàn toàn không có tác dụng. Nhưng nếu lực kéo đủ mạnh để làm bật chỉ một nút nhỏ thì toàn bộ dây kéo sẽ bung ra mà không cần thêm một lực tác động nào. Hình 1_đường cong Tm. Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn được xác định dễ dàng thông qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260nm. (h.1.1). Giá trị mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có 2 Mạch đôi tên gọi là “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect). Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong phân tử DNA mạch đôi, các base (thành phần hấp thu ánh sáng ở bước sóng 260nm) nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song; cấu trúc đó che lấp 1 phần các base khiến chúng không hấp thu ánh sáng như những đơn vị toàn vẹn, khác với ở DNA mạch đơn. 2. Các nhân tố ảnh hưởng đến “nhiệt độ nóng chảy” của DNA: Hai mạch đôi của phân tử DNA bắt cặp với nhau nhờ các liên kết hidro. Sự tách rời 2 mạch tương ứng với sự phá vỡ các liên kết ấy. Do đó, số lượng các liên kết và yếu tố làm thay đổi tính ổn định của chúng sẽ làm thay đổi “nhiệt độ nóng chảy” của phân tử DNA. a. Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA: Do số lượng các liên kết hidro giữa A và T, G và C không bằng nhau (A=T; G C) nên thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có ảnh hưởng rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt là tỷ lệ các base G,C. Trong điều kiện chuẩn , Tm được đánh giá bằng công thức sau: Tm = 69,3 + 0,41 (% G+C) b. Ảnh hưởng của độ dài DNA: Đọan DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hidro nối 2 mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng càng cao. Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính theo công thức sau: ∆Tm = -500/số lượng cặp base Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối với những đoạn DNA ngắn. Điều này chính là kết quả của tính “hợp tác” đã đề cập ở phần trên. c. Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch (các mismatch): Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) sẽ làm giảm tính ổn định của 1 phân tử lai. Thông thường người ta ước lượng Tm giảm 1 0 C cho mỗi 1% phần trăm bắt cặp sai lệch. Nhưng cũng như thành phần các base, các mismatch chỉ có ý nghĩa thực tiễn đối với các đoạn DNA ngắn. 3 d. Ảnh hưởng của môi trường phản ứng: - Ảnh hưởng của nồng độ muối: Sự giảm lực ion ( nồng độ muồi) của môi trường sẽ làm giảm rất mạnh: nhiệt độ nóng chảy” .Tm sẽ giảm khỏang 15 0 C cho mỗi logarithm nồng độ đối với các ion hóa trị I. Các cation hóa trị II còn có tác động mạnh hơn. Như vậy, một dung dịch càng loãng thì càng làm mất ổn định chuỗi xoắn kép của DNA. - Ảnh hưởng của Formamide: Hóa chất này có khả năng hạ thấp Tm rất nhiều. Đối với những đoạn dài hơn 100 cặp nucleotide, sự giảm Tm có thể được ước lượng theo công thức sau: ∆Tm = - 0,6 x (% formamide) Formamide được sử dụng trong các phương pháp lai phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai. Nồng độ thong dụng là 50% tương ứng với việc hạ Tm xuống 30 0 C. Trong thực tế, cần lưu tâm đến tất cả các chỉ tiêu nêu trên khi tính toán Tm. Công thức thực nghiệm sau cho phép tập hợp mọi yếu tố để ước lượng Tm: Tm = 16,6 log [M] + 0,41 (%GC) + 81,5 - %mismatch - 675/chiều dài (cặp base) – 0,65 (% formamide). Công thức này đúng cho những đọan DNA ngắn hơn 100 cặp nucleotide; trrong đó [M] biểu thị nồng độ ion Na + . II. KHÁI NIỆM VỀ LAI PHÂN TỬ: 1. Khái niệm về lai phân tử: Sau khi 2 phân tử của mạch DNA tách rời nhau dưới tác động của Tm, sự bắt cặp trở lại sẽ không xảy ra nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột; lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới 1 cấu hình không gian vô trật tự. Ngược lại, nếu sau khi 2 mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, 2 mạch sẽ bắt cặp trở lại. Hiện tượng này gọi là sự lai phân tử (molecular hybridization), với 2 đặc điểm sau: 4 - Đặc hiệu tuyệt đối : Sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa 2 trình tự hoàn toàn bổ sung dẫu chúng chỉ có 2 bản sao nằm lẫn giữa hàng triệu trình tự khác. - Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA , dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA_DNA, RNA_RNA, hay các pân tử lai DNA_RNA. Hình 2a_Sự lai giữa DNA và RNA. Hình 2b_Quá trình lai DNA với DNA, lai DNA với RNA. 2. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự lai phân tử: a. Nồng độ DNA và thời gian phản ứng: Để sự tái bắt cặp giữa 2 mạch đơn xảy ra, các trình tự bổ sung phải tiến đến gần và ở vị trí đối diện nhau. Như vậy, tần số gặp gỡ giữa 2 trình tự bổ sung sẽ quyết định quá trình tái bắt cặp. 5 Ở 1 nhiệt độ xác định, 2 chỉ tiêu ảnh hưởng đến tần số gặp gỡ là nồng độ DNA và thời gian phản ứng. Nồng độ DNA nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất chúng tiếp xúc với nhau càng tăng, kết quả là tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên. Tương tự, thời gian phản ứng càng dài thì xác suất trên càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp (lai). Hai thông số nói trên thường được xem xét đồng thời; tích số giữa nồng độ và thời gian được gọi là Cot (C: concentration_nồng độ; t: time_thời gian). Cot 1/2 là giá trị tại đó có 50% số phân tử lai. b. Nhiệt độ: Tốc độ phhản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ. Thông thường phản ứng lai cực đại ở nhiệt đố thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25%. c. Độ dài của các trình tự : Tốc độ lai tăng tỷ lệ thuận với căn bậc 2 của độ dài các trình tự bổ sung. d.Lực ion: Nồng độ NACl 1M làm tằng tốc độ phản ứng lên từ 5 đến 10 lần. Nồng độ NaCl vượt quá 1,2M lại hoàn toàn không còn tác dụng.  Một vấn đề quan trọng trong lai phân tử là tạo một đầu dò có đánh dấu phóng xạ. Thông thường người ta sử dụng đầu dò DNA bổ sung (cDNA). - Sử dụng cDNA tổng hợp từ mRNA có một số ưu điểm: 1. Việc phân lập mẫu mRNA chuẩn dễ dàng hơn so với phân lập mẫu gene DNA chuẩn cũng như tổng hợp đoạn primer và phân lập cDNA sau khi tổng hợp dễ hơn. 6 2. cDNA có thể lai với cả RNA và DNA mã hóa nên RNA đó, rất hữu hiệu trong phát hiện một lượng rất nhỏ RNA đặc hiệu. Hình 3_các bước chuẩn bị cDNA. Phương pháp chuẩn bị đoạn cDNA.  Hầu hết mRNA chứa một chuỗi AAAA ở đuôi 3’, do đó chỉ cần tổng hợp đoạn primer chứa khoảng 15 T và cho bắt cặp với đầu 3’ của mRNA. Enzyme phiên mã ngược sau đó sẽ phiên mã một sợi DNA bổ sung từ đoạn primer TTTT này. Đoạn cDNA có thể được phân lập bằng cách nâng pH của dd, nhờ đó tách mạch lai và dùng enzyme phân hủy RNA. III. CÁC KIỂU LAI PHÂN TỬ: Các phương pháp lai phân tử rất đa dạng, tạm thời có thể chia chúng thành 3 nhóm lớn: - Lai trên pha lỏng. - Lai trên pha rắn. - Lai tại chỗ ( in situ hybridization). 1. Lai trong pha lỏng: a. Nguyên tắc: Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm trong môi trường lỏng là một dung dịch đệm. Sự lai phân tử xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn Tm ít nhất vài độ. Trong thực tế, nhiệt độ lai được chọn thấp hơn Tm khoảng 15 0 C; hơn nữa, người ta còn thêm formamide để làm giảm nhiệt độ lai. Đối với 7 những trình tự ngắn, nhiệt độ lai được tính theo những công thức nêu ở phần trên, đối với các trình tự dài, nhiệt độ lai thông dụng là 42 0 C. b. Phân tích định lượng các phân tử lai: Ba phương pháp thường được sử dụng là: 1. Phương pháp dùng quang phổ kế: Như đã đề cập ở phần trên, DNA mạch đôi hấp thu ánh sáng yếu hơn DNA mạch đơn. Do đó, trong phản ứng lai, sự giảm OD 260nm tương ứng với sự tăng số lượng các phân tử lai ( do sự tái bắt cặp giữa 2 mạch đơn bổ sung). Các giá trị OD được đo với 1 quang phổ kế trong đó cuvet đựng mẫu đo có bộ phận điều chỉnh nhiệt độ. 2. Phương pháp sử dụng Nuclease S1: Nuclease S1 là 1 enzyme có khả năng thủy giải các nucleic acid mạch đơn bất kể là DNA hay RNA trong một số điều kiện thực nghiệm. Dung dịch phản ứng lai được trích ra 1 phần, đem xử lý với Nuclease S1. Các mạch đơn đều sẽ bị thủy giải, các nucleic acid còn lại tương ứng với các phân tử lai. Chúng được thu nhận qua phương pháp tủa rồi được đem định lượng. 3. Phương pháp sắc kí trên hydroxylapatite: Hydroxylapatite là những tinh thể phosphate calci. Ở nồng độ muối cao, chỉ những nucleic mạch đôi mới gắn vào giá thể này, phần nucleic kkhông gắn vào giá thể sẽ được thu nhận. Sau đó, nếu tăng nồng độ phosphate lên, các nucleic acid đã gắn sẽ tách rời giá thể và được thu nhận riêng. Số lượng DNA gắn (mạch đôi) và không gắn vào giá thể (mạch đơn) được xác định bằng quang phổ kế; từ đó tính được % tỉ lệ phân tử lai. c. Các ứng dụng của phương pháp lai trong pha lỏng: 8 1.Tính tỉ lệ % các trình tự giống nhau ở 2 loài gần nhau: nếu không hiện diện với số lượng quá lớn, các mismatch (bắt cặp sai lệch) không ngăn cản hoàn toàn quá trình lai giữa những đoạn DNA lớn. Chúng chỉ làm giảm Tm (nghĩa là làm giảm độ bền vững) của các phân tử lai. Như vậy DNA có nguồn gốc từ 2 loài gần nhau, dù không tuyệt đối giống nhau, vẫn có thể lai được với nhau. Để tránh sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng 1 phân tử ban đầu, DNA của 2 lòai phải có nồng độ rất khác nhau. Nếu phản ứng xảy ra hoàn toàn, tỷ lệ % các phân tử lai có thể được xem như tương ứng với tỷ lệ % các trình tự giống nhau giữa 2 lòai đó. Tỷ lệ càng cao thì 2 loài càng gần nhau trong cây tiến hóa. 9 Hình 3_Đường cong tái bắt cặp của DNA ở động vật có vú và E.coli. Ở prokaryote, động học của sự tái bắt cặp biểu thị dưới dạng một đường cong đơn giản; điều này cho thấy vận tốc tái bắt cặp của tất cả các trình tự trên bộ gen là như nhau nghĩa là không có trình tự nào được lặp lại. Ở Eukaryote, đó là một đường cong phức tạp bao gồm nhiều đường cong đơn giản ; điều này cho thấy có 3 lọai trình tự DNA : (1)DNA có khả năng bắt cặp tức thời (Cot<10 -3 ), tương ứng với các trình tự lặp lại rất nhiều lần, (2)DNA tái bắt cặp chậm hơn (10 -3 <Cot<10) tương ứng với các trình tự lặp lại vừa vừa, (3) DNA tái bắt cặp rất chậm (10< Cot <10 3 ) tương ứung với các trình tự duy nhất. 3. Phân tích các trình tự lặp lại : Trong 1 dd DNA, một trình tự lặo lại nhiều lần sẽ có nhiều cơ may gặp mạch bổ sung hơn so với một trình tự duy nhất. Động học tái bắt cặp của nó sẽ nhanh hơn so với trình tự duy nhất ; động học này càng lớn khi số lượng bản sao của trình tự lặp lại càng cao, như ở bộ gen của đọng vật có vú (hình 2). 4. Ứng dụng trong việc so sánh kích thước các bộ gen không chứa trình tự lặp lại : ở prokaryote, bộ gen không chứa các trình tự lặp lại nên động học lai của tất cả các trình tự là như nhau. Do đó giá trị Cot 1/2 chỉ phụ thuộc kích thước của bộ gen. Tính chất này được sử dụng để so sánh kích thước bộ gen ở các lòai sinh vật prokaryote. 2. Lai trên pha rắn : a. Nguyên tắc : lai trên pha rắn có cùng nguyên tắc với lai trên pha lỏng. Điểm khác biệt ở đây là 1 trong 2 trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, trình tự cần tìm) được cố định trên 1 giá thể rắn. thuận lợi của việc sử dụng giá thể rắn là dễ dàng trong thao tác và trong việv tách các trìng tự không lai ra khỏi các phân tử lai, mặt khác còn ngăn sự tái bắt cặp giữa 2 mạch của cùng 1 phân tử. Bù lại, việc 10 [...].. .phân tích và định lượng các phân tử lai sau đó kém chính xác và hiệu quả lai thấp Mặt khác, vận tốc lai trên pha rắn kém gấp 10 lần vận tốc lai trên pha lỏng do một phần các nucleic trên giá thể bị che khuất, không tiếp xúc được với các trình tự bổ sung b Các yếu tố kỹ thuật quan trọng trong phương pháp lai trên pha rắn : giá thể rắn dùng để cố định nucleic acid là các màng lai Có 2 loại màng lai. .. thu nhận các thông tin vừa kể Trong trường hợp đó, người ta thường sử dụng phương pháp lai trên tế bào và mô Mô được xử lí bằng phương pháp mô học (cố định, khử nước ; tẩm parafin, cắt thành những lát mỏng (7 đến 10 micromet), trải trên lame) RHAo tác xử lí mẫu, lai và phá hiện các phân tử lai giống như phương pháp lai trên NST Kết quả được đọc trực tiếp trên lame nhờ kính hiển vi Phương pháp này thường... dụng của các phương pháp lai trên pha rắn : trong rất nhiều ứng dụng của các phương pháp lai trên pha rắn, có 3 phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất : phương pháp Southern blot, Northern blot và Dot (SLot) blot 1 SOUTHERN BLOT : - Mục đích : Phương pháp này dùng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ gen, hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid, phage,… - Cơ sở của phương pháp là kỹ thuật... nhảy vọt rất lớn cho các phương pháp lai tại chỗ, đặc biệt là cho phép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác nhau do các mẫu dò được đánh dấu bằng các hóa chất cho nhiều màu khác nhau IV KẾT LUẬN CHUNG VỀ TẦM QUAN TRỌNG: 1 Lai xuyên loài 2 So sánh kích thước các bộ gen không chứa các trình tự lặp lại 3 Lập bản đồ giới hạn của 1 gen, phát hiện các đột biến 4 Tìm hiểu sự phân bố của mRNA, ảnh... Phương phá này có thể sử dụng cho RNA Trong phương pháp này người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên màng mà đặt trực tiếp 1 lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành 1 điểm_Dot hay 1 khe_Slot) Quá trình lai và phân tách phâan tử lai giống như đề cập ở phần trên Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươ 5c phân tích bằng kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu Trong thục nghiệm, người... quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng 4 Cuối cùng, người ta dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị các phân tử lai Người ta sẽ đặt một phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai, các mẫu dò được đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim và kết quả được thể hiện qua các chấm đen trên phim Hình 4_Sơ đồ lai Southern... màng lai 3 Lai tại chỗ : 15 a Định nghĩa : Lai tại chỗ là 1 kiểu lai phân tử trong đó trình tự nuclic acid cần tìm (trình tự đích) nằm ngay trong tế bào hay trong mô b Nguyên tắc : Nghiên cứu acid nucleic mà không cần qua giai đọan tách chiết chúng tế khỏi mô hay tế bào c Ứng dụng đa dạng : - Định vị gen trên NST - Nghiên cứu 1 mRNA riêng biệt trong tế bào và mô d Các phương pháp lai tại chỗ : 1 LAI. .. màng lai bằng nitrocellulose_là loại giá thể được sử dụng đầu tiên, hiện nay không còn thông dụng do 2 nhược điểm : - độ bền cơ học kém nên khó thao tác - không thể tách rời các phân tử lai trên màng để lai trở lại với một mẫu dò khác (2) màng lai bằng nylon : có độ bền cơ học cao và cho phép lai nhiều lần với nhiều mẫu dò khác nhau (cần lọai bỏ mẫu dò cũ trước khi lai với mẫu dò mới) c Ứng dụng của các. .. khi các khuẩn lạc (colony) đạt kích thước nhất định, người ta thu lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp một màng lai lên mặt thạch Hình 8_Sơ đồ lai trên khuẩn lạc 17 Mỗi khuẩn lạc sẽ để lại vài tế bào vi khuẩn trên màng lai ; màng lai sau đó sẽ được xử lí bằng NaOH để làm vỡ tế bào vi khẩn và làm biến tính DNA Việc cố định DNA trên màng và thao tác lai diễn biến theo cá bước tương tự như ở các phương pháp. .. mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Để phát hiện phân tử lai, người ta sẽ phủ lên lame 1 huyền dịch (emulsion) nhạy cảm với tia xạ SAu 1 thời gian cho tia xạ tác động lên huyền dịch Lame được quan sát dưới kính hiển vi, kết quả thể hiện thành những hạt nằm trong lớp huyền dịch ngay trên vị trí có phân tử lai 16 Hình 7 _lai trên NST 2 LAI TRÊN KHUẨN LẠC : - Mục đích : phương [háp này được sử dụng để phát hiện