Tiểu luận môn Sinh Học Phân Tử PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ TRÊN GIÁ RẮN

Phần A – Đặt vấn đềTrong vài thập kỷ qua nhân loại đã trải qua cuộc cách mạng sinh học, những vấn đề sinh học phân tử các quá trình lưu trữ, truyền đạt và biểu hiện thông tin di truyền ở

ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ KHOA SINH HỌC

BÀI TIỂU LUẬN

BỘ MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ

Đề tài:

PHƯƠNG PHÁP LAI PHÂN TỬ

TRÊN GIÁ RẮN

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc

Học viên thực hiện : Nguyễn Thị Thiên Hương

Huế, 01/2014

Phần A – Đặt vấn đề

Trong vài thập kỷ qua nhân loại đã trải qua cuộc cách mạng sinh học, những vấn

đề sinh học phân tử (các quá trình lưu trữ, truyền đạt và biểu hiện thông tin di truyền ở mức độ phân tử) là một bộ phận trong cuộc cách mạng đó Các kiến thức của sinh học phân tử cho phép giải thích được mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của các đại phân tử sinh học cũng như sự vận hành và kiểm soát các quá trình sinh hóa trong tế bào Trọng tâm của sinh học phân tử là việc nghiên cứu các đại phân tử như ADN, ARN và Protein cùng các quá trình tái bản, phiên mã và dịch mã Trong số những tiến

bộ của khoa học kĩ thuật có thể kể đến phương pháp lai phân tử Kỹ thuật này được

sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, chuẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống Đặt biệt là phương pháp lai phân tử trên giá thể rắn Các áp dụng của nó hiện nay trong nhiều lãnh vực đã và đang làm được những kết quả thật sự kỳ diệu, đã làm cho các công trình nghiên cứu sinh học phân tử trở nên nhẹ nhàng và dễ dàng hơn gấp nhiều lần so với trước kia Vậy phương pháp lai phân tử nói chung và lai phân tử trên giá thể rắn nói riêng có đặc điểm gì, ứng dụng như thế nào? Với mục đích tìm hiểu để có cái nhìn tổng quan nhất về kỹ thuật này, tôi chọn đề tài nghiên cứu là: "Phương pháp lai phân tử trên giá thể rắn"

Phần B – Nội dung

1.Khái niệm phương pháp lai phân tử

1.1.Khái niệm

Hai mạch đơn của phân tử DNA gắn với nhau nhờ các liên kết hydro Khi đun nóng DNA từ từ, vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm), các liên kết hydro giữa hai mạch bị phá vỡ, hai mạch sẽ tách rời nhau Nếu nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột thì sự bắt cặp sẽ không xảy ra Lúc đó phân tử DNA sẽ tồn tại trong môi trường ở dạng mạch đơn dưới một cấu hình vô trật tự Ngược lại, nếu sau khi hai mạch tách rời, nhiệt độ được làm giảm từ từ cộng với điều kiện thích hợp, chúng sẽ bắt cặp trở lại Hiện tượng này được gọi là lai phân tử (molecular hybridization)

1.2.Cơ sở khoa học

Khi một phân tử DNA mạch đôi được đun lên một nhiệt độ vượt quá “nhiệt

độ nóng chảy” (Tm) thì hai mạch sẽ tách rời nhau do sự phá vỡ các liên kết hidro nối liền hai mạch

Sự chuyển từ dạng mạch đôi sang dạng mạch đơn xảy ra đột ngột sau khi nhiệt độ dao động rất ít xung quanh Tm, do tính “cộng hưởng” của phản ứng Hiện tượng “cộng hưởng” này giống như trên một dây kéo, khi ta tác động một lực kéo dưới một ngưỡng nhất định thì hoàn toàn không có tác dụng Nhưng nếu lực kéo

đủ mạnh để làm bật chỉ một nút nhỏ thì toàn bộ dây kéo sẽ bung ra mà không cần thêm một lực tác động nào Sự chuyển từ mạch đôi sang mạch đơn được xác định

rõ ràng thông qua việc đo biến động giá trị của mật độ quang (OD) ở bước sóng 260nm Giá trị của mật độ quang tăng lên khi phân tử mạch đôi chuyển thành mạch đơn, hiện tượng này có tên gọi là “hiệu ứng siêu sắc” (hyperchromic effect)

Nguyên nhân của hiện tượng này là do trong phân tử DNA mạch đôi, các base (thành phần hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260nm) nằm chồng lên nhau trên những mặt phẳng song song; cấu trúc đó che lấp một phần các base khiến chúng không hấp thụ ánh sang như những đơn vị toàn vẹn khác với ở DNA mạch đơn

Hai mạch đôi của phân tử DNA bắt cặp với nhau nhờ các phân tử hydro Sự tách rời hai mạch tương ứng với sự phá liên kết ấy Do đó, số lượng các liên kết và yếu tố làm thay đổi tính ổn định của chúng sẽ làm thay đổi “nhiệt độ nóng chảy” của phân tử DNA

Các yếu tố ảnh hưởng đến nhiệt độ nóng chảy của DNA:

Ảnh hưởng của thành phần các base trong phân tử DNA

Trong phân tử DNA, khi tăng nhiệt độ các mối liên kết A-T dễ bị đứt trước, khi nhiệt độ >900C các liên kết G-C bị đứt Do đó thành phần các base cấu tạo một DNA mạch đôi có ảnh hưởng rất quan trọng cho sự bền vững của phân tử này, đặc biệt các base G, C trong điều kiện chuẩn DNA có tỉ lệ G-C cao sẽ có điểm nóng

chảy cao, DNA có 60% G-X thì điểm nóng chảy là 950C Biểu thức thể hiện sự phụ thuộc của Tm vào thành phần các base:

Tm=69,3+0,41 (%G+C)

Ảnh hưởng của độ dài DNA

Đoạn DNA càng dài bao nhiêu thì số lượng liên kết hydro nối hai mạch càng lớn bấy nhiêu và do đó “nhiệt độ nóng chảy” cũng càng cao Sự thay đổi Tm theo chiều dài phân tử DNA được tính theo công thức sau:

Tm=-500/số lượng cặp baseρ

Công thức trên cho thấy ảnh hưởng của độ dài chỉ quan trọng đối với nhũng đoạn DNA ngắn điều này chính là kết quả của tính “hợp tác” đã đề cập ở phần trên

Ảnh hưởng của các điểm bắt cặp sai lệch

Những điểm bắt cặp sai lệch (A bắt cặp với C, G bắt cặp với T,…) sẽ làm giảm tính ổn định của một phân tử lai Thông thường người ta ước lượng Tm giảm 10C cho mỗi 1% phần trăm bắt cặp sai lệch Nhưng cũng như các thành phần các base, các mismatch chỉ có ý nghĩa thực tiễn đối với các đoạn DNA ngắn

Ảnh hưởng của môi trường phản ứng

Ảnh hưởng của nồng độ muối: Sự giảm lực ion (nồng độ muối) của môi trường sẽ làm giảm rất mạnh nhiệt độ nóng chảy Tm sẽ làm giảm khoảng 150C cho mỗi logarithm nộng độ đối với các ion hóa trị I các cation hóa trị II cón có tác động mạnh hơn Như vậy, một dung dịch càng loãng thì càng làm mất ổn định chuỗi xoắn kép của DNA

Ảnh hưởng của formamide: Hóa chất này có khả năng hạ thấp Tm rất nhiều, đối với những đoạn dài hơn 100 cặp nucleotide, sự giảm Tm có thể được ước lượng theo công thức sau:

Tm= -0.6x(%formamide)ρ

Formamide được sử dụng trong các phương pháp li phân tử nhằm làm giảm nhiệt độ lai Nồng độ thông dụng là 50% tương ứng với việc hạ nhiệt độ tương ứng tới 300C

Trong thực tế cần lưu tâm đến tất cả các chỉ tiêu nêu trên khi tính toán Tm Công thức thực nghiệm sau đây cho phép tập hợp mọi yếu tố để ước lượng Tm: Tm=16,6 log [m]+0.41(%GC)+81,5-%mismatch-675/chiều dài (cặp base)-0,65 (%formamide)

Công thức này dùng cho những đoạn DNA ngắn hơn 100 cặp nucleotide; trong đó [M] biểu thị nồng độ ion Na+

1.3.Đặc điểm của lai phân tử

Đặc hiệu tuyệt đối: sự tái bắt cặp chỉ xảy ra giữa hai trình tự hoàn toàn bổ sung với nhau dẫu chúng chỉ có hai bản sao nằm lẩn giữa hàng triệu trình tự khác Các trình tự bổ sung có thể là DNA hay RNA, dẫn đến sự hình thành các phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay các phân tử lai DNA-RNA

1.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến lai phân tử

1.4.1 Nồng độ và thời gian phản ứng.

Để sự tái bắt cặp giữa hai mach đơn xảy ra, các trình tự bổ sung phải tiến đến gần nhau Như vậy, tần số gặp gỡ giữa hai trình tự bổ sung sẽ quyết định quá trình tái bắt cặp

Ở một nhiệt độ xách định, hai chỉ tiêu ảnh hưởng đến tần số gặp gỡ là nồng

độ DNA và thời gian phản ứng

Nồng độ DNA, nghĩa là số lượng các trình tự bổ sung, càng cao thì xác suất tiếp xúc với nhau càng tăng dẫn tới làm tăng tốc độ phản ứng lai phân tử

Thời gian phản ứng càng dài thì xác suất tiếp xúc càng lớn hơn và số lượng phân tử lai tăng dần cho đến khi toàn bộ các trình tự bổ sung đều tái bắt cặp

Hai thông số trên thường được xét đồng thời; tích số giữa nồng độ và thời gian được gọi là Cot (C: concentration_nồng độ; t: time_thời gian) Cot1/2 là giá trị

mà tại đó có 50% số phân tử lai

1.4.2 Nhiệt độ.

Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc vào nhiệt độ Thông thường phản ứng lai cực đại ở nhiệt độ thấp hơn Tm của chính nucleic acid đó độ 25%

1.4.3 Độ dài của các trình tự.

Tốc độ lai tăng tỉ lệ thuận vối căn bậc hai của tốc độ dài các trình tự bổ sung

1.4.4 Lực ion.

Nồng độ NaCl 1M làm tăng tốc độ phản ứng lên từ 5-10 lần Nồng độ NaCl

>1,2 M lại hoàn toàn không còn tác dụng

1.5.Các phương pháp lai phân tử

Có nhiều phương pháp lai phân tử, tạm thời có thể chia chúng thành 3 nhóm lớn:

- Lai trên pha lỏng

- Lai trên pha rắn

- Lai tại chỗ

2.Phương pháp lai phân tử trên giá rắn (lai trên pha rắn)

2.1.Khái niệm

Là phương pháp lai phân tử được gắn trên giá thể rắn (trên màng

nitrocellulose hoặc nylon)

Nguyên tắc: một trong hai trình tự bổ sung (thường là trình tự đích, trình tự cần tìm) được cố định trên một giá thể rắn Sự lai phân tử này chỉ xảy ra khi các trình tự này gặp nhau do chuyển động nhiệt và khi nhiệt độ môi trường thấp hơn

Tm ít nhất vài độ

Trong thực tế, nhiệt độ lai được chọn thấp hơn Tm khoảng 15˚C , hơn nữa người ta còn thêm formamide để giảm nhiệt độ lai Đối với những trình tự ngắn nhiệt độ lai được tính theo như công thức ở phân trên, đối với trình tự dài, nhiệt độ lai thông dụng là 42˚C

Phương pháp này có nhiều dạng kĩ thuật, nhưng 4 kĩ thuật được sử dụng rộng rãi là Dot blot, Southern blot, Northern blot và Western blot

2.2.Kĩ thuật Dot blot

Mục đích

Dot blot (Dot tiếng Anh là vết chấm, còn được gọ là Slot blot) là một

phương pháp sinh học phân tử được sử dụng để phát hiện các phân tử sinh học Nó định lượng tương đối một RNA đặc trưng trong một hỗn hợp RNA mà không cần phải phân tách chúng ra

Cách tiến hành

- Trong phương pháp này người ta không chuyển acid nulceic từ gel lên màng mà đặt trực tiếp một lượng mẫu nhỏ lên màng lai ( thành một điểm - Dot hay một khe - Slot)

- Sau đó các phân tử được phát hiện bằng các đầu dò nucleotide hoặc kháng thể

- Bản phóng xạ tự ghi sau đó đươc phân tích bằng kỹ thuật mật độ kế cho phép ước lượng số lượng các phân tử lai có trong mẫu Trong thực nghiệm, người

ta sử dụng một dụng cụ (tên là manifold) cho phép đặt một lúc nhiều mẫu DNA hay RNA lên màng lai

Ưu và nhược điểm

Dot blot đơn giản hơn các phương pháp Southern blot, Northern blot

Phương pháp này giúp tích kiệm thời gian, bỏ bớt bước điện di gen, không cần các enzyme cắt giới hạn và quá trình thấm

Tuy nhiên phương pháp này không cung cấp thông tin về kích thước phân tử sinh học Hơn nữa, nếu hai phân tử kích cỡ khác nhau được phát hiện, nó vẫn sẽ xuất hiện như là một dấu chấm duy nhất

Do đó phương pháp này chỉ có thể xác nhận sự hiện diện hay vắng mặt của một phân tử sinh học hoặc phân tử sinh học, được phát hiện bởi các đầu dò hoặc kháng thể

Ứng dụng

Một ví dụ của việc ứng dụng Dot blot trong sinh học phân tử: Vào năm 1990, Tiến sĩ Siwo de Kloet, một cựu giáo sư di truyền học tại Đại học bang Florida, đã dùng phương pháp Dot-blot để xác định giới tính của một loạt các loài chim

Phương pháp này được chứng minh là cực kỳ đáng tin cậy, khi có thể thu thập đầy

đủ số lượng phân tử DNA di truyền

Hình 1: Phương pháp Dot blot

2.3.Kĩ thuật Southern

Mục đích

Phương pháp này dùng để định vị những trình tự đặc biệt trên DNA bộ gen, hay những DNA kích thước nhỏ như DNA plasmid, phage…

Cơ sở của phương pháp là kỹ thuật chuyển (transfer) DNA tử gel lên màng lai do Southern mô tả năm 1975

Các bước tiến hành

- Đoạn DNA phân tích, được cắt thành những đoạn có kích thước khác nhau bằng enzyme cắt giới hạn Đối với sinh vật có hệ gen phức tạp, quá trình cắt có thể tạo ra hàng triệu mảnh vỡ

- Hỗn hợp phức tạp các mảnh vỡ được đem điện di trên gel agarose, để tách các mảnh theo kích thước Nếu có một số các mảnh vỡ DNA lớn hơn 15 kb (1kb =

1000 cặp base của DNA hoặc RNA), trước khi thực hiện quá trình thấm, gel có thể được xử lý bằng một acid, ví dụ như acid HCL loãng, các mảnh DNA bị phá vỡ thành các phần nhỏ hơn, do đó cho phép chuyển giao hiệu quả hơn

- Những đoạn DNA ngắn trong gel bị biến tính bằng chất kiềm, trong dung dịch kiềm DNA sợi kép bị tách thành các DNA sợi đơn Sau đó, chúng được

chuyển vào lên màng nitrocellulose hoặc nylon bằng cách thấm Thủ tục này duy trì sự phân bố của các mảnh vỡ trong gel, tạo ra một bản sao của gel trên bộ lọc Màng tế bào sau đó được nướng trong lò chân không hoặc đun nóng ở 80°C trong

2 giờ (ở điều kiện tiêu chuẩn; sử dụng màng nitrocellulose hoặc nylon) hoặc tiếp xúc với tia cực tím (sử dụng màng nylon) để vĩnh viễn gắn DNA được chuyển trên màng tế bào

- Đem lai các DNA được cố định trên màng này với các mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Sau quá trình lai, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng

- Cuối cùng, người ta dùng kỹ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị các phân tử lai Người ta sẽ đặt một phim nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai, các mẫu dò được đánh dấu phóng xạ sẽ tác động lên phim và kết quả được thể hiện qua các chấm đen trên phim

Ứng dụng của phương pháp lai Southern

+ Lập bản đồ giới hạn của một gen

+ Phát hiện các đa dạng trình tự (fragment polymorphism) của cùng một gen

ở các chủng hay các cá thể khác nhau qua sự so sánh bản đồ giới hạn của chúng + Phát hiện các đột biến mất đoạn, đột biến điểm hay tái tổ hợp trên một gen vì chúng làm thay đổi bản đồ giới hạn

2.4.Kĩ thuật Northern

Hình 2: Sơ đồ lai southern blot

Mục đích

Nhằm xác định kích thước và hàm lượng của một RNA thông tin cụ thể (mRNA)

Các bước thực hiện

- Để chiết xuất RNA từ mô, sử dùng các tác nhân chaotropic, chẳng hạn như guanidinium isothiocyanate Các đại lý như vậy phá vỡ các tế bào và làm biến tính protein cũng như hoà tan các RNA mRNA chiếm 2-5% tổng số RNA, và để chiết xuất nó đòi hỏi một bước chọn lọc, sử dụng mRNA có đuôi poly(A)

- Các RNA được điện di trên gel agarose để phân tách theo kích thước

- Chuyển RNA lên màng lai nylon hoặc bộ lọc nitrocellulose thông qua một

hệ thống thấm bằng mao mạch hoặc chân không Theo phương pháp truyền thống,

sử dụng thấm mao mạch vì nó không cần đến các thiết bị đặc biệt Tuy nhiên, ngày nay xu hướng sử dụng thấm chân không ngày càng nhiều vì nó đem đến lợi thế về tốc độ và khả năng tái tạo

Các bộ đệm chuyển giao được sử dụng trong hệ thống thấm thường chứa formamide, vì nó làm giảm nhiệt độ ủ của sự tương tác thăm dò-RNA, do đó ngăn ngừa suy thoái RNA bởi nhiệt độ cao

- Sau khi RNA đã được chuyển giao, nó là di động thông qua mối liên kết cộng hóa trị màng bằng ánh sáng tia cực tím hoặc nhiệt Việc hình thành các mối liên kết cộng hóa trị của RNA trên màng tế bào, giúp ngăn cản axit nucleic không

bị rửa trôi trong bước xử lý tiếp theo

Đem lai RNA trên màng với mẫu dò có đánh dấu phóng xạ Điều kiện thí nghiệm có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và độ đặc hiệu của lai bao gồm: lực ion, độ nhớt, các cặp cơ sở không phù hợp và các thành phần cơ bản

- Màng được rửa sạch để loại bỏ các đầu dò không bị ràng buộc

- Các phân tử lai được phát hiện nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ghi

Ứng dụng

Phương pháp Northern blot cho phép quan sát mô hình biểu hiện gen của các

mô, cơ quan, giai đoạn phát triển, nhiễm mầm bệnh… Kĩ thuật này dùng để hiển thị sự xuất hiện quá mức các gen gây ung thư và giảm các gen ức chế quá trình ung thư khi so sánh với mô bình thường, cũng như biểu hiện sự từ chối các cơ quan khi cấy ghép Kết quả thu được khi quan sát mô hình biểu hiện gen sẽ cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào chức năng của gen đó

Phương pháp này cũng cung cấp một cái nhìn sâu sắc vào kích thước của sản phẩm, có thể thấy các mối nối thay thế sản phẩm trên cùng một gen hoặc các mẫu

có trình tự lặp đi lặp lại Một sản phẩm gen không đúng kích thước có thể do xóa

bỏ hoặc sai sót trong xử lý bản sao, bằng cách thay đổi mục tiêu thăm dò được sử dụng theo trình tự được biết đến, nó có thể xác định khu vực của RNA mất tích

2.5.Kĩ thuật Western

Hình 3: Sơ đồ thực hiện northern