Tiểu luận môn Sinh Học Phân Tử KỶ THUẬT PCR (Polymerase Chain Reaction)

Phần một: ĐẶT VẤN ĐỀTrong khoảng 3 thập kỷ qua nhân loại đã trải qua cuộc cách về mạng sinh học, những vấn đề sinh học phân tử các quá trình lưu trữ, truyền đạt và biểu hiện thông tin di

ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HUẾ KHOA SINH HỌC

BÀI TIỂU LUẬN

BỘ MÔN: SINH HỌC PHÂN TỬ

Đề tài:

KỶ THUẬT PCR

(Polymerase Chain Reaction)

Giáo viên hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc

Học viên thực hiện : Nguyễn Thị Duyên

Phần một: ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong khoảng 3 thập kỷ qua nhân loại đã trải qua cuộc cách về mạng sinh học, những vấn

đề sinh học phân tử (các quá trình lưu trữ, truyền đạt và biểu hiện thông tin di truyền ở mức độ phân tử) là một bộ phận trong cuộc cách mạng đó Các kiến thức của sinh học phân tử cho phép chúng ta giải thích được mối quan hệ giữa cấu trúc và chức năng của các đại phân tử sinh học cũng như sự vận hành và kiểm soát các quá trình sinh hóa trong tế bào Trọng tâm của sinh học phân tử là việc nghiên cứu các đại phân tử như ADN, ARN và Protein cùng các quá trình tái bản, phiên mã và dịch mã Trong số các tiến bộ kỹ thuật góp phần tạo ra các cuộc bùng nổ về lĩnh vực sinh học phân tử chúng ta phải kể tới kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) Kỹ thuật PCR do Kary Mullis đề suất ra vào năm 1985, đây là phương pháp invitro

để nhân bản nhanh một đoạn ADN nào đó, có độ nhạy rất cao chỉ cần một khối lượng ban đầu rất hạn chế Bản thân kỹ thuật này chỉ là sự mở rộng trực tiếp các tính chất của quá trình tái bản ADN Nhưng nó đã được sử dụng theo nhiều cách khác nhau để làm cho việc tách dòng

và thao tác với ADN dễ dàng và hiệu quả hơn PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinhhọc phân tử nhằm nhân bản (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA trong ốngnghiệm mô phỏng bộ máy sinh tổng hợp DNA của tế bào sống Kỹ thuật nàyđược sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiềumục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng vân tay DNA,chuẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gene, và xác định huyết thống.Các áp dụng của nó hiện nay trong nhiều lãnh vực đã và đang làm được nhữngkết quả thật sự kỳ diệu, đã làm cho các công trình nghiên cứu sinh học phân tửtrở nên nhẹ nhàng và dễ dàng hơn gấp nhiều lần so với trước kia Nếu trước đâymột thử nghiệm sinh học phân tử phải kéo dài hàng tuần, thậm chí hàng tháng,thì nay cũng thí nghiệm có cùng mục đích như vậy, với PCR chỉ thực hiện trongvài ngày Nếu trước đây có những mục đích thí nghiệm không thể thực hiệnđược, thì ngày nay với PCR mục đích này lại có thể thực hiện được một các dễdàng Chính nhờ PCR mà ngày nay, sinh học phân tử đã làm được những bướctiến nhảy vọt trong mọi lãnh vực Vậy có thể nói là PCR đã thực sự làm mộtcuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử

Với mục đích tìm hiểu để có cái nhìn tổng quan nhất về kỷ thuật này, em chọn

đề tài nghiên cứu là: " Kỷ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)"

Phần hai: NỘI DUNG

A Phương pháp PCR

ADN polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà nó thực hiện chứcnăng nhân ADN khi tế bào phân chia Nó làm việc bằng cách nối với sợi ADN vàtạo sợi bổ sung Theo quy trình PCR gốc của Mullis, enzyme phản ứng nhân bảnADN được thực hiện trong ống nghiệm (in vitro) Sợi ADN đôi bị tách thành 2sợi đơn khi đun nóng ở 96°C Tuy nhiên, ở nhiệt độ này ADN polymerase bị pháhủy vì vậy cần bổ sung enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ.Quy trình PCR gốc của Mullis không có hiệu quả cao vì nó mất nhiều thời gian,cần một lượng lớn ADN polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trìnhPCR.

Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng

ADN-polymerase lấy từ vi khuẩn Thermus aquaticus (ưa nhiệt) sống trong mạch nước

phun ở nhiệt độ trên 110°C ADN polymerase từ sinh vật này là thermostable(ổn định ở nhiệt độ cao) và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ khi hỗn hợpđược nung nóng để tách sợi ADN Từ đó, không cần phải thêm ADN-polymerase vào mỗi chu kỳ, quá trình sao chép ADN có thể đơn giản và tự độnghơn

Một trong những ADN-polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập

được từ Thermus aquaticus và được gọi là Taq Taq polymerase được dùng rộng

rãi trong thực nghiệm PCR (5/2004) Nhược điểm của Taq là thỉnh thoảng nónhầm lẫn trong quá trình sao chép ADN, dẫn đến đột biến (sai) trong chuỗiADN, vì nó thiếu tính sửa sai exonuclease 3’-5’ Các polymerase như Pwo hayPfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi sai) và cóthể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi ADN được saochép Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao lẫn

sự nhân bản chính xác của ADN

II Định nghĩa

Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) là phương pháp khuếch đại

nhanh nhiều bản sao các đoạn DNA mà không qua tạo dòng Phương pháp PCRđược thực hiện hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thểthu nhận rất nhiều bản sao DNA Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trongnhiều lĩnh vực: chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xácđịnh giới tính của phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến địnhhướng, nghiên cứu sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,…

III Các điều kiện của phản ứng PCR

Muốn tiến hành phản ứng PCR cần có các thành phần sau:

1 ADN khuôn (template)

Gần như bất kỳ loại ADN, dù là mạch thẳng, mạch vòng, ADN plasmit,ADN hệ gen, cADN, hoặc ARN…đều có thể làm khuôn cho phản ứng PCR.ADN lấy từ nguồn nào không quan trọng yêu cầu duy nhất là vị trí gắn các mồi

và trình tự giữa chúng còn nguyên vẹn đã có những mẫu ADN mà tuổi đến hơn 7nghìn năm vẫn được sử dụng rất thành công trong các phản ứng PCR

Chúng ta hãy xem xét việc nhân bội một phân tử ADN đích Khi lượng phân

tử ADN ban đầu nhỏ, sự nhiễm (có mặt ADN mà chúng ta không quan tâm) trởthành vấn đề chính Đặc tính nhân bội của kỹ thuật PCR có nghĩa là, thậm chíchỉ nhiễm rất ít ADN cũng có thể phá hỏng thí nghiệm Nhiễm có thể từ nhiềunguồn khác nhau, kể cả từ nhà nghiên cứu thực hiện thí nghiệm, từ ống nghiệm,

từ đầu tip, thậm chí từ enzym và dung môi dùng cho thí nghiệm Trong một thínghiệm PCR điển hình, khoảng 0,1 - 1g hệ gen được thêm vào phản ứng để cóthể thực hiện PCR với số chu kỳ ít mà vẫn có đủ vật liệu cho các thí nghiệm tiếptheo Điều đó cũng giúp giảm thiểu khả năng nguồn nhiễm đươc nhân bội.Lượng ADN này tương ứng với bao nhiêu bản sao trình tự đích? Nếu bạn thêm1g ADN hệ gen người thì nó tương ứng với 1 x 10-6/(6,4 x 109 x 650) = 2,4.10-19

mol Vì ADN người chứa khoảng 6,4 x 109 bp và khối lượng phân tử trung bìnhcủa một cặp bazơ là 650 Da nên 1g ADN người tương với 2,4 x 10-19mol x 6 x

1023 (số Avogadro) = khoảng 144.000 phân tử Một đoạn ADN hệ gen dài1000bp nhân bội 8 triệu lần (sau 25 chu kỳ PCR) sẽ sinh ra khoảng 10 g đoạnADN đó Lượng nhỏ đó đủ để nhận biết bằng cách nhuộm ethidium bromide saukhi điện di

- Trình tự nucleotit phải đảm bảo mồi không gắn vào trình tự lặp lại trênADN đích.

- Từng mồi không được chứa các đoạn trình tự bổ trợ Ví dụ, mồi có trình tự

5’ – GAGATCGATGCATCGATCTC – 3’ có thể là mồi PCR tốt (vì dài 20nucleotit, GC chiếm 50% và không chứa trình tự lặp lại) nhưng nó lại mang trình

tự bổ trợ ở hai đầu và sẽ tạo cấu trúc cặp tóc nếu đầu 5’ gắn kết với đầu 3’ Khi

đó phản ứng PCR sẽ không diễn ra

- Hai mồi của cặp không được bổ trợ nhau hoặc đầu 3’ của hai mồi khôngđược bổ trợ nhau Ví dụ, hai mồi

5’ – GATCGATCGATACGTGATCC – 3’ và

5’ – CGTAGCTAGCTAGGATCACG – 3’ dường như là cặp mồi tốt Tuynhiên, các đầu 3’ của hai mồi lại bổ trợ nhau và có thể tạo primer dime rồi đượctái bản trong chu kỳ 1 của phản ưng PCR:

* Ghép đôi sai của mồi

Các mồi oligonucleotit dùng cho kỹ thuật PCR phải ghép đôi chính xác vớitrình tự đích Điều đó đặc biệt có ý nghĩa khi chúng ta cố tạo đột biến hoặcnhững biến đổi có chủ ý ở đoạn trình tự ADN nhân bội, hoặc khi chúng ta muốntìm trình tự gen tương đồng với trình tự đã biết Vị trí trong mồi phải ghép đôithật chính xác với trình tự đích chính là đầu 3’ Nếu đầu 3’ không ghép đôi chínhxác thì polymerase không tiếp tục tổng hợp hiệu quả được và thí nghiệm hỏnghoàn toàn

Để hiểu bằng cách nào có thể sử dụng PCR để gây tạo đột biến ở sản phẩm,chung ta cần tìm hiểu kỹ hơn về mồi Mồi không chỉ khởi đầu quá trình tái bảnADN mà chính chúng được tổng hợp lồng ghép vào các sản phẩm cuối cùng.Như vậy, bất kỳ sự thay đổi bazơ nào giưã mồi và ADN khuôn cũng được đưavào sản phẩm Vì chúng ta không thể gây tạo đột biến ở đầu 3’ nên vị trí thíchhợp để biến đổi là đầu 5’ của mồi

GGATTATTTGTACAAGATAATGTG 3 ’

CCTAATAAACATGTTCTATTACAC 5 ’

3’–CCTAATAAACATGTTCTACCTAGG –5 ’

PCR Mồi 2

BamHI EcoRI 5’- GAATTCATGAAGCTACTGTCTTCT GGATTATTTGTACAAGATAATGTG 3 ’

3 ’- CTTAAGTACTTCGATGACAGAAGA CCTAATAAACATGTTCTATTACAC 5 ’

Các mồi dùng để nhân một phần gen GAL4 từ hệ gen Saccharomyces cerevisiae và có gắn thêm vị trí nhận biết của enzym giới hạn.

Các sản phẩm PCR đều chứa trình tự này.

Trong trường hợp trên, chúng ta sử dung các mồi có chứa trình tự bổ sung ở các đầu 5’ Ở mồi 1, đó là trình tự nhận biết cho enzym giới hạn EcoRI ở đầu 5’

của đoạn trình tự dùng để nhận biết gen GAL4 Trình tự nhận biết của EcoRI không kết đôi chính xác với trình tự đích nhưng cũng không đủ để ngăn cản sự kết hợp đặc hiệu của mồi và trình tự đó có mặt ở tất cả các sản phẩm PCR Mồi chứa trình tự nhận biết cho enzym giới hạn BamHI Việc tách dòng sản phẩm cuối cùng trở nên dễ dàng sau khi cắt bằng 2 enzym giới hạn Thường thì các enzym giới hạn cần đoạn trình tự dài hơn trình tự nhận biết của chúng để cắt thật hiệu quả Vì vậy, người ta thường bổ sung thêm 3 đến 6 nucleotit vào trước trình

tự nhận biết của enzym giới hạn Các nucleotit đó thường là G hoặc C (được gọi

là kẹp GC) để tăng khả nắng gắn mồi của hai mạch và tăng hiệu quả cắt của enzym giới hạn

Bất kỳ đôi bazơ ghép sai nào giữa mồi và ADN khuôn cũng được đưa vào sản phẩm PCR cuối cùng Vì vậy, có thể tạo ra những đột biến mong muốn ở sản phẩm PCR bằng cách thay đổi trình tự mồi Điều đó đặc biệt quan trọng nếu ta muốn thay đổi trình tự mã hóa của gen để thay đổi trình tự axit amin, hoặc, ví

dụ, nếu ta muốn thay đổi codon cua gen để tạo ra vị trí nhận biết của enzym giới hạn mà không làm thay đổi trình tự axit amin của protein

Lợi ích thứ hai của primer ghép đôi sai là để tìm gen mã hóa một protein cụ thể và tìm các gen tương đồng Việc tách và đặc trưng hóa protein là việc phổ biến trong hóa sinh học Ví dụ, ta có thể tách protein mà ở đầu amin có trình tự các axit amin: Met – Ile – Trp – Pro – Phe Tính thoái hóa của mã cho biết trình

tự axit amin đó có thể được mã hóa bằng các trình tự ADN sau:

Gen GAL4

Met – Ile – Trp – Pro – Phe

5’ – ATG – ATA – TGG – CCA – TTC – 3’

5’ – ATG – ATA – TGG – CCA – TTC – 3’

C T T

3 Các ADN polymerase

Là các enzym xúc tác cho quá trình lắp ráp các nucleotit A, T, G, C vàomạch ADN mới đang tổng hợp Ngày nay người ta dùng nhiều loại ADNpolymerase: Taq ADN polymerase, PfuADN polymerase, T4 ADN polymerase,

Tth ADN polymerase nhưng phổ biến là Taq ADN polymerase

Taq ADN polymerase được tách chiết từ chủng vi khuẩn suối nước nóng

Thermus aquaticus Vi khuẩn này chịu được nhiệt độ từ 50oC – 80oC và sinhtrưởng tối ưu ở nhiệt độ 70oC

Taq ADN polymerase là enzym đơn phân, có khối lượng phân tử 90kDa.Bản thân enzym chịu được nhiệt, xúc tác tái bản ADN ở 74oC và thậm chí vẫnduy trì khả năng hoạt động chức năng sau khi ủ ở 95oC

Enzym này có hoạt tính polymerase 5’ – 3’ và hoạt tính exonuclease 5’ –

3’ nhưng không có hoạt tính exonuclease 3’– 5’ (đọc sửa) Không có hoạt tínhđọc sửa nghĩa là, nếu bazơ sai xen vào chuỗi polynucleotit đang tổng hợp thìcũng không bị loại bỏ và như vậy Taq ADN polymerase có xu hướng tổng hợp

có sai sót và sẽ sinh đột biến ở các sản phẩm PCR Trong các thí nghiệm đánhgiá in vitro Taq ADN polymerase ghép sai bazơ với tần số 1/104 - 1/105 Tỷ lệsai sót xấu nhất là 1/104, nghĩa là trong 1kb trình tự được nhân sau 25 vòng táibản thì khoảng 10% sản phẩm có chứa đột biến Tuy nhiên, vì đột biến xảy ra ởchu kỳ này sẽ chỉ được nhân lên ở các chu kỳ sau nên tần số đột biến thực sự sẽkhác nhau ở các thí nghiệm khác nhau Mặc dù vậy, mức độ sai sót đó có ảnhhưởng khác nhau đến đầu ra của các sản phẩm PCR Nếu thí nghiệm PCR đượcthiết kế chỉ để xác định có hay không có một gen cụ thể trong đoạn ADN đíchthì những sai sót trong quá trình nhân bội không ảnh hưởng Tuy nhiên, nếu đểnghiên cứu chức năng của gen thì những sai sót đó có thể tác động nghiêm trọngđến thí nghiệm

Một khía cạnh khác về hoạt động chức năng của Taq ADN polymerase là nó

có xu hướng gắn deoxynucleotit (thường là adenosine) vào đầu 3’ của mạch mới

tổng hợp, không phụ thuộc vào mạch khuôn Kết quả là, các sản phẩm PCR doTaq ADN polymerase tạo ra không có đầu bằng mà có một nucleotit A nhô ra ởđầu 3 ’ Đặc điểm này đã được khai thác để tách dòng các sản phẩm PCR

Sau Taq ADN polymerase, nhiều ADN polymerase khác cũng được pháthiện và sử dụng Những ADN polymerase đó có những đặc điểm khác biệt

Pfu ADN polymerase được tách chiết từ Pyrococcus furiosis có hoạt tính đọc

sửa exonuclease 3’ – 5’ nên làm giảm được tần số đột biến Cũng với tần số độtbiến như trên (1/104), thì với Pfu ADN polymerase, chỉ có 0,1% sản phẩm PCRchứa đột biến Một số ADN polymerase khác sinh các sản phẩm PCR đầu bằng.Hoạt tính exonulease 5’ – 3’ của Taq ADN polymerase có nghĩa là enzymnày có khả năng phân hủy các mồi oligonucleotit dùng trong phản ứng Điều đóđặc biệt có ý nghĩa ở bước gây biến tính của chu kỳ 1, khi mà các oligonucleotitkhông gắn vào khuôn ADN và polymerase còn đang tự do trong dung dịch Vàochu ky gia nhiệt đầu tiên, nhiệt độ của hỗn hợp PCR tăng từ nhiệt độ phòng(hoặc từ 4oC nếu phản ứng được thiết kế trên đá) đến 94oC Điều đó có nghĩa là,

ở một thời điểm nào đó, nhiệt độ bên trong ông nghiệm sẽ là 72oC – nhiệt độ tối

ưu cho polymerase – nhưng enzym lại không có khả năng tái bản ADN vì không

có oligonucleotit nào gắn vào khuôn Việc đi qua nhiệt độ đó mà không tái bản

có xu thế dẫn đến phân hủy mồi và làm cho thí nghiệm không hiệu quả Để giảiquyết khó khăn này, và để ngăn ngừa các sản phẩm PCR không đặc hiệu, có thể

bổ sung Taq ADN polymerase vào hỗn hợp ngay tại 94oC Như vậy vừa giúplàm tăng sản phẩm vừa tăng tính đặc hiệu của phản ứng Cách khác là, Taq ADNpolymerase có thể được trộn với kháng thể đặc hiệu gắn kết với enzym để ức chếhoạt tính của nó Phức hệ kháng thể - enzym ức chế tái bản ADN ở nhiệt độthấp, rồi lại tách ra ở nhiệt độ cao nên enzym vẫn hoạt động chức năng được

Có thể sử dụng hỗn hợp các ADN polymerase với các đặc tính khác nhautrong các phản ứng đặc biệt Ví dụ, Taq ADN polymerase sinh ra nhiều sảnphẩm PCR với kích thước tối đa là 5 – 7kbp nhưng sản phẩm lại có nhiều sai sót;Pfu ADN polymerase sinh ra sản phẩm ít sai sót hơn nhưng không tạo được sảnphẩm tới 7kbp Hỗn hợp 2 ADN polymerase đó (15 phần Taq: 1 phần Pfu) kháhiệu quả để nhân chính xác đoạn ADN có kích thước đến 35kbp

4 Các deoxyribonucleotit triphosphat (dNTP)

Các dNTP gồm 4 loại dATP, dTTP, dGTP, dCTP là nguyên liệu thamgia tạo nên mạch ADN mới Nồng độ tối ưu của dNTP thường dùng là 100 –200M Tuy nhiên, ở nồng độ dNTP thấp (10 – 100M) thì Taq ADN polymerasehoạt động chính xác hơn

ADN polymerase bao gồm;

ra Nồng độ magie tối ưu được xác định dựa vào kinh nghiệm với từng bộ mồinhưng thường trong khoảng 0,5 – 5mM Đệm và muối của phản ứng (Tris vàKCl) thường được giữ ổn định mặc dù một số protocol giảm bớt mức độ KCl đểkích thích polymerase bám trên mạch khuôn lâu hơn và tăng số lượng sản phẩm

IV Thiết bị và dụng cụ cho PCR

Phản ứng PCR được thực hiện trong máy chu trình nhiệt Đây là máy đunnóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng

Để ngăn ngừa sự bay hơi của hỗn hợp phản ứng, phần nắp đậy của máy PCRcũng được đun nóng, trường hợp lượng dung dịch phản ứng quá ít, người ta chomột lớp dầu (natural oil) lên trên bề mặt hỗn hợp phản ứng

§

Máy

nhân gen PCR

Cần đáp ứng yêu cầu thay đổi nhiệt độ thật nhanh và chính xác, tránh tối đa

sự bốc hơi nước Có thể tiến hành PCR ngay trên mô và tế bào

Mỗi kiểu thiết bị có đặc điểm khuyếch đại riêng nên mọi thí nghiệm của mộtnghiên cứu cần tiến hành trên cùng một loại

Ống nghiệm dùng của một nghiên cứu phải cùng một kiểu vì đặc tính truyềnnhiệt của các ống cũng như nhiệt độ tiếp xúc giữa ống và bộ phận tỏa nhiệt củathiết bị có ảnh hưởng lớn đến quá trình khuyếch đại

V Nguyên tắc của kỹ thuật PCR

Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction) là một phương pháp tổng hợp DNAdựa trên mạch khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân sốlượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động củaenzyme polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn DNA này.Primer là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch





của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer nàyđược kéo dài để hình thành mạch mới Kỹ thuật PCR được hình thành dựa trênđặc tính này của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai primer sẽ đượckhuếch đại thành số lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộmbằng ethidium bromide và có thể thu nhận đoạn DNA này cho các mục đíchkhác nhau bằng các thao tác trên gel Như vậy, để khuếch đại một trình tự DNAxác định, cần phải có những thông tin tối thiểu về trình tự của DNA, đặc biệt làtrình tự base ở hai đầu đoạn DNA đủ để tạo các primer bổ sung chuyên biệt.Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bướcnhư sau :

Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation)

Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân

tử (94 – 95 0C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch képtách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho

Bước 3: (kéo dài, elongation – extension)

Nhiệt độ được tăng lên 720C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất.Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theonguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào

độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút

Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n

m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa

n: Là số chu kỳ

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành haibản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ mộtDNA đích đã nhân bản được thành 230đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao

Ba giai đoạn này lặp lại nhiều lần Ba giai đoạn xãy ra trong điều kiện nhiệt độkhác nhau nên người ta sữ dụng máy điều nhiệt tự động một cách chính xác với

sự trợ giúp của Taq Sự lặp lại theo chu kỳ thường xãy ra khoảng 30 lần để tạo ra

106 bản sao

Các bước thực hiện trong 1 chu kỳ PCR

* Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR điển hình thường là:

- 90oC, 30 giây – gây biến tính ADN

- 60oC, 30 giây – gắn mồi

- 72oC, 1 phút – tổng hợp

Giai đoạn biến tính và gắn mồi thường ngắn nhưng phù hợp để phá hủy

và tái tạo các liên kết hydro giữa hai mạch ADN Các protocol trước đây thường

có giai đoạn biến tính 94oC, 2 phút để đảm bảo ADN khuôn hoàn toàn tách ra.Hiện nay thường không như vậy vì việc xử lí nhiệt độ cao, lâu thường gây các