Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối liên hệgiữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệqua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và
Trang 1ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ
Trang 2Huế, 2014
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy giáo – PGS.TS Nguyễn Bá Lộc
đã tận tình giảng dạy và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu Tôi cũng xin chận thành cảm ơn các anh, chị và các bạn ở lớp sinh khóa 22 đã luôn giúp đỡ tôi trong quá trình học tập
Tôi xin chân thành cảm ơn!
Trang 3
MỤC LỤC
PHẦN I: MỞ ĐẦU 4
PHẦN II: NỘI DUNG 5
2.1 Kiểm soát sau phiên mã 5
2.1.1 Kìm hãm dịch mã liên quan đến cấu trúc vùng 5'UTR của phân tử ARNm 5
2.1.2 Độ dài của đuôi polyA ảnh hưởng tới độ bền vững của phân tử ARNm 5
2.1.3 Độ bền vững của ARNm 6
2.1.4 ARN anti-sense 7
2.1.5 Phản ứng đọc sửa ARNm - "RNA editing" 8
2.2 Biến đổi sau phiên mã 8
2.2.1 Biến đổi phân tử ARNm trong tế bào eukaryot 9
2.2.2 Gắn mũ 12
2.2.3 Thêm đuôi poly A 14
2.2.4 Phản ứng cắt intron và nối exon 15
2.2.5 Các intron có khả năng tự cắt ra khỏi phân tử ARNm-Phản ứng selfsplicing 17
2.2.6 Cấu trúc chung của phân tử ARNm 22
PHẦN III KẾT LUẬN 24
PHẦN V: TÀI LIỆU THAM KHẢO 25
Trang 4PHẦN I: MỞ ĐẦU
Sinh học phân tử là một môn khoa học nghiên cứu giới sinh vật ởmức độ phân tử Sinh học phân tử chủ yếu tập trung nghiên cứu mối liên hệgiữa các hệ thống cấu trúc khác nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệqua lại giữa quá trình tổng hợp của DNA, RNA và protein và tìm hiểu cáchthức điều hòa các mối quan hệ này Như ta đã biết một gen được xem làhoạt động khi thông tin đó được sử dụng để tạo ra sản phẩm cuối cùng làprotein hay phân tử ARN Điều đáng ghi nhớ là thông tin chỉ được phiên
mã và dịch mã theo một chiều từ ADN sang ARN đến protein Không xảy
ra hiện tượng thông tin truyền từ ADN sang thẳng protein hoặc từ proteinngược trở lại acid nucleic Việc trao đổi thông tin giữa các dạng acidnucleic (giữa ADN và ARN) có thể xảy ra thuận nghịch Ví dụ, ADN →ARN (phiên mã xuôi từ ADN sang ARN), ARN → ADN (phiên mã ngược
từ ARN sang ADN – reverse transcription), ADN → ADN (tái bản ADN),ARN → ARN (nhân bản ARN bởi ARN polymerase dựa trên khuôn ARN).Một trong những quá trình quan trọng đó là sự phiên mã Phiên mã ở sinhvật nhân sơ khác với sinh vật nhận chuẩn đó là ở sinh vật nhân chuẩn, ARNpolymerase kết hợp với một số enzyme tham gia vào quá trình chế biếnARN thông tin, điều này cho phép quá trình chế biến ARN thông tin có thểdiễn ra ngay khi khởi đầu sự phiên mã Phân tử ARN thông tin mới đầuđược tạo thành có tuổi thọ ngắn, chưa được hoặc chỉ mới xử lý một phần
được gọi là tiền ARN thông tin (pre-mRNA) đến khi hoàn thành quá trình
chế biến thì gọi là ARN thông tin trưởng thành Để tìm hiểu rõ hơn về quátrình sửa đổi ARN sau quá trình phiên mã tôi đã chọn đề tài: “ KIỂMSOÁT VÀ BIẾN ĐỔI SAU PHIÊN MÃ Ở EUCARYOT ”
Trang 5PHẦN II: NỘI DUNG
2.1 Kiểm soát sau phiên mã
2.1.1 Kìm hãm dịch mã liên quan đến cấu trúc vùng 5'UTR của phân
tử ARNm
Phân tử ARNm có các vùng 5' không dịch mã (5’ UTR – 5’ Untranslated
Region) nằm phía trước mã khởi động (AUG) và vùng 3’ không dịch mã
(3’ UTR) nằm sau mã dừng Đầu 5' không dịch mã có thể tạo cấu trúc cặptóc ngăn cản ribosome khởi động dịch mã Ngoài ra, phần 5’ UTR có thể là
vị trí tương tác của một số protein repressor Khi đó ribosome không thểdịch chuyển trên sợi ARNm khiến cho quá trình dịch mã bị kìm hãm hoàntoàn Rõ ràng trong trường hợp này, ARNm vẫn được tổng hợp một cáchbình thường nhưng protein không được tạo ra Cơ chế điều khiển quá trìnhdịch mã do protein tương tác với đầu 5' của ARNm được gọi là "kiểm soát
dịch mã tiêu cực" (negative translational control).
Ở tế bào eukaryot, kiểm soát dịch mã tiêu cực được phát hiện đối với phảnứng tổng hợp ferritin - protein làm nhiệm vụ tạo phức với các nguyên tửsắt Khi môi trường không có sắt, các phân tử ARNm ferritin bị aconitase
(protein repressor) bám vào đầu 5', do đó không có protein ferritin được
tổng hợp trong tế bào Khi có sắt trong môi truờng, aconitase liên kết vớisắt và rời khỏi ARNm ferritin Lúc này ferritin được tổng hợp với số lượnglớn gấp 100 lần so với lúc ban đầu
2.1.2 Độ dài của đuôi polyA ảnh hưởng tới độ bền vững của phân tử ARNm
Trang 6Hình 1: Độ dài đuôi polyA ảnh hưởng đến độ bền vững và quá trình dịch
mã trên phân tử ARNm Đuôi polyA có thể được thêm vào hoặc cắt ngắn
đi, nhưng độ dài của nó không được ít hơn 30 nucleotide A.
2.1.3 Độ bền vững của ARNm
Trong tế bào vi khuẩn, các phân tử ARNm thường bị phân hủy rất
nhanh Thời gian bán hủy của chúng thay đổi từ 3-5 phút ngay khi có hoặc không có các chất cảm ứng trong môi trường Do đó khi tế bào vi khuẩn mọc và phân chia trong khoảng thời gian 20-30 phút, các ARNm cần được
tái tạo mới 5-10 lần trong mỗi lần phân chia Khi tế bào yêu cầu một sốenzym, ARNm cần thiết để tổng hợp các enzym đó được phiên mã nhanh
chóng Khi tế bào không còn nhu cầu, quá trình phiên mã dừng rất nhanh
và các phân tử ARNm lập tức bị phân hủy Enzym nuclease chịu trách nhiệm phân hủy ARNm đến nay vẫn chưa được xác định rõ ràng Đối với
một số ARNm polycistronic của các operon như lac hoặc trp, chúng bị
phân cắt bởi endonuclease tạo ra các monocistronic tương ứng với từng gen trong operon Khoảng cách giữa các monocistronic không chứa mã di truyền, do đó không được che chắn bởi ribosome nên chúng dễ bị cắt bởi endonuclease Các ARNm prokaryot được tổng hợp cũng như bị phân hủy rất nhanh, do đó vi khuẩn có thể thích ứng nhanh nhạy với những thay đổi
Trang 7của môi trường Ngược lại, các ARNm eukaryote khá bền vững Ví dụ ARNm mã cho β-globin có thời gian bán hủy khoảng hơn 10h Tuy nhiên
cũng có những loại ARNm có thời gian bán hủy chỉ 30 phút hoặc ít hơn
Thường đó là những ARNm mã cho các protein làm nhiệm vụ điều khiển hoạt động của gen Các phân tử ARNm eukaryot kém bền do chúng mang các đoạn nucleotide đặc biệt tại đầu 3' kích thích sự phân hủy ARNm Thực nghiệm cho thấy khi đoạn nucleotide giàu A và U ở vùng 3' không dịch mã của phân tử ARNm kém bền được ghép vào một số ARNm bền vững khác,
thì những phân tử này trở nên kém bền do đuôi polyA bị cắt ngắn nhanh
Như vậy đoạn nucleotide giàu AU kích thích sự phân hủy ARNm thông qua việc giảm độ dài đuôi polyA Ngoài ra, một số ARNm có chứa vị trí đặc hiệu ở đầu 3' được nhận biết bởi endonuclease.
2.1.4 ARN anti-sense
Thông thường, các protein giữ vai trò chủ đạo kiểm soát quá trình phiên mãcũng như dịch mã Tuy nhiên hoạt động của một số gen lại được điều khiểnbởi các ARNs Cũng giống như các protein điều khiển, các ARNs làmnhiệm vụ kiểm soát hoạt động của gen được tổng hợp một cách độc lập vàtương tác với các vị trí đặc hiệu (các đoạn nucleotide) Xét trường hợp cụthể về vai trò điều khiển sau phiên mã của ARNs đối với việc tổng hợpprotein OmpF ở tế bào vi khuẩn E.coli Protein OmpF nằm phía ngoàimàng tế bào làm nhiệm vụ nhận biết những thay đổi về áp suất thẩm thấutrong môi trường Khi áp suất tăng thì gen điều khiển micF hoạt động mạnhhơn Sản phẩm của gen micF là phân tử ARN 174 bases, có thể tạo cặptheo nguyên tắc bổ sung với vị trí nhận biết của ribosome trên phân tửARNm của gen ompF Như vậy phân tử ARNm của micF làm nhiệm vụngăn cản việc tổng hợp protein OmpF Các phân tử ARN có chức năngtương tự micF được gọi là ARN-antisense (Hình 2)
Trang 8Hình 2: Phân tử ARN-antisense-micF kiểm soát dịch mã của phân tử ARNm -ompF Phân tử đúp ARN/ARN tạo thành khiến ribosome không
tổng hợp được protein OmpF
2.1.5 Phản ứng đọc sửa ARNm - "RNA editing"
Phản ứng đọc sửa ARNm làm thay đổi trình tự nucleotide của phân
tử ARNm Phản ứng này xảy ra trong tế bào chất Các nucleotide của một
số phân tử ARNm bị loại bỏ hoặc bị thay thế, một số nucleotide khác được thêm vào Như vậy trình tự nucleotide trên phân tử ARNm khác với gen
(ADN) mà từ đó phân tử ARNm được phiên mã Phản ứng này được phát
hiện đầu tiên đối với ARNm mã hóa cho protein ở ty thể của trypanosome Các phân tử ARNm này mang thêm một vài nucleotide U khác với trình tự trên gen ADN Các nghiên cứu tiếp theo cho thấy phân tử ARNm trong ty thể của tế bào thực vật hầu như đều trải qua phản ứng "RNA editing" Tuy nhiên đối với các ARNm này, chỉ có sự thay thế nucleotide C bằng U mà không có hiện tượng thêm vào hoặc loại bỏ các nucleotide khác Trình tự
các acid amin ở protein có thể thay đổi đến 10% hoặc hơn nữa so với
protein được mã bởi phân tử ARNm chưa trải qua phản ứng này.
Trang 9Hình 3: Thay đổi thông tin di truyền trên phân tử ARNm của gen apo-B
bởi cơ chế "ARN editing" Chiều dài phân tử ARNm không đổi nhưngnucleotide U thay thế C tạo ra một mã dừng tổng hợp protein Ở động vật,các phân tử ARNm ít trải qua phản ứng "RNA editing" Trường hợp đầutiên được phát hiện đối với gen apolipoprotein B (apo-B) dài 4503 bp, làgen đơn bản trong genome người (Hình 2.16) Từ gen này hai loại phân tửARNm được tổng hợp Chúng chỉ khác nhau bởi một nucleotide C bị thaythế bởi U Do đó làm xuất hiện một mã dừng phản ứng tổng hợp protein.Protein ngắn tương ứng với loại ARNm này có trọng lượng phân tử 250KDal và chỉ tồn tại ở trong ruột Phân tử protein 512 KDal tương ứng vớiARNm không bị đọc sửa tồn tại ở cả gan và ruột Phản ứng "RNA editing"được thực hiện nhờ các phân tử ARN dài khoảng 40 - 80 base Các ARNnày gọi là ARN phụ trợ, ký hiệu là ARNg (guide RNA) Chúng được tổnghợp độc lập với nhau Đầu 5' của chúng có thể tạo liên kết với ARNm cầnsửa đổi, còn đầu 3' mang
đuôi polyU Các nucleotide U được chuyển trực tiếp từ đuôi này sangARNm Quá trình đọc sửa diễn ra từ đầu 3' và tiếp tục về đầu 5' củaARNm Có thể có nhiều ARNg tham gia sửa đổi một phân tử ARNm
2.2 Biến đổi sau phiên mã
2.2.1 Biến đổi phân tử ARNm trong tế bào eukaryot
Trong tế bào eukaryot, quá trình phiên mã phụ thuộc vào từng loạipromoter cũng như từng loại enzym ARN polymerase Các ARNr đượctổng hợp nhờ ARN polymerase I, ARNm được tổng hợp bởi ARNpolymerase II và các ARNt và 5S ARNr được phiên mã nhờ ARNpolymerase III Promoter cho các ARN polymerase I và II thường nằmtrước vùng chứa mã di truyền trong khi một số promoter cho ARNpolymerase III nằm phía sau điểm bắt đầu phiên mã (tức là promoter củaARN polymerase III nằm ngay trong vùng chứa mã di truyền) Cùng
Trang 10với các ARN polymerase, phản ứng tổng hợp ARN trong tế bào eukaryotchỉ thực hiện được khi có sự tham gia của nhiều protein khác Chúng tạothuận lợi để enzym khởi động phiên mã tại promoter của các gen eukaryot.Đây là điều khác biệt giữa quá trình phiên mã ở tế bào prokaryot vàeukaryot Promoter ở prokaryot thường kìm hãm bởi protein ức chế, vì thếchúng được xem là promoter mạnh Ngược lại, promoter ở eukaryot thườngđòi hỏi phải có các protein hoạt hoá; chúng được xem là promoter yếu.
Hình 4: Kỹ thuật xác định vị trí +1 sử dụng S1 nuclease Đoạn ADN chứa
vị trí +1 được lai với phân tử ARNm Phân tử lai dạng kép này được xử lývới S1 nuclease để phân hủy phần nucleotide không lai Sau đó, phân tử laiđược điện di cùng với mẫu xác định trình tự của đoạn ADN ban đầu
Trên Hình 4 cho thấy nucleotide A chính là vị trí đầu tiên được phiên
mã sang phân tử ARNm Để xác định vị trí +1, tức là nucleotide đầu tiênđược phiên mã sang phân tử ARNm, chúng ta có thể áp dụng kỹ thuật "S1nuclease mapping" (xác định vị trí +1 bởi S1 nuclease) Đầu tiên, đoạnADN (sàng lọc từ genome) có chứa phần 5' của gen được lai với ARNmcủa chính gen đó Tiếp theo, phần nucleotide ADN hoặc ARNm không laivới nhau mà ở dạng sợi đơn sẽ bị phân hủy bởi S1 nuclease Chỉ có phân tử
Trang 11lai dạng kép được điện di trên gel acrylamide cùng với phản ứng xác địnhtrình tự của chính đoạn ADN ban đầu Nhờ đó, vị trí nucleotide đầu tiên +1được xác định chính xác (Hình 4) Quá trình tổng hợp ARNm eukaryot xảy
ra nhờ ARN polymerase II Tuy nhiên enzyme này không tự bắt đầu phảnứng mà đòi hỏi sự phối hợp của nhiều yếu tố phiên mã Nhờ tương tác vớiARN polymerase II hoặc với ADN ở promoter hay ở các vị trí khác ngoàipromoter, các yếu tố này giúp enzym nhận biết dễ dàng các vị trí bảo toàntrên promoter để bắt đầu quá trình phiên mã Cho đến nay vị trí dừng chínhxác qúa trình tổng hợp ARNm trong tế bào eukaryot vẫn chưa được xácđịnh Tuy nhiên với hầu hết các gen mã cho protein, phản ứng được dừnglại sau khi ARN polymerase II vượt qua vị trí đặc biệt AATAAA (gọi là vịtrí polyA) khoảng 0,5 đến 2 kb Trong thí nghiệm invitro, việc loại bỏ vị trípolyA hoặc gây các đột biến tại đó đều khiến cho phân tử ARNm đượctổng hợp rất dài do enzym không xác định được vị trí dừng Cơ chế kiểmsoát dừng tổng hợp ARNm khi ARN polymerase II đi qua vị trí polyA vẫnchưa sáng tỏ Những kết quả thực nghiệm bước đầu cho thấy đây là vị tríliên kết của phức gồm protein CPSF (Cleavage and PolyadenylationSpecificity Factor) và protein CstF (Cleavage Stimulation Factor) PhầnCOOH của tiểu đơn vị lớn nhất của ARN polymerase II cần thiết cho việcthêm đuôi polyA Do đó, việc kết thúc phiên mã và thêm đuôi có thể xảy rađồng thời trong nhân tế bào eukaryot (Hình 5) Sau khi được phiên mã,phân tử tiền thân ARNm eukaryot phải trải qua ba thay đổi cơ bản trướckhi được dùng làm khuôn để tổng hợp protein Trước hết ARNm được gắnđuôi polyA vào đầu 3', gắn "mũ" Gm7 vào đầu 5' (ở vị trí 2' của đườngribose) và cắt nối intronexon thành phân tử ARNm hoàn chỉnh Phản ứngmethyl hoá tạo cấu trúc mũ giúp cho ribosome nhận biết được phân tửARNm và bám vào nó Cấu trúc mũ còn giúp bảo vệ đầu 5’ của ARNmkhông bị phân cắt bởi exonuclease
Trang 12Hình 5: Phối hợp giữa vị trí polyA (AATAAA) và phức protein trong quá
trình tổng hợp ARNm Phức CPSF và CstF liên kết với ARN polymerase
II Đến vị trí polyA, factor bị phân ly khỏi enzym khiến enzym không thểtiếp tục tổng hợp ARNm Đồng thời Poly(A) transferase thêm đuôi polyAvào đầu 3’ của ARNm
Sau khi có đuôi polyA và mũ Gm7, ARNm phải trải qua quá trìnhcắt bỏ các intron trước khi được vận chuyển ra ngoài tế bào chất Khoảng30-40 nucleotide nằm ở biên giới giữa intron và exon rất quan trọng đểphản ứng cắt intron xảy ra chính xác Đột biến các nucleotide nằm ở trungtâm intron không ảnh hưởng đến phản ứng này Đặc biệt trong cấu trúc củamỗi intron, hai nucleotide đầu tiên GU ở đầu 5' và hai nucleotide AG tậncùng ở đầu 3' giữ vai trò quyết định Chúng được bảo toàn ở mọi intron và
là vị trí nhận biết để cắt intron ra khỏi phân tử tiền thân ARNm
2.2.2 Gắn mũ
Hình 6 Cấu trúc tổng quan của mRNA ở eukaryote
Trang 13Các ARN thông tin của sinh vật nhân thật và virus có một cấu trúc
đặc biệt ở hai đầu cuối Ngay sau khi tiền ARN thông tin (pre-mRNA) được
tạo thành và thoát ra khỏi bề mặt của ARN polymerase, một loạt các
enzyme sẽ tiến hành phản ứng lên đầu 5' để tạo thành 5' methylated cap,
gọi là “mũ” – đó thực chất là phân tử 7-methyl-guanosine gắn vớinucleotide cuối của ARN thông tin qua liên kết "không bình thường" là 5'-5' triphosphate
Quá trình gắn mũ này xảy ra trong quá trình phiên mã, sau khi phiên
mã được khoảng 20-50 nucleotide Ở virus, các enzyme gắn mũ cho ARNthông tin gắn với ARN polymerase của virus Còn ở sinh vật nhân thật,khác với ARN polymerase I và ARN polymerase III, ARN polymerase II
có phần CTD (carboxy-terminal domain), tương tác với enzyme gắn mũ.
Nhờ vậy, mũ được bảo đảm đặc hiệu cho cấu trúc đầu 5' ARN thông tin.Mục tiêu của việc gắn mũ này là tránh việc phân tử ARN bị các enzymekhác làm phân hóa và trợ giúp cho ARN có khả năng ra khỏi nhân tếbào đến được tế bào chất Cụ thể hơn, cấu trúc mũ này có tác dụng bảo vệARN mới hình thành khỏi các enzyme exonuclease 5'-3', là vị trí gắn trực
tiếp cho phức hợp gắn với mũ (CBC -cap-binding complex) – chuẩn bị cho
các bước biến đổi tiền ARN thông tin kế tiếp và cũng là vị trí gắn cho cácnhân tố trong tế bào chất cần thiết trong quá trình dịch mã
