Tiểu luận môn Sinh Học Phân Tử DNA TÁI TỔ HỢP & ỨNG DỤNG CỦA NÓ

Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TIỂU LUẬN HỌC PHẦN: SINH HỌC PHÂN TỬ Đề tài: DNA TÁI TỔ HỢP & ỨNG DỤNG CỦA NÓ - 1 - Giảng viên hướng dẫn: Học viên thực hiện: PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Nguyễn Thị Ái Nhi Lớp: LL&PP dạy học sinh học- K22 Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó Huế, 01/2014 LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS Nguyễn Bá Lộc đã tận tình giảng dạy giúp em nắm vững kiến thức trên lớp học. Xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài Học viên : Nguyển Thị Ái Nhi - 2 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó MỤC LỤC MỞ ĐẦU 5 CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM VỀ DNA TÁI TỔ HỢP 6 CHƯƠNG 2: CÁC ENZYM CẮT GIỚI HẠN VÀ VECTOR 8 II.1 Các enzyme cắt giới hạn 8 II.1.1 Enzym cắt giới hạn là gì? 8 II.1.2 Vai trò của enzyme cắt giới hạn 8 II.1.3 Tính chất chung của enzyme giới hạn 8 II.2 Các vector thông dụng trong kỹ thuật di truyền 10 CHƯƠNG 3: CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ 11 III.1 Tế bào chủ nhân sơ 11 III.2 Tế bào chủ nhân chuẩn 12 III.2.1 Tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae) 12 III.2.2 Các tế bào chủ thực vật 13 III.2.3 Các tế bào chủ động vật 13 CHƯƠNG 4: TẠO, TÁCH VÀ CHỌN LỌC DÒNG DNA TÁI TỔ HỢP 15 IV.1 Tạo plasmid tái tổ hợp 15 IV.1.1 Tạo nguồn gen 15 a. Thu nhập DNA từ hệ gen ( thư viện gen) 15 b. Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học 15 c. Lập ngân hàng DNA bổ trợ (cDNA) 16 IV.1.2 Tạo plasmid tái tổ hợp 16 - 3 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó IV.2 Tách dòng DNA tái tổ hợp 18 IV.3 Chọn lọc dòng DNA đặc hiệu và biểu hiện gen 19 CHƯƠNG V: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP 21 V.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp với nghiên cứu bộ gen 21 V.2. Công nghệ DNA tái tổ hợp với y-dược học 22 V.2.1 Sản xuất các chế phẩm y-sinh học bằng công nghệ DNA tái tổ hợp 22 V.2.2 Ứng dụng kỹ thuật di truyền trong chuẩn đoán và điều trị 26 V.2.3 Kỹ thuật di truyền với hình pháp học 26 V.3 Kỹ thuật di truyền với các sinh vật biến đổi gen (GMOs) 27 - 4 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó MỞ ĐÂU Vào năm 1972, các nhà khoa học tại trường Đại học Tổng hợp Stenford đã tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên bằng cách sử dụng enzyme giới hạn cắt các phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau và nối các đoạn DNA đó bằng enzyme nối ligase. Phương pháp này ngày càng được mở rộng, đến năm 1973- 1974, nhóm nhà khoa học Cohen, Henlinski, Boyer đã tạo ra DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinh học. Kỹ thuật mới này được thực hiện trong điều kiện thí nghiệm invitro để tạo thành các DNA có hoạt tính, sau đó đưa và gắn vào phân tử DNA khác trong tế bào sống. 8/1978 Boyer là người cho sản xuất thành công insulin người từ E.coli. Các thành tựu đầu tiên này đã mở ra một kỷ nguyên mới phát triển rực rỡ nhất đó là công nghệ DNA tái tổ hợp. Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ gen hay kỹ thuật gen…) hiện nay bao gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tử được dùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA. Từ những lí do trên tôi chọn đề tài tiểu luận của mình là: “ DNA tái tổ hợp và ứng dụng của nó” - 5 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó NỘI DUNG CHƯƠNG 1 KHÁI NIỆM VỀ DNA TÁI TỔ HỢP DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồn vật liệu di truyền khác nhau. Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kĩ thuật ghép nối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc của các loài khác nhau. Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp, tinh vi, thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau: Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi cho tế bào cho (ví dụ tế bào của người) để cung cấp DNA. Bước 2: Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho. Bước này còn được gọi là phân lập gen. Bước 3: Cắt cả hai đoạn DNA ( DNA plasmid và DNA tế bào cho) bằng cùng một loại enzyme giới hạn (restriction enzyme – RE) Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với DNA tế bào cho cũng đã bị cắt bởi một loại enzyme giới hạn. Bước 5: Bổ sung enzyme nối ligase để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh. Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ ( ví dụ vi khuẩn E.coli và nhân dòng. Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang DNA tái tổ hợp và theo dõi hoạt động, biểu hiện gen thông qua sản phẩm của gen lấy từ tế bào cho. - 6 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó Sơ đồ khái quát của quá trình tạo DNA tái tổ hợp: - 7 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó CHƯƠNG 2: CÁC ENZYM CẮT GIỚI HẠN VÀ VECTOR II.1 Các enzyme cắt giới hạn II.1.1 Enzym cắt giới hạn là gì? Enzym cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzyme giới hạn (restrictase) là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệu trên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sung tại các vị trí đặc thù. II.1.2 Vai trò của enzyme cắt giới hạn Từ 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa DNA của một nòi vi khuẩn E.coli này vào tế bào thuộc một nòi khác thường thì DNA được đưa vào (DNA ngoại lai hay DNA lạ) mất hẳn hoạt tính di truyền và hầu như bao giờ cũng bị phân cắt thành các đoạn ngắn. Chỉ trong một số ít trường hợp DNA lạ đó mới không bị phân cắt và nhờ đó có thể tái bản trong tế bào chủ. Các hiện tượng này xảy ra chủ yếu khi các phage xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn. Cho đến đầu thập niên 1970 người ta mới biết rõ rằng các tế bào vi khuẩn là những hệ thống chứa cả hai loại enzyme: các enzyme sửa đổi và các enzyme cắt giới hạn. Chúng đều đối tượng nhận biết là các đoạn trình tự của DNA vật chủ và DNA ngoại lai, nhưng có vai trò khác nhau. Cụ thể, các enzyme sửa đổi (methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ bằng cách gắn thêm nhóm methyl ( - CH 3 ) ở một số baze nhất định trong đoạn nhận biết hay đoạn đích (target sequence). Trong khi đó, các enzyme giới hạn lại đóng vai trò vô hiệu hóa hoạt tính di truyền của các DNA lạ bằng cách phân cắt ở các vị trí đặc hiệu chừng nào nó chưa được sửa đổi cho giống với DNA vật chủ. Như vậy, các enzyme giới hạn - 8 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó đóng vai trò là rào cản bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn nhằm chống lại sự xâm nhập của các phage lạ. II.1.3 Tính chất chung của enzyme giới hạn Các enzyme giới hạn chỉ phát hiện thấy ở các vi khuẩn mà không có ở các eukaryote. Vì vậy, tên gọi của các enzyme giới hạn thông dụng là tên hệ thống được biểu thị bằng ba hoặc bốn chữ cái viết tắt của vi khuẩn mà từ đó enzyme được chiết xuất. Chữ cái đầu tiên được viết hoa để chỉ chi (genus) và hai chữ cái tiếp theo viết thường để chỉ loài (species), và khi cần thiết thêm chữ cái thứ tư để chỉ nòi hoặc chủng (strain, type). Ngoài ra, để phân biệt các enzyme cùng một nòi người ta dùng số La Mã kèm theo sau tên hệ thống. Tính chất quan trọng nhất của enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị trí, nghĩa là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc hiệu để cắt ở vị trí xác định. Tùy theo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà chia ra hai loại chính: - Loại I bao gồm các enzyme giới hạn cắt bên ngoài phạm vi đoạn nhận biết. - Loại II bao gồm enzyme cắt đặc hiệu bên trong đoạn nhận biết. Các enzyme giới hạn loại II vốn được xem là công cụ hiệu năng cho phép thao tác các gen trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp. Đặc trưng nổi bật của các đoạn đích là có kích thước ngắn, 4-8 cặp bazo và có tính đối xứng xuôi ngược (palindrome) Nhìn chung, các enzyme giới hạn khác nhau có hai kiểu cắt sau đây: cắt lệch và cắt thẳng. Với kiểu cắt lệch tức là các vị trí cắt trên hai sợi của DNA sợi kép là so le, tạo ra các đoạn DNA có các đầu sợi đơn gồm một số bazo bổ sung gọi là các đầu dính (sticky ends). Các enzyme giới hạn như thế có vai trò to lớn trong việc kiến tạo DNA tái tổ hợp invitro, ví dụ EcoRI và BamHI. Với kiểu cắt thẳng, tức cắt cùng vị trí trên cả hai sợi của DNA sợi kép, tạo ra các đoạn DNA đầu bằng (blunt ends), ví dụ Smal… - 9 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó Các enzyme giới hạn khác nhau có đoạn đích giống nhau, mặc dù vị trí và kiểu cắt có thể giống hoặc khác nhau, gọi là các enzyme giới hạn tương ứng (izoschizomers), ví dụ Smal và Xmal. II.2 Các vector thông dụng trong kỹ thuật di truyền Vector là phân tử DNA nguyên vẹn có kích thước bé hoặc vừa phải, đóng vai trò là vật trung gian mang truyền đoạn DNA ngoại lai nghiên cứu vào trong tế bào thể nhận (tế bào khả biến) bằng con đường biến nạp (transformation) hoặc tải nạp (transduction). Có hai loại vector thông dụng là các plasmid và các phage. Các plasmid vi khuẩn được sử dụng rộng rãi hơn cả, bởi vì chúng có đặc điểm sau: (i) Có khả năng xâm nhập vào tế bào chủ và hoạt động (tái bản, biểu hiện gene) bình thường (ii) Có trọng lượng phân tử thấp nên dễ dàng tinh chiết. (iii) Số bản sao trong mỗi tế bào vi khuẩn thường khá cao. (iv) Đặc biệt là, một số plasmid có chứa các gene kháng thuốc tiện lợi cho việc theo dõi và phát hiện sự só mặt của plasmid tái tổ hợp trong vi khuẩn chủ. Trong số các phage dùng làm vector thì phage lambda có nhiều ưu thế nhất, bởi lẽ ở phần giữa của bộ gen có chứa một số gene không quan trọng và không liên quan với sự tái bản của nó, nên thuận lợi cho việc xen đoạn DNA mong muốn vào đây. Các phage không chứa các gen kháng thuốc cho nên việc theo dõi các phage tái tổ hợp được xác định dựa vào các vết tan dương tính ( positive plaques) trên nền vi khuẩn. - 10 - [...]... sao của plasmid tái tổ hợp trong tế bào E.coli cần hợp lý - Phải có khởi điểm phiên mã mạnh - Có trình tự thuận lợi cho ribosome bám khi khởi đầu dịch mã - DNA tái tỏ hợp có sự ổn định lâu dài trong E.coli - Không có sự phân giải protein của các enzym trong tế bào chủ - 20 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó CHƯƠNG V: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP V.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp. .. Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó +Trộn lẫn các dòng cDNA và plasmid sau khi xử lý với nhau Các đầu mút của hai loại đuôi bổ trợ sẽ bắt cặp bổ sung với nhau Do vậy, đoạn DNA lạ (từ cDNA) bắt cặp với plasmid Nhờ có enzym DNA polymerase I và ligase chúng sẽ nối với nhau tạo ra plasmid tái tổ hợp IV.2 Tách dòng DNA tái tổ hợp Sau khi plasmid tái tổ hợp, hoặc vector tái tổ hợp được tạo thành,... khoảng 4kb, sau đó gắng vào các plasmid b Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học - 15 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó Muốn tổng hợp hóa học đoạn DNA hay một gen cần phải biết trình tự các đoạn DNA hay gen đó Sử dụng các máy tổng hợp DNA tự động (DNA synthesizer) Phương pháp tổng hợp gen bằng con đường hóa học, ví dụ đầu tiên là tổng hợp gen mã hóa cho hoocmon somarostatin co... hormon này từ E.Coli bằng phương pháp DNA tái tổ hợp Đến 8/1978 chính Boyer lại là người cho sản xuất thành công insulin người từ E.coli Các thành tựu đầu tiên này đã mở ra một kỷ nguyên mới phát triển rực rỡ nhất đó là công nghệ DNA tái tổ hợp - 22 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó Hình Cấu trúc của phân tử insulin Hình Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A và chuỗi B riêng biệt... bào tử cung chuột bạch (Chinese hamster ovary) - Tế bào côn trùng để nuôi Baculovirus biểu hiện protein người - Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans - 14 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó CHƯƠNG 4: TẠO, TÁCH VÀ CHỌN LỌC DÒNG DNA TÁI TỔ HỢP Trong phần trước chúng ta đã biết có 2 yếu tố quan trọng trong công nghệ DNA tái tổ hợp: khả năng sử dụng các enzyme để cắt nối các phân. .. IV.1 Tạo plasmid tái tổ hợp IV.1.1 Tạo nguồn gen Bước đầu của việc tạo plasmid tái tổ hợp là cần phải thu được nguồn gen Có 3 phương pháp khác nhau để thu nhập gen: a Thu nhập DNA từ hệ gen ( thư viện gen) Đây là phương pháp thường dùng ngay từ giai đoạn đầu tiên phát triển công nghệ DNA tái tổ hợp Toàn bộ các phân tử DNA của một loài sinh vật được tách thành các đoạn nhỏ bằng cách lắc cơ học, hoặc dùng... tái tổ hợp và ứng dụng của nó KẾT LUẬN Công nghệ DNA tái tổ hợp hay còn gọi là công nghệ di truyền, CN Gen thực hiện việc chuyển gen để tạo ra các tế bào hoặc cá thể mang các gen mới nhằm tạo ra những vật chất cần thiết cho con người - Công nghệ gen được thực hiện trên cơ sở tạo ra AND tái tổ hợp nhờ các enzim cắt, nối, các vector chuyển gen và được đưa vào tế bào vật chủ - Công nghệ gen được ứng dụng. .. phục vụ nghiên cứu khoa học - Các nghiên cứu về lĩnh vực này cần áp dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất - Đây là hướng đi mới nhưng có nhiều tiềm năng nên cần nhiều hơn những nghiên cứu ở lĩnh vực này - 29 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó TÀI LIỆU THAM KHẢO 1 PGS,TS.Nguyễn Bá Lộc (2002), Bài giảng Sinh học phân tử (Dành cho học viên cao học ngành sinh học) , Huế 2 TS Trình... bào) Gen của bệnh loạn dưỡng cơ của Duchenne (DMD): Gen này là gen dài nhất được biết: nó gồm trên 2000 Kb và trên 75 exon V.2 Công nghệ DNA tái tổ hợp với y- dược học V.2.1 Sản xuất các chế phẩm y -sinh học bằng công nghệ DNA tái tổ hợp Nếu như vào năm 1972, giáo sư Roger Guillemin (pháp) phải dùng tới 500.000 não cừu mới tinh chiết được vài miligram somatostatin, một hoocmon sinh trưởng của vùng dưới... Trộn lẫn DNA và vector chuyển gen đã bị cắt bằng cùng một loại enzyme - 16 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó giới hạn như đã nêu trên Bước tiếp theo là dung enzyme nối ligase để gắn các đoạn cần nối với nhau Phương pháp này được ứng dụng rộng rãi trong việc tạo plasmid tái tổ hợp - Phương pháp dùng đoạn nối: Các đoạn DNA hay ARN ngắn khoảng 10-20 nucleotit được tổng hợp bằng . k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TIỂU LUẬN HỌC PHẦN: SINH HỌC PHÂN TỬ Đề tài: DNA TÁI TỔ HỢP & ỨNG DỤNG CỦA NÓ - 1 - Giảng viên hướng dẫn: Học viên. và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA. Từ những lí do trên tôi chọn đề tài tiểu luận của mình là: “ DNA tái tổ hợp và ứng dụng của nó - 5 - Nguyễn Thị Ái Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng. Nhi- k22 AND tái tổ hợp và ứng dụng của nó MỞ ĐÂU Vào năm 1972, các nhà khoa học tại trường Đại học Tổng hợp Stenford đã tạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên bằng cách sử dụng enzyme giới