Tiểu luận môn Sinh Học Phân Tử DNA TÁI TỔ HỢP & ỨNG DỤNG CỦA NÓ

MỞ ĐÂUVào năm 1972, các nhà khoa học tại trường Đại học Tổng hợp Stenford đãtạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên bằng cách sử dụng enzyme giới hạn cắtcác phân tử DNA có nguồn gốc k

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

Giảng viên hướng dẫn: Học viên thực hiện:

PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Nguyễn Thị Ái Nhi

Lớp: LL&PP dạy học sinh học- K22

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn thầy giáo PGS.TS Nguyễn Bá Lộc đã tận tình giảng dạy giúp em nắm vững kiến thức trên lớp học Xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn đã giúp tôi hoàn thành tốt đề tài

Học viên : Nguyển Thị Ái Nhi

MỤC LỤC

MỞ ĐẦU 5

CHƯƠNG 1: KHÁI NIỆM VỀ DNA TÁI TỔ HỢP 6

CHƯƠNG 2: CÁC ENZYM CẮT GIỚI HẠN VÀ VECTOR 8

II.1 Các enzyme cắt giới hạn 8

II.1.1 Enzym cắt giới hạn là gì? 8

II.1.2 Vai trò của enzyme cắt giới hạn 8

II.1.3 Tính chất chung của enzyme giới hạn 8

II.2 Các vector thông dụng trong kỹ thuật di truyền 10

CHƯƠNG 3: CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ 11

III.1 Tế bào chủ nhân sơ 11

III.2 Tế bào chủ nhân chuẩn 12

III.2.1 Tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae) 12

III.2.2 Các tế bào chủ thực vật 13

III.2.3 Các tế bào chủ động vật 13

CHƯƠNG 4: TẠO, TÁCH VÀ CHỌN LỌC DÒNG DNA TÁI TỔ HỢP 15

IV.1 Tạo plasmid tái tổ hợp 15

IV.1.1 Tạo nguồn gen 15

a Thu nhập DNA từ hệ gen ( thư viện gen) 15

b Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học 15

c Lập ngân hàng DNA bổ trợ (cDNA) 16

IV.1.2 Tạo plasmid tái tổ hợp 16

IV.2 Tách dòng DNA tái tổ hợp 18

IV.3 Chọn lọc dòng DNA đặc hiệu và biểu hiện gen 19

CHƯƠNG V: ỨNG DỤNG CÔNG NGHỆ DNA TÁI TỔ HỢP 21

V.1 Công nghệ DNA tái tổ hợp với nghiên cứu bộ gen 21

V.2 Công nghệ DNA tái tổ hợp với y-dược học 22

V.2.1 Sản xuất các chế phẩm y-sinh học bằng công nghệ DNA tái tổ hợp 22

V.2.2 Ứng dụng kỹ thuật di truyền trong chuẩn đoán và điều trị 26

V.2.3 Kỹ thuật di truyền với hình pháp học 26

V.3 Kỹ thuật di truyền với các sinh vật biến đổi gen (GMOs) 27

MỞ ĐÂU

Vào năm 1972, các nhà khoa học tại trường Đại học Tổng hợp Stenford đãtạo ra các phân tử DNA tái tổ hợp đầu tiên bằng cách sử dụng enzyme giới hạn cắtcác phân tử DNA có nguồn gốc khác nhau và nối các đoạn DNA đó bằng enzymenối ligase Phương pháp này ngày càng được mở rộng, đến năm 1973- 1974, nhómnhà khoa học Cohen, Henlinski, Boyer đã tạo ra DNA tái tổ hợp có hoạt tính sinhhọc Kỹ thuật mới này được thực hiện trong điều kiện thí nghiệm invitro để tạothành các DNA có hoạt tính, sau đó đưa và gắn vào phân tử DNA khác trong tếbào sống

8/1978 Boyer là người cho sản xuất thành công insulin người từ E.coli Cácthành tựu đầu tiên này đã mở ra một kỷ nguyên mới phát triển rực rỡ nhất đó làcông nghệ DNA tái tổ hợp

Công nghệ DNA tái tổ hợp (còn gọi là công nghệ di truyền, công nghệ genhay kỹ thuật gen…) hiện nay bao gồm một mạng lưới các kỹ thuật phân tử đượcdùng để phân tích, biến đổi và tái tổ hợp hầu như mọi trình tự DNA

Từ những lí do trên tôi chọn đề tài tiểu luận của mình là: “ DNA tái tổ hợp

và ứng dụng của nó”

NỘI DUNG

CHƯƠNG 1 KHÁI NIỆM VỀ DNA TÁI TỔ HỢP

DNA tái tổ hợp (recombinant DNA) là DNA được tạo ra từ hai hay nhiều nguồnvật liệu di truyền khác nhau Phân tử DNA tái tổ hợp được tạo ra nhờ kĩ thuật ghépnối các đoạn DNA của các cá thể khác nhau trong cùng một loài, hoặc của các loài

khác nhau

Kỹ thuật tái tổ hợp DNA được thực hiện qua nhiều công đoạn phức tạp,tinh vi, thực chất là một công nghệ gồm các bước chủ yếu sau:

Bước 1: Nuôi tế bào cho plasmid để tạo vector chuyển gen và nuôi cho tế

bào cho (ví dụ tế bào của người) để cung cấp DNA

Bước 2: Tách chiết DNA plasmid và DNA tế bào cho Bước này còn được

gọi là phân lập gen

Bước 3: Cắt cả hai đoạn DNA ( DNA plasmid và DNA tế bào cho) bằng

cùng một loại enzyme giới hạn (restriction enzyme – RE)

Bước 4: Trộn chung DNA plasmid đã bị cắt với DNA tế bào cho cũng đã bị

cắt bởi một loại enzyme giới hạn

Bước 5: Bổ sung enzyme nối ligase để tạo ra DNA tái tổ hợp hoàn chỉnh Bước 6: Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ ( ví dụ vi khuẩn E.coli và

nhân dòng

Bước 7: Chọn lọc và tạo dòng tế bào chủ (vi khuẩn) mang DNA tái tổ hợp

và theo dõi hoạt động, biểu hiện gen thông qua sản phẩm của gen lấy từ tế bào cho

Sơ đồ khái quát của quá trình tạo DNA tái tổ hợp:

CHƯƠNG 2: CÁC ENZYM CẮT GIỚI HẠN VÀ VECTOR

II.1 Các enzyme cắt giới hạn

II.1.1 Enzym cắt giới hạn là gì?

Enzym cắt giới hạn (restriction endonuclease) hay gọi tắt là enzyme giới hạn(restrictase) là loại enzyme có khả năng nhận biết đoạn trình tự nucleotide đặc hiệutrên các phân tử DNA và cắt cả hai sợi DNA bổ sung tại các vị trí đặc thù

II.1.2 Vai trò của enzyme cắt giới hạn

Từ 1953 người ta đã phát hiện thấy rằng, khi đưa DNA của một nòi vi khuẩnE.coli này vào tế bào thuộc một nòi khác thường thì DNA được đưa vào (DNAngoại lai hay DNA lạ) mất hẳn hoạt tính di truyền và hầu như bao giờ cũng bị phâncắt thành các đoạn ngắn Chỉ trong một số ít trường hợp DNA lạ đó mới không bịphân cắt và nhờ đó có thể tái bản trong tế bào chủ Các hiện tượng này xảy ra chủyếu khi các phage xâm nhiễm các tế bào vi khuẩn

Cho đến đầu thập niên 1970 người ta mới biết rõ rằng các tế bào vi khuẩn lànhững hệ thống chứa cả hai loại enzyme: các enzyme sửa đổi và các enzyme cắtgiới hạn Chúng đều đối tượng nhận biết là các đoạn trình tự của DNA vật chủ vàDNA ngoại lai, nhưng có vai trò khác nhau Cụ thể, các enzyme sửa đổi(methylase) đóng vai trò bảo vệ DNA vật chủ bằng cách gắn thêm nhóm methyl ( -

CH3) ở một số baze nhất định trong đoạn nhận biết hay đoạn đích (targetsequence) Trong khi đó, các enzyme giới hạn lại đóng vai trò vô hiệu hóa hoạttính di truyền của các DNA lạ bằng cách phân cắt ở các vị trí đặc hiệu chừng nào

nó chưa được sửa đổi cho giống với DNA vật chủ Như vậy, các enzyme giới hạnđóng vai trò là rào cản bảo vệ tự nhiên của các vi khuẩn nhằm chống lại sự xâmnhập của các phage lạ

II.1.3 Tính chất chung của enzyme giới hạn

Các enzyme giới hạn chỉ phát hiện thấy ở các vi khuẩn mà không có ở cáceukaryote Vì vậy, tên gọi của các enzyme giới hạn thông dụng là tên hệ thốngđược biểu thị bằng ba hoặc bốn chữ cái viết tắt của vi khuẩn mà từ đó enzymeđược chiết xuất Chữ cái đầu tiên được viết hoa để chỉ chi (genus) và hai chữ cáitiếp theo viết thường để chỉ loài (species), và khi cần thiết thêm chữ cái thứ tư đểchỉ nòi hoặc chủng (strain, type) Ngoài ra, để phân biệt các enzyme cùng một nòingười ta dùng số La Mã kèm theo sau tên hệ thống.

Tính chất quan trọng nhất của enzyme giới hạn là tính đặc hiệu vị trí, nghĩa

là chúng có thể nhận biết đoạn trình tự DNA đặc hiệu để cắt ở vị trí xác định Tùytheo vị trí cắt so với đoạn nhận biết mà chia ra hai loại chính:

- Loại I bao gồm các enzyme giới hạn cắt bên ngoài phạm vi đoạn nhậnbiết

- Loại II bao gồm enzyme cắt đặc hiệu bên trong đoạn nhận biết Cácenzyme giới hạn loại II vốn được xem là công cụ hiệu năng cho phépthao tác các gen trong kỹ thuật DNA tái tổ hợp

Đặc trưng nổi bật của các đoạn đích là có kích thước ngắn, 4-8 cặp bazo và

có tính đối xứng xuôi ngược (palindrome)

Nhìn chung, các enzyme giới hạn khác nhau có hai kiểu cắt sau đây: cắt lệch

và cắt thẳng Với kiểu cắt lệch tức là các vị trí cắt trên hai sợi của DNA sợi kép là

so le, tạo ra các đoạn DNA có các đầu sợi đơn gồm một số bazo bổ sung gọi là cácđầu dính (sticky ends) Các enzyme giới hạn như thế có vai trò to lớn trong việckiến tạo DNA tái tổ hợp invitro, ví dụ EcoRI và BamHI Với kiểu cắt thẳng, tức cắtcùng vị trí trên cả hai sợi của DNA sợi kép, tạo ra các đoạn DNA đầu bằng (bluntends), ví dụ Smal…

Các enzyme giới hạn khác nhau có đoạn đích giống nhau, mặc dù vị trí vàkiểu cắt có thể giống hoặc khác nhau, gọi là các enzyme giới hạn tương ứng(izoschizomers), ví dụ Smal và Xmal

II.2 Các vector thông dụng trong kỹ thuật di truyền

Vector là phân tử DNA nguyên vẹn có kích thước bé hoặc vừa phải, đóngvai trò là vật trung gian mang truyền đoạn DNA ngoại lai nghiên cứu vào trong tếbào thể nhận (tế bào khả biến) bằng con đường biến nạp (transformation) hoặc tảinạp (transduction)

Có hai loại vector thông dụng là các plasmid và các phage

Các plasmid vi khuẩn được sử dụng rộng rãi hơn cả, bởi vì chúng có đặcđiểm sau:

(i) Có khả năng xâm nhập vào tế bào chủ và hoạt động (tái bản, biểu hiện gene)bình thường

(ii) Có trọng lượng phân tử thấp nên dễ dàng tinh chiết

(iii) Số bản sao trong mỗi tế bào vi khuẩn thường khá cao

(iv) Đặc biệt là, một số plasmid có chứa các gene kháng thuốc tiện lợi cho việctheo dõi và phát hiện sự só mặt của plasmid tái tổ hợp trong vi khuẩn chủ

Trong số các phage dùng làm vector thì phage lambda có nhiều ưu thế nhất,bởi lẽ ở phần giữa của bộ gen có chứa một số gene không quan trọng và không liênquan với sự tái bản của nó, nên thuận lợi cho việc xen đoạn DNA mong muốn vàođây Các phage không chứa các gen kháng thuốc cho nên việc theo dõi các phagetái tổ hợp được xác định dựa vào các vết tan dương tính ( positive plaques) trênnền vi khuẩn

CHƯƠNG 3: CÁC LOẠI TẾ BÀO CHỦ

Nhiều loại tế bào chủ khác nhau được sử dụng phụ thuộc vào mục đích sử dụngnhư:

- Nuôi số lượng lớn để tách plasmid cho thí nghiệm tạo dòng Hệ thống tếbào chủ này cần đơn giản, dễ sử dụng

- Dùng để biều hiện gen, đặc biệt ở các sinh vật nhân chuẩn bậc cao nhưđộng vật, thực vật Hệ thống tế bào chủ này cần mang tính phù hợp

- Dùng để sản xuất protein tái tổ hợp

Tùy theo mục đích sử dụng mà chọn một loại tế bào chủ thích hợp Các tế bào chủ

có thể chia làm hai hệ thống chính Đó là các tế bào chủ nhân sơ và tế bào chủnhân chuẩn

III.1 Tế bào chủ nhân sơ

Một loại tế bào chủ lý tưởng là tế bào cần phải dễ nuôi cấy, dễ giữ và nhângiống, lại chấp nhận được nhiều vector Vi khuẩn E.coli đáp ứng các yêu cầu của tếbào chủ lý tưởng và được sử dụng nhiều trong kỹ thuật tạo và tách dòng gen Dotính chất đặc biệt của tế bào chủ lý tưởng nên E.coli được nghiên cứu tỷ mỷ về cơchế di truyền, phân lập và tạo nên nhiều chủng khác nhau Các nghiên cứu đó làm

cơ sở cho kỹ thuật DNA tái tổ hợp và công nghệ di truyền

E.coli là vi khuẩn gram âm, có hình que (dài khoảng 1 micromet), khônggây bệnh, thường gặp trong ruột người E.coli có 1 nhiễm sắc thể (phân tử DNA)dạng vòng nằm trong vùng nhân Kích thước của các phân tử DNA này khoảng4x106 cặp bazo Các quá trình biểu hiện của gen như phiên mã, dịch mã được xảy

ra đồng thời Sau khi mARN được tổng hợp sẽ được sử dụng ngay để dịch mã màkhông qua các bước sữa đổi sau phiên mã vì gen của chúng không có các intron(đoạn không mã hóa) Do vậy, E.coli được coi là tế bào chủ đơn giản nhất Rất

nhiều thí nghiệm tách dòng gen ở các phòng thí nghiệm đang sử dụng E.coli là tếbào chủ.

Ngoài E.coli, một số vi khuẩn khác cũng được dùng làm tế bào chủ chocác thí nghiệm tách dòng gen như: Bacillus, Pseudomonas và Streptomyces…tuynhiên những tế ào chủ này có những hạn chế nhất định Những tế bào chủ này cầnđồi hỏi những vector thích hợp, nên việc đưa các DNA tái tổ hợp vào chúng gặpnhiều khó khăn

III.2 Tế bào chủ nhân chuẩn

Một trong những nhược điểm cơ bản khi sử dụng E.coli làm tế bào chủ đểtách dòng gen vì nó là sinh vật nhân sơ không có màng bao bọc NST Do vậy cácgen ở sinh vật nhân chuẩn không thể biểu hiện được trong E.coli vì môi trườngkhác với môi trường bình thường của gen sinh vật nhân chuẩn Như vậy, nếuchúng ta muốn sản xuất một loại protein nhân chuẩn trong một thí nghiệm táchdòng thì khó có thể tin rằng E.coli mang DNA tái tổ hợp có thể sản sinh ra protein

có chức năng đầy đủ như protein nhân chuẩn mong muốn

Các tế bào chủ nhân chuẩn có phổ tồn tại rất rộng từ các vi sinh vật nhânchuẩn bậc thấp như nấm men, nấm mốc, tảo cho đến các tế bào sinh vật đa bàophức tạp như động vật, thực vật

III.2.1 Tế bào nấm men (Saccharomyces cerevisiae)

Nấm men S.cerevisiae được sử dụng làm tế bào chủ một cách rộng rãitrong công nghệ di truyền vì nhiều lí do:

- S.cerevisiae là vi sinh vật nhân chuẩn đơn bào (kích thước khoảng 5micromet) đã được nghiên cứu tỷ mỷ về đặc điểm di truyền, sinh lý Nấmmen S.cerevisiae dễ nuôi cấy với quy mô lớn để thu sinh khối tế bào

- Một số S.cerevisiae có khởi điểm ( promoter) mạnh và có plasmid dùnglàm vector YAC biểu hiện gen

- S.cerevisiae có khả năng thực hiện các biến đổi sau dịch mã như đườnghóa, phosphoril hóa… để protein có đầy đủ các hoạt tính sinh học.

- S.cerevisiae bình thường tổng hợp ít loại protein của bản thân nó, nếuđưa gene lạ tổng hợp protein mới thì sản phẩm dễ tinh sạch

- S.cerevisiae là loài nấm men được sử dụng rộng rãi trong lên men bánh

mì, lên men rượu, bia Do đó nó được công nhận là vi sinh vật an toàn,hầu như không tạo ra độc tố

- Hệ gen của S.cerevisiae có khoảng 1,35x107 cặp bazo đã được giải trình

tự vào năm 1996 và có kích thước nhiều hơn E.coli khoảng 3,5 lần

Các vi nấm khác cũng được sử dụng làm tế bào chủ trong các thí nghiệm tạo dònggen như nấm mốc Aspergillus nidulans, Neurospora crassa, hoặc pechia pastoris Vector biểu hiện gen ở tế bào S.cerevisiae cũng như ở sinh vật nhân chuẩn khácchúng bao gồm khởi điểm (P- promoter), điểm kết thúc ( T- terminator), khởi điểmsao chép của E.coli (ori E); khởi đầu sao chép ở tế bào Eukaryota ( orieuk); các genđánh dấu chọn lọc (ESM); các vị trí nhận biết của enzyme giới hạn (MCSmulticloning site: điểm tách dòng)

III.2.2 Các tế bào chủ thực vật

Một số loại tế bào thực vật được sử dụng làm tế bào chủ thực vật trong cácthí nghiệm thao tác gen Tảo đơn bào, ví dụ như laoif Chramydomonas rainhardii

có tất cả những đặc tính ưu việt của vi sinh vật cộng với cấu trúc và chức năng của

tế bào thực vật Do vậy tảo đơn bào được sử dụng ngày càng nhiều trong các thínghiệm taho tác di truyền, trong công nghệ di truyền Tuy nhiên, người ta cũng còndùng các tế bào thực vật nuôi cấy trong những môi trường thích hợp có thể dùnglàm tế bào chủ

III.2.3 Các tế bào chủ động vật

Các tế bào động vật nuôi rất phức tạp, nhưng trong những điều kiện cầnthiết cho sự biểu hiện ra các protein có hoạt tính sinh học, người ta vẫn sử dụng tếbào chủ động vật Các tế bào chủ động vật bao gồm:

- Tế bào thận của khỉ xanh Châu Phi (Afirican green monkey kidney)

- Tế bào thận chuột đồng nhỏ (Baby hamster kidney)

- Tế bào thận phôi người (Human embryonic kidney)

- Tế bào tử cung chuột bạch (Chinese hamster ovary)

- Tế bào côn trùng để nuôi Baculovirus biểu hiện protein người

- Tế bào tuyến trùng Caenorhabditis elegans

CHƯƠNG 4: TẠO, TÁCH VÀ CHỌN LỌC DÒNG DNA TÁI TỔ HỢP

Trong phần trước chúng ta đã biết có 2 yếu tố quan trọng trong công nghệ DNA tái

tổ hợp: khả năng sử dụng các enzyme để cắt nối các phân tử DNA invitro và hệthống các tế bào vật chủ để đưa DNA tái tổ hợp vào tế bào chủ nhằm nhân lên với

số lượng lớn bản sao trong tế bào chủ Mỗi tế bào chủ khi phân bào tạo nên mộtdòng tế bào chứa bản sao của một gen cần thiết, đó là tách dòng gen ( genecloning)

Một thí nghiệm tách dòng phụ thuộc vào mục tiêu chủ đạo của thí nghiệm vànguồn nguyên liệu dùng để tách chiết axit nucleic cho việc tách dòng

IV.1 Tạo plasmid tái tổ hợp

IV.1.1 Tạo nguồn gen

Bước đầu của việc tạo plasmid tái tổ hợp là cần phải thu được nguồn gen

Có 3 phương pháp khác nhau để thu nhập gen:

a Thu nhập DNA từ hệ gen ( thư viện gen)

Đây là phương pháp thường dùng ngay từ giai đoạn đầu tiên phát triểncông nghệ DNA tái tổ hợp Toàn bộ các phân tử DNA của một loài sinh vật đượctách thành các đoạn nhỏ bằng cách lắc cơ học, hoặc dùng enzyme giới hạn Côngđoạn sau đó là gắn các đoạn này vào plasmid Phương pháp này được sử dụngngân hàng DNA của cả hệ gen Ví dụ, việc lập ngân hàng hệ gen của người đượctiến hành như sau: Đầu tiên tách hệ gen người thành các đoạn DNA dài 300-400kbrồi gắn vào các vector YAC, hoặc BAC để tạo dòng Từ các dòng 300-400kb lại lạicắt thành các đoạn DNA dài từ 30-40kb rồi gắn vào các cosmid Từ đoạn 30-40kblại được cắt thành các đoạn DNA dài trung bình khoảng 4kb, sau đó gắng vào cácplasmid

b Tổng hợp gen bằng phương pháp hóa học