Tiểu luận môn Sinh Học Phân Tử ỨNG DỤNG CỦA SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH

Y học trong thế kỷ XXI cũng có những bước tiến dài, đạt được những kết quả khả quan: Nhiều căn bệnh hiểmnghèo đã được chặn đứng, nhiều căn bệnh khác đang có triển vọng sẽ tìm ra cáchđiều

TIỂU LUẬN

TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH”

Giảng viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc

Học viên thực hiện : Nguyễn Thị Thanh Vinh

Lớp : LL&PPDH bộ môn Sinh học K22

Huế, 1/1/2014

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo – PGS.TS Nguyễn Bá Lộc đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu.

Tuy đã có nhiều cố gắng, nhưng chắc chắn tiểu luận của tôi còn có rất nhiều thiếu sót Rất mong nhận được sự góp ý của thầy giáo và các bạn trong lớp.

Xin chân thành cám ơn!

MỤC LỤC

Phần I: ĐẶT VẤN ĐỀ 3

Phần II: NỘI DUNG 4

II.1 Sinh học phân tử 4

II.1.1 Khái niệm 4

II.1.2 Các phương pháp nghiên cứu Sinh học phân tử 4

II.1.2.1 Phương pháp PCR………4

II.1.2.2 Phương pháp tách chiết axit nucleic……….8

II.1.2.3 Phương pháp biến đổi vật liệu di truyền……….12

II.2 Ứng dụng trong chẩn đoán 14

II.2.1 Xác định ADN bình thường ……….…14

II.2.2 Xác định ADN bệnh lý ……….16

Phần III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35

III.1 Kết luận 35

III.2 Đề nghị 35

Phần IV: TÀI LIỆU THAM KHẢO 36

Phần I: ĐẶT VẤN ĐỀ

Sang thế kỉ XXI, khoa học – công nghệ có những bước phát triển nhảy vọt.Nhiều công trình nghiên cứu, nhiều thành tựu mới ra đời đã đáp ứng và đảm bảonhu cầu cuộc sống cho con người ngày một tốt hơn Y học trong thế kỷ XXI cũng

có những bước tiến dài, đạt được những kết quả khả quan: Nhiều căn bệnh hiểmnghèo đã được chặn đứng, nhiều căn bệnh khác đang có triển vọng sẽ tìm ra cáchđiều trị, … Tất cả những điều đó đạt được là nhờ sự ứng dụng của ngành Sinh họcphân tử vào trong y học

Sinh học phân tử là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật hay các hiện tượngsinh học ở mức độ phân tử Cũng như nhiều ngành khoa học khác, Sinh học phân

tử trong thời gian qua cũng phát triển mạnh mẽ và những thành tựu của nó đã đượcứng dụng có hiệu quả trong các lĩnh vực khác nhau của y học, mang lại cơ hội chonhiều bệnh nhân, mở ra triển vọng về một nền y học phát triển trong tương lai.Nhận thấy được tầm quan trọng và lợi ích to lớn mà Sinh học phân tử mang lạicho y học liên quan trực tiếp đến sức khỏe và đời sống của chúng ta và nó là vấn đề

mang tính thời sự nên em chọn đề tài “Ứng dụng của Sinh học phân tử chẩn

đoán bệnh” với mong muốn mở mang kiến thức về môn học Sinh học phân tử và

cập nhật những thành tựu mới của nó trong y học

Phần II: NỘI DUNGII.1 Sinh học phân tử

II.1.1 Khái niệm

Sinh học phân tử (molecular biology) là môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật

hay các hiện tượng sinh vật ở mức độ phân tử

Mục đích của sinh học phân tử là tìm hiểu mối tương tác giữa các hệ thốngkhác nhau trong tế bào bao gồm cả mối liên hệ và tương tác giữa các phân tử DNA,RNA, quá trình tổng hợp protein cũng như tìm hiểu cơ chế điều hòa những mốitương tác này Kiến thức về các mối tương tác trong từng đối tượng tế bào, mô, cơquan, hệ cơ quan, cơ thể v.v giúp ta tìm hiểu sâu hơn về học thuyết trung tâm(central Dogma) trong di truyền học từ đó có những can thiệp thích hợp để đưa đếnnhững ứng dụng trong y dược học, nông nghiệp, công nghiệp, bảo vệ môi sinh.v.v Sinh học phân tử cũng không chỉ giúp con người nghiên cứu hình thái của sinhvật ở mức độ tinh vi hơn mà còn nghiên cứu quá trình hình thành, phát triển (về sốlượng và kích thước) của một tế bào, một cơ quan, một cá thể hay một loài cũngnhư nghiên cứu về chức năng của các quá trình đó

II.1.2 Các phương pháp nghiên cứu Sinh học phân tử

II.1.2.1 Phương pháp PCR (Polymerase chain Reaction)

II.1.2.1.1 Nguyên tắc:

Tất cả các ADN – polymerase khi tiến hành tổng hợp một đoạn ADN mới đềucần có mạch khuôn ADN và 1 đoạn mồi Mồi là đoạn ADN ngắn có khả năng bắtcặp bổ sung với 1 đầu của mạch khuôn ADN – polymerase làm nhiệm vụ nối dàimồi để hình thành mạch mới

Phương pháp PCR dựa vào đặc tính hoạt động đó của ADN – polymerase Khicung cấp 2 mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với 2 đầu của ADN ta sẽ tổng hợpđược đoạn ADN nằm giữa 2 mồi đó

* PCR thực hiện qua ba bước:

- Bước 1:

Biến tính phân tử ADN là khuôn: Để gây biến tính ADN, chuyển ADN mạchkép thành ADN mạch đơn, cần sử dụng nhiệt độ cao hơn nhiệt độ Tm phân tử,thường khoảng 92 – 950C trong thời gian khoảng 1 phút.

Ba giai đoạn trên xảy ra theo chu kì và được lặp lại nhiều lần làm cho sau mỗilần, số lượng mẫu tăng lên gấp đôi, là quá trình khuếch đại mẫu theo cấp số nhân,

cứ sau khoảng 30 chu kỳ sẽ tạo ra được 106 bản sao của mẫu ban đầu

II.1.2.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến PCR:

+ Đoạn mồi có hai vai trò chính :

(1) Quyết định nên tính đặc hiệu của thử nghiệm

(2) Khởi động men polymerase vì men polymerase chỉ có thể bắt đầu tổng hợpsợi bổ sung cho chuỗi DNA đích một khi nó nhận dạng được đầu 3', đang ở tìnhtrạng sợi đôi

Số chu kỳ cho 1 phản ứng tùy thuộc số lượng bản mẫu ban đầu Ví dụ nếu sốlượng bản mẫu là 105 thì cần 25 – 30 chu kỳ; nếu số lượng bản mẫu là 102 – 103 thì

số chu kỳ phải là 35 – 40 chu kỳ

II.1.2.1.3 Qui trình tiến hành PCR:

Phương pháp PCR

Quá trình thực hiện phương pháp PCR xảy ra theo chu kì thực hiện với cácbước cơ bản sau :

- Bước 1:

Biến tính phân tử ADN khuôn tiến hành ở 940C Trước hết tiến hành xử lý mẫu

ở 940C trong 5 phút đầu để khởi đầu quá trình Sau đó cứ đầu mỗi chu kỳ lại xử lý

940C trong 30 phút để biến tính ADN

- Bước 2 :

Kết hợp mồi vào khuôn cho các mồi vào với mẫu ADN đã biến tính rồi xử lý ởnhiệt độ 600C trong 30 phút, ở nhiệt độ này các primer srx liên kết với ADN khuôn.

- Bước 3 :

Tổng hợp 2 chuỗi ADN Cho nguyên liệu dNTP vào và xử llys ở nhiệt độ 720Ctrong 1 phút, ở nhiệt độ này quá trình tổng hợp 2 chuỗi bổ sung cho 2 chuỗi ADNkhuôn xảy ra

Sau khi kết thúc giai đoạn 3, tiếp tục quay lại chu kì với việc xử lý ở nhiệt độ

940C trong 30 giây

Mọi thao tác đều được tiến hành trong phòng vô trùng Mẫu thu được sẽ đượccất giữ ở 40C

II.1.2.2 Phương pháp tách chiết axit nucleic

II.1.2.2.1 Phương pháp tách chiết axit nucleic

* Phương pháp tách chiết ADN:

Mẫu

Cố định mẫu bằng N2 lỏng

Mẫu mất hoạt tính enzim

Nghiền với hỗn hợp phenol-Tris SDS Hỗn hợp

Lọc

Ly tâm 3000g/10' Tủa (ARN) Dịch (ADN)

* Phương pháp tách chiết ARN:

- Các bước:

+ Phá bỏ màng tế bào

+ Tách protein ra khỏi hỗn hợp bằng xử lý phenol-chlorofform và ly tâm

+ Kết tủa ARN bằng etanol rồi thu nhận qua ly tâm

- Quy trình tách chiết

Mẫu

Cố định mẫu bằng N2 lỏng

Mẫu mất hoạt tính enzim

Nghiền với hỗn hợp chất tẩy Hỗn hợp

Lọc

Dịch Bã (bỏ đi)

Phenol-chloroform Hỗn hợp

Ly tâm 3000g/10'

Dịch Tủa (bỏ đi)

Alcol 960 + Acetat Na1M

-200C-24h Hỗn hợp

Ly tâm 3000g/10'

Tủa (ARN) Dịch (bỏ đi)

II.1.2.2.2 Phương pháp phân tích thành phần axit nucleic

* Thuỷ phân axit nucleic:

- Thuỷ phân bằng kiềm

- Thuỷ phân bằng Ribonuclease

- Thuỷ phân bằng nuclease T1

- Thuỷ phân bằng photphodiesterase nọc độc rắn

- Enzim cắt hạn chế (RE)

* Phương pháp tách các nucleotit:

- Điện di:

+ Nguyên tắc của phương pháp là do: Dưới tác động của điện trường, các phân

tử ADN (thường tích điện âm) khác nhau về kích thước, điện tích, mức độ cuộnxoắn và dạng phân tử (mạch thẳng hay mạch vòng) sẽ di chuyển qua hệ mạng củagel từ cực âm (cathode) sang cực dương (anode) với tốc độ di chuyển khác nhau

Vì vậy, chúng dần dần tách nhau ra trên trường điện di, qua đó người ta có thể thuthập và phân tích được từng phân đoạn ADN hoặc gen riêng rẽ

+ Có hai loại vật liệu làm gel được sử dụng phổ biến trong điện di, đó làagarose và polyacrylamid (1) gel polyacrylamid có khả năng phân tách cao, nhưngkhoảng kích thước ADN có thể phân tích hẹp.(2) gel agarose có khả năng phân táchthấp hơn đối với các phân đoạn ADN kích thước nhỏ, nhưng rất hiệu quả khi phântách các phân đoạn ADN kích thước lớn tới hàng chục hoặc hàng trăm kb (1 kb =

1000 bp)

- Phương pháp ly tâm:

Siêu ly tâm trên một gradient liên tục CsCI Trong quá trình ly tâm dung dịchCsCI đậm đặc trong ống ly tâm sẽ tự động hình thành một gradient tỷ trọng tăngdần từ miệng đến đáy ống Dưới tác động của lực ly tâm các nucleotit di chuyểntrong ống đến vị trí có tỷ trọng bằng tỷ trọng của chính chúng sexduwngf lại Bằngcách đó các nucleotit có tỷ trọng khác nhau sẽ được tách riêng ra thành các lớpkhác nhau trong ống nghiệm

II.1.2.3 Các phương pháp biến đổi vật liệu di truyền

II.1.2.3.1 Biến đổi vật liệu di truyền

*Tạo đột biến điểm có định hướng:

- Tạo dòng trong phage M13 cho trình tự cần tạo đột bến

- Tổng hợp nhân tạo một oligo nucleotit có mang đọt biến ở vị trí mong muốn

- Lai hai thành phần trên trong điều kiện không ngiêm ngặt để có thể lai cáctrình tựu không bổ sung hoàn toàn

- Oligo nucleotit bắt cặp với trình tự A được sử dụng làm mồi cho sự tổng hợpmạch bổ sung với trình tự A nhờ ADN - polymerase

- Tách rời hai mạch rồi chuyển vào vi khuẩn các dòng vi khuẩn mang vector tái

tổ hợp đột biến sẽ được chọn lọc qua phương pháp lai

II.1.2.3.2 Chuyển gen vào tế bào nhận

- Kỹ thuật tiêm: Dùng bơm tiêm để tiêm dung dịch chứa ADN vào tế bào

- Kỹ thuật bắn: Dùng máy bắn gen để bắn những viên đạn cực nhỏ có tẩmADN cần mang và trong tế bào

- Dùng thể truyền là virus: Loại một bộ gen của virus rồi gắn thay vào mộtđoạn ADN cần nghiên cứu sau đó cho virus xâm nhiễm vào tế bào đích ĐoạnADN cần gắn theo bộ gen của virus vào tế bào đích và tái tổ hợp với bộ gen của tếbào đích

II.2 Ứng dụng trong chẩn đoán bệnh

II.2.1 Xác định ADN bình thường – dấu ấn di truyền

- ADN bộ gen người của chúng ta có đến 30% chứa các trình tự base lặp lại vàhầu như không mang những mã có ý nghĩa chức năng Cũng như các trình tự base

có ý nghĩa chức năng (gọi là gen), các trình tự base lặp lại này được di truyền từcha mẹ sang con cái theo định luật phân ly độc lập của Mendel Tuy nhiên khác vớigen, rất khó tìm thấy sự khác biệt về trình tự base của gen giữa các cá nhân, cónhiều trình tự base lặp lại có thể giúp phân biệt được cá nhân này với cá nhân khác,không những thế, có thể giúp tìm xem họ có quan hệ huyết thống với nhau haykhông? Các trình tự base lặp lại này được gọi là các dấu ấn ADN Có hai loại dấu

ấn ADN hiện đang được dùng trong xét nghiệm dấu ấn ADN là: Tiểu vệ tinh và vi

vệ tinh Tuy nhiên tiểu vệ tinh là loại dấu ấn đang được sử dụng nhiều

+ Tiểu vệ tinh: Ðó là các trình tự base lõi lặp lại, gọi là các tiểu vệ tinh VNTRs(Variable Number of Tandem Repeats = Số lượng thay đổi các trình tự base lặplại), có các kích thước thay đổi từ 1.000 base (1 KB) đến 30.000 base (30 KB)

+ Các bước thực hiện:

(1) Trước hết mẫu máu được lấy từ những người cần thử nghiệm để tách đượcbạch cầu, sau đó ly trích toàn bộ bộ gen nguyên vẹn của bạch cầu trong các mẫuthử nghiệm;

(2) Cắt đoạn các bộ gen đã ly trích này bằng men cắt hạn chế, là một loại mencắt nhận diện được 4 trình tự base đặc hiệu, nhờ đó cắt đoạn được bộ gen thànhnhững mảnh ADN dài ngắn khác nhau, trong đó có những mảnh chứa các trình tựbase lặp lại;

(3) Ðiện di mẫu thử nghiệm để phân tách các đoạn ADN này trên thạchagarose, sau đó chuyển các đoạn ADN trên thạch này qua một màng nylon bằng kỹthuật thấm Southern (Southern blotting);

(4) Phát hiện vị trí các trình tự base lặp lại trên màng nylon bằng cách lai vớimột trong những dò ADN đánh dấu đồng vị phóng xạ và đặc hiệu cho các trình tựbase lặp lại này

* Mẫu để xét nghiệm: Tất cả các tế bào có nhân tức là có ADN: một giọt máu,

tinh dịch, sợi tóc

* Ứng dụng:

Dấu ấn di truyền hiện nay đang được sử dụng ngày càng rộng rãi, nó được gọi

là những tấm thẻ ADN Lần đầu tiên tại Việt Nam, các nhà khoa học Trung tâmphân tích ADN và công nghệ di truyền (Hà Nội) đã thiết kế ra thẻ ADN cánhân Hiện nay, đã có khoảng 1.500 tấm thẻ ADN ra đời (trung bình 1 tháng cókhoảng 100 người yêu cầu giám định ADN) tại Trung tâm phân tích ADN và Côngnghệ di truyền - một trong những đơn vị hàng đầu trong việc phân tích, giám địnhADN của Việt Nam Ở Việt Nam, thẻ ADN dùng để xác định đặc trưng cá thểngười, bao gồm nhận dạng và xác định huyết thống đã đạt chuẩn mực quốc tế Cụthể là đã áp dụng những công nghệ tiên tiến nhất, xác định riêng biệt từng cá thể vàxác định được tất cả các mối quan hệ huyết thống, kể cả những quan hệ phức tạp,thậm chí cách nhiều đời với độ chính xác rất cao, vì dùng tới 2 bộ gen, mỗi bộ 16

gen (mức cao nhất mà thế giới đang làm), ngoài ra còn sử dụng hơn 50 gen độc lậptrong những trường hợp cần thiết Việc Lập thẻ ADN cá nhân có thể vừa nhậnhuyết thống, vừa chữa bệnh.

II.2.2 Xác định ADN bệnh lí

Sinh học phân tử được sử dụng rộng rãi trong việc xác định bệnh lý Trong đóphương pháp PCR được ứng dụng nhiều Và phương pháp này được sử dụng trongchẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV trong ung thư cổ tử cung, phát hiện gen APCtrong ung thư đại tràng, gen BRCA 1 - BRCA 2 trong ung thư vú, gen TPMT trongbệnh bạch cầu trẻ em, gen IgH và TCRy trong u lympho không Hodgkin, gen Rb-

105 trong u nguyên bào lưới, gen NF-1,2 trong u xơ thần kinh…), nghiên cứu về hệkháng nguyên bạch cầu người (HLA, human lymphocyte antigen)…

a Nguyên tắc

Bằng kỹ thuật PCR, từ một lượng khuôn ADN rất nhỏ như: một giọt máu, mộtsợi tóc hay một tế bào… người ta có thể khuếch đại chính xác, trật tự một lượnglớn lên đến hàng triệu bản nhằm phục vụ cho các quá trình khảo sát trong phảnứng Trong công nghệ sinh học, PCR được sử dụng trong việc lập bản đồ gen, pháthiện gen, dòng hoá gen, giải mã trình tự ADN…

b Chẩn đoán viêm gan siêu vi B

* Virus viêm gan B có phần lõi của nó là ADN tức là acid nhân chứa đựng

thông tin di truyền của virus Virus viêm gan B một khi nhân bản hoàn chỉnh thì sẽ

tạo được một virus hoàn chỉnh tức là bên trong phần vỏ của nó (đó là kháng nguyên

vỏ hay kháng nguyên bề mặt HBsAg) có chứa được phần lõi HBV-DNA

* Xét nghiệm chẩn đoán HBV- DNA tức là xét nghiệm tìm xem trong máu củabệnh nhân có mang virus hoàn chỉnh hay không Đây là một xét nghiệm sinh họcphân tử Nó được thực hiển bởi phương pháp PCR

- Máu của bệnh nhân khi lấy sẽ được tách huyết tương hay huyết thanh và sau

đó phòng thí nghiệm sẽ tách chiết ADN của virus trong các mẫu huyết tương vàhuyết thanh này để đưa vào một ống nghiệm rồi nhân bản các ADN này trong ốngnghiệm thành hàng tỷ bản sao để phát hiện Nhờ nhân bản từ 1 bản gốc lên hàng tỷbản sao rồi mới phát hiện nên xét nghiệm này có độ nhạy cảm cực cao, đủ sức đểphát hiện ADN của virus có trong mẫu thử dù số lượng rất thấp

c Chẩn đoán viêm gan virus C

Ngày nay, việc ứng dụng sinh học phân tử trong chẩn đoán điều trị bệnh viêmgan do virus nói chung và bệnh viêm gan do virus C ngày càng trở nên quan trọng,chúng trở thành các chỉ định xét nghiêm bắt buộc trong điều trị viêm gan virus Cnhất là viêm gan C kháng thuốc, chúng đặc biệt hữu ích trong việc thiết lập điều trị,thay đổi điều trị, đánh giá về virus học cũng như sự kháng thuốc của virus viêmgan C

* Các kĩ thuật khuếch đại mục tiêu:

- Nguyên tắc cơ bản của các kỹ thuật khuếch đại mục tiêu là tổng hợp một sốlượng lớn bản sao của các bộ gen virus (được gọi là các sản phẩm khuếch đại PCR,LCR, amplicon)

- Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) phát hiện HCV RNA:

Phương pháp này dùng nhiều nhiệt độ khác nhau và chung một enzympolymerase chịu nhiệt Các sản phẩm khuếch đại là các ADN mạch đôi PCR được

áp dụng cho các virus ADN trực tiếp, tuy nhiên với virus ARN (như HCV) mộtbước sao chép ngược là cần thiết, để tổng hợp ADN bổ trợ dùng làm khuôn trongphản ứng PCR Khi mỗi chu kỳ PCR hoàn tất, số lượng bản sao được nhân đôi, sau

n chu kỳ 2n bản sao của mỗi phân tử ban đầu được tổng hợp về mặt lý thuyết Việcphát hiện các sản phẩm khuếch đại dựa vào phương pháp lai đặc hiệu Việc địnhlượng được dựa vào khuếch đại cạnh tranh của khuôn virus với một lượng chuẩntổng hợp thêm vào mỗi ống phản ứng.

* Các kỹ thuật khuếch đại tín hiệu:

Trong các kỹ thuật khuếch đại tín hiệu, bộ gien virus lúc đầu được lai vào mộtgiá bằng các bộ dò oligonucleotid bắt giữ đặc hiệu, sau đó tín hiệu phát ra bởi cáclai được khuếch đại và đo lường Có hai kỹ thuật hay sử dụng:

- Phương pháp bắt giữ lai (hybrid capture)

- Kỹ thuật ADN nhánh (Branched DNA technology)

* Phân tích trình tự bộ gen HCV:

Phân tích trình tự bộ gen virus nhằm vào việc xác định các trình tự ký tên (điềunày được dùng để phân loại các chủng virus theo lợi ích lâm sàng, gọi là kiểu gencủa virus) hoặc các thay thế acid amin ở các vị trí đặc biệt (điều này được dùng đểxác định các acid amin đã biết liên quan đến sự kháng thuốc) Phân tích trình tự bộgen dựa vào việc xác định trình tự trực tiếp, cung cấp toàn bộ trình tự của đoạnđược phân tích, hoặc các kỹ thuật thay thế nhận dạng các trình tự đặc hiệu ở các vịtrí cho sẵn Có hai kỹ thuật thường áp dụng:

- Xác định trình tự trực tiếp của các sản phẩm khuếch đại HCV PCR: đượcthực hiện sau phản ứng xác định trình tự trong một thiết bị xác định trình tự DNA

tự động Thiết bị có thể dùng để xác định trình tự nucleotid chính xác và trịnh tựacid amin suy ra của đoạn được phân tích Điều này được áp dụng vào việc pháthiện các loại hình đột biến

- Lai ngược của các sản phẩm khuếch đại HCV PCR: Việc xác định trình tựtrực tiếp tốn nhiều công sức và chỉ thực hiện ở viện nghiên cứu đặc biệt, do đó chođến nay có nhiều kỹ thuật mới được phát triển để áp dụng cho lâm sàng, trong đóđược ứng dụng nhiều nhất là phương pháp dựa vào lai ngược các sản phẩm khuếchđại PCR Tóm lại, với sự ra đời và cải tiến không ngừng của kỹ thuật sinh học phân