Tiểu luận môn Sinh Học Phân Tử Quá trình can thiệp RNA

Một số chức năng quan trọng của RNA: + Chức năng vận chuyển thông tin di truyền + Chức năng tham gia tổng hợp và vận chuyển Protein + Chức năng hoàn thiện các phân tử RNA + Ngoài ra RNA

BỐ CỤC ĐỀ TÀI

A Đặt vấn đề

B Nội Dung

I Giới thiệu về RNAi

1 Dòng thông tin di truyền trong tế bào

2 Khái niệm và vai trò của RNAi trong tế bào

2.1 Khái niệm

2.2 Vai trò

3 Lịch sử nghiên cứu

II Khám phá cơ chế RNAi và giải thưởng Nobel y học 2006

1 Quá trình nghiên cứu khám phá ra sự can thiệp RNA của Z.Fire và C.Mello

1.1 Thí nghiệm nghiên cứu

1.2 Những suy luận từ kết quả thí nghiệm :

2 Ý nghĩa của công trình nghiên cứu

III Bộ máy can thiệp RNAi

1 Các thành phần tham gia vào quá trinh can thiệp RNAi

1.1 siRNA :

1.2 miRNA :

2 Con đường hình thành các bộ máy can thiệp RNAi

2.1 Con đường hình thành siRNA :

2.2 Con đường hình thành miRNA :

3.Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA

IV Cơ chế can thiệp RNA

1 Cơ chế chung

2 Cơ chế phân tử

2.1 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA

2.2 Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA

V Những thành tựu và triển vọng của việc nghiên cứu ứng dụng RNAi

1 Những thành tưu khoa học ứng dụng RNAi

2 Triển vọng của việc nghiên cứu ứng dụng RNAi

C Kết Luận

Tài liệu tham khảo

A ĐẶT VẤN ĐỀ

Như chúng ta đã biết, trong tế bào có nhiều loại RNA khác nhau, mỗi loại đảm nhận một chức năng sinh hoc riêng biệt

Một số chức năng quan trọng của RNA:

+ Chức năng vận chuyển thông tin di truyền

+ Chức năng tham gia tổng hợp và vận chuyển Protein

+ Chức năng hoàn thiện các phân tử RNA

+ Ngoài ra RNA còn có các chức năng quan trọng khác

+ Đặc biệt gần đây các nhà sinh học phân tử đã phát hiện ra chức năng điều hoà biểu hiện gene của RNA

Kể từ khi khám phá ra RNAi thì việc nghiên cứu cơ chế và ứng dụng của nó ngày càng trở thành một vấn đề lý thú thu hút sự quan tâm của các nhà sinh học góp phần tạo nên cơn sốt “ Thế giới RNA – RNA word )

* Một số thuật ngữ :

+ RNAi : RNA inteference ( RNA can thiệp )

+ dsDNA : double strand DNA ( DNA mạch kép dài)

+ miRNA : micro RNA ( tiểu RNA )

+ RISC : RNA – incluced silencing complex (phức hệ tắt gene tích ứng bởi RNA)

+ Dicer : RNase III ( Một loại enzyme endonuclease )

+ siRNA : small interfeing RNA ( RNA can thiệp kích thước nhỏ )

B NỘI DUNG

I Giới thiệu về RNAi

1.Dòng thông tin di truyền trong tế bào :

Hình 1 Dòng thông tin di truyền trong tế bào

- Thông tin di truyền lưu trữ trong DNA được sao chép sang RNA và sau

đó được dùng để tổng hợp protein

- Tuy nhiên không phải mọi thông tin di truyền đều được sử dụng mà chỉ có một phần thông tin di truyền trong hệ gene được sử dụng trong mỗi loại tế bào

- Việc gene nào được biểu hiện là do cơ chế kiểm soát của bộ máy sao chép DNA sang mRNA trong quá trinh phiên mã

- Quá trình phiên mã cũng bị điều khiển bởi nhiều nhân tố khác và được con người nghiên cứu, tìm hiểu ngày càng rõ

2 Khái niệm và vai trò của RNAi trong tế bào

2.1 Khái niệm RNAi

“ RNA can thiệp ” ( RNAi ) là một hệ thống bên trong các tế bào sống , giúp kiểm soát được các gene đang hoạt động Đó là những đoạn RNA ngắn có thể ức chế sự biểu hiện của các gene có trình tự tương đồng với nó

Các phân tử RNAi này có thể gây lên các hiêu ứng:

1 Ức chế dịch mã đơn vị mRNA

2 Ức chế sự phiên mã của gene ở trong nhân

3 Phân giải mRNA

2.2 Vai trò RNAi

RNAi có rất nhiều chức năng quan trọng trong tế bào :

+ Bảo vệ tế bào chống lại gene ký sinh trùng, virut và các yếu tố di truyền

vận động ( Transposon)

+ Điều hoà biểu hiện gene

+ Điều khiển sự phát triển của tổ chức

+ Giữ gìn NST và tăng cường phiên mã

+ Có thể RNAi còn có nhiều chức năng khác mà con người chua khám phá

ra hết, và sẽ được khám phá dần dần trong tương lai

- Năm 1994 Cogoni và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm tăng màu cam của nấm Neurospora crassa

- Năm 1995 trên tạp chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu của Guo và Kemphues

đã đưa ra bằng chứng đầu tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis elegans rằng : Phân tử RNA chiều thuận ( sense RNA ) cũng gây ra sự ức chế gene

- Đến năm 1998, nhóm nghiên cứu Fire đã giải thích được điều nghịch lý này băng những thí nghiệm trên tuyến trùng C elegans

- Năm 2000, trên tạp chí Nature cũng công bố việc phát hiện hiện tượng RNAi trên loài ruồi dấm ProSophila do nhóm nghiên cứu của Richard Cathew tiến hành

- Năm 2001, lần đầu tiên RNAi được mô tả trong các tế bào động vật có vú ( Tuschl và cộng sự )

Năm 2006 giải thưởng Nobel sinh lý và y học cho phát hiện cơ chế RNAi của 2 nhà bác học Mỹ là Andrew Fire (ĐH Stanford) và Craig Mello (ĐH Massachusetts

Hình 2 2 nhà bác học Mỹ đạt giải thưởng Nobel Năm 2006

II Khám phá cơ chế RNAi và giải thưởng Nobel y học 2006

1 Quá trình nghiên cứu khám phá ra sự can thiệp RNA của Z.Fire

và C.Mello:

- Andrew Fire và Craig Mello đã tiến hành nghiên cứu về cơ chế điều khiển

biểu hiện gien ở giun tròn Caenorhabditis elegans(C.elegans.).

- Hai ông đã thực hiện hàng loạt các thí ngiệm ngoạn mục nhằm kiểm tra

kiểu hình ảnh hưởng của việc tiêm RNA vào bộ phận sinh dục của C.elegans

1.1 Thí nghiệm nghiên cứu:

Hình 3 Thí nghiệm nghiên cứu

- Tiêm các phân tử mRNA mã hoá một protein cơ bắp ( sợi “ có nghĩa “ )

=> không làm thay đổi hành vi của giun tròn

- Khi tiêm RNA “vô nghĩa” ( antisence RNA) cũng không tháy hiện tượng

1.2 Những suy luận từ kết quả thí nghiệm

- RNA chuỗi đôi có thể làm các gien ngừng hoạt động (bất hoạt gen )

- Cơ chế can thiệp RNA này mang tính đặc trưng đối với gien mang mã di truyền giống với mã di truyền của phân tử RNA được tiêm vào

- Ngoài ra, cơ chế can thiệp RNA có thể lan giữa các tế bào và thậm chí được di truyền sang đời sau Chỉ cần tiêm một lượng nhỏ phân tử RNAi cũng có thể đạt được kết quả mong muấn Do vậy, có thể coi cơ chế can thiệp RNAi là một quá trình xúc tác

1.3 Ý nghĩa khoa học của công trình nghiên cứu

- Công trình nghiên cứu này của hai nhà bac hoc Z.Fire và C.Mello đã được công bố trên tạp chí Nature vào ngày 19/2/1998

- Kết quả của nghiên cứu này vô cùng quan trọng :

+ Cung cấp lời giải thích cho các hiện tượng nghiên cứu ở thuạc vật.: Phiên

mã bổ nhiệm gen im lặng ( PTGS- post transcriptional gene silening ) => làm sáng tỏ nhiều quan sát thí nghiệm mâu thuẫn và khó hiểu trong nhiều năm trước đây

+ Đồng thời nó tiết lộ một cơ chế tự nhiên để kiểm soát dòng thông tin di truyền trong tế bào

+ RNAi được sử dụng trong khoa học cơ bản nghiên cứu chức năng của gene

+ Với nghiên cứu mới này , giới khoa học cũng đang tìm ra các ứng dụng của RNAi trong những nghiên cứu y học chữa bệnh băng liệu pháp gene, các ứng dụng trên cây trồng, vật nuôi trong nông nghiệp nhằm tạo ra các sản phẩm với chất lượng tốt hơn

+ Từ kết quả của nghiên cứu này đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu và được tạp chí Science bình chọn là “ Break Through in 1998 “(Bước đột phá của năm 1998 ) dựa theo số lượng ra tăng cấp số nhân các bài báo khoa học đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế hàng đầu

III Bộ máy can thiệp RNA

1 Các thành phần tham gia vào quá trinh can thiệp RNAi

Quá trình can thiệp RNAi được thực hiện bởi 2 cơ chế :

+ siRNA

+ miRNA

1.1 siRNA : các thành phần tham gia

- dsRNA ( double strand RNA – RNA sợi đôi ) : là những đoạn RNA dài mạch kép có trình tự bổ xung với gene đích ( target RNA ) có 2 đầu thò là 3’OH

- Dicer : là một loại enzyme endonuclease ( Ribonuclease III ) chịu trách nhiệm hoàn thiện sợi dsRNA

- Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing complex ) : Phức hệ gắng gene kích ứng bởi RNA Phức hệ này có chứa enzyme helicase và một số protein trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut ( liên kết RNA ) hoạt động như một endonuclea và cắt mRNA

- siRNA (small interfeing RNA ) : là RNA can thiệp kích thước nhỏ được tạo ra từ dsRNA

- Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing complex ): Phức hệ gắng gene kích ứng bởi RNA Phức hệ này có chứa enzyme helicase và một số protein trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut ( liên kết RNA ) hoạt động như một endonuclea và cắt mRNA

- Hai enzyme cắt : + Drosha : ở trong nhân tế bào

+ Dicer : ở ngoài tế bào chất

2 Con đường hình thành bộ máy can thiệp RNAi

2.1 Con đường hình thành siRNA :

Quá trình hình thành siRNA diễn ra ở tế bào chất (cytoplasma )

- Các đoạn dsRNA sợi kép được cắt bởi enzyme Dicer tạo ra những đoạn RNA ngắn ( siRNA )

- Sau đó các siRNA được tháo xoắn dưới táuc dụng của enzyme helicase và biến tính thành 2 mạch đơn khi gắng với phức hệ RISC

+ Trong 2 mạch đơn này, chỉ mạch nào có đầu 5’ có hoạt lực với Agronauttrong phức hệ RISC mới gằn được với phức hệ RISC => tạo phức hợp siRNA-RISC

+ Mạch còn lại đầu 5’ không có hoạt lực với Agronaut => không liên kết với RISC được

- Sự xuất hiện của mạch đơn siRNA sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (RISC* )

Hình 4 Con đường hình thành siRNA

2.2 Con đường hình thành miRNA

- Quá trình hình thành miRNA diễn ra ở nhân tế bào (nuclear ) và trong tế bào chất ( cytoplasma)

*Trong nhân :

Các phân tử miRNA được tạo ra thông qua quá trình phiên mã từ các gen gọi là các phân tử miRNA nguyên thuỷ ( pri- miRNA ), các phân tử này có chúa các cấu trúc kẹp tóc ( hairpin )

- Các phân tử pri- miRNA được cắt bởi enzyme Drosha để tạo thành những sợi Pre- miRNA ( phân tử tiền microRNA ) => gọi là quá trình chế biến pri- miRNA

- Các phân tử Pre- miRNA sẽ được di chuyển ra ngoài tế bào chất

Hình 5 Con đường hình thành miRNA

3 Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA

Nguồn gốc

RNA mạch kép (dsRNA ) có cấu trúc là chuỗi xoắn kép

Tiền miRNA(Pre- miRNA) có cấu trúc dạng thân vòng ( steen-loop ) hay dạng kẹp tóc (hairpin)

Vị trí hình thành Xảy ra ở ngoài tế bào chất Gồm 2 quá trình trong nhân

và ngoài tế bào chất

Hình 6 Sự khác nhau giữa siRNA và miRNA

IV Cơ chế can thiệp RNA

Hình 7 Cơ chế chung

2 Cơ chế phân tử

2.1 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA

- Trong tế bào, sự biểu hiện hoặc cảm ứng của RNA mạch kép dài là kết quả của sự bắt cặp giữa mạch mang mã ( sợi có nghĩa ) và mạch đối mã ( sợi vô nghĩa )

- Các đoạn dsRNA sợi kép dài được cắt bởi enzyme Dicer tạo ra những đoạn RNA ngắn ( siRNA ) khoảng 21-28 nu

- Sau đó các siRNA được tháo xoắn dưới táuc dụng của enzyme helicase và một mạch được nạp vào phức hợp protenin một cách chon lọc gọi là phức hợp cảm ứng bất hoạt RISC

- Sự xuất hiện của mạch đơn siRNA sẽ hoạt hoá RISC thành trạng thái hoạt động (ký hiệu là RISC* )

- Cuối cùng phức hợp siRNA-RISC* này sẽ tìm kiếm các transcriptome ( sản phẩm của quá trinh phiên mã) một cách đặc hiệu và nhưng RNA mục tiêu tiềm năng

- Sợi đơn siRNA sau khi được nạp vào RISC được gọi là mạch hướng dẫn,

nó đóng vai trò chỉ đạo trong việc đưa phức hợp siRNA-RISC* đến các phân

tử mRNA có trình tự bổ xung với nó.Việc chỉ đạo của siRNA thông qua một endonuclease có trong RISC là Agronaute protein

- RISC* cũng có thể xâm nhập được vào nhân tế bào và kết cặp với trình tự tương đồng trên phân tử DNA hệ gen

Lúc này RISC* huy động một số protein làm cải biến chất nhiễm sắc quanh vị trí promoter của gene

=> không có mRNA mã hoá cho protenin đó

+ Nếu Sự tương đồng giữa siRNA và mRNA chỉ là một phần thì xu hướng xảy ra là sự ức chế dịch mã do khi chung bám trên mRNA => ngăn cản sự dịch chuyển của Ribosome trong quá trình dịch mã => quá trình dịch mã bi ngưng lại => không tạo ra được protein

Hình 8 Cơ chế làm tắt gene bởi siRNA

- Cơ chế tắt gene bởi siRNA có hiệu quả rất cao, chỉ cần một lượng nhỏ siRNA được đưa vào tế bào cố thể đủ để làm tắt hoàn toàn sự biểu hiện của một gene nào đó ( vốn có rất nhiều bản sao trong cơ thể đa bào)

2.2 Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA

- Trong tự nhiên, ngoài cơ chế điều oà biểu hiện gene bằng sợi siRNA còn

có cơ chế điều hoà biểu hiện của gene bởi một nhóm RNA khác gọi là micro RNA ( miRNA )

- Cơ chế hoạt động của miRNA trong quá trình ức chế sự biểu hiện của gene cũng tương tự như ở siRNA

- Các miRNA có chiều dài khoảng 19-24 nu được tạo từ tác động cắt các đoạn Pre- miRNA có trình tự kẹp tóc (được phiên mã từ các đoạn DNA không mã hoá protein) bởi 2 enzyme là Drosha và Dicer

- Gần 70% các miRNA được phát sinh liên quan đến sự điều tiết trong quá trình phiên mã tạo ra các mRNAvà các RNA không sinh tổng hợp các protein 30% còn lại được phát sinh độc lập không liên quan đến quá trình nhân lên ( chức năng của 30% miRNA này chua được làm rõ )

Tương tự với siRNA

+ Các miRNA có thể điều tiết sự phân giải mRNA với sự hiện diên của phức hợp RISC trong trương hợp bổ xung hoàn toàn.( ở thực vật ) ( perfect complementary)

+ Trong trương hợp bổ xung không hoàn toàn ( inperfect complementary ) với vùng 3’ UTR của mRNA =.> ức chế quá trình địch mã

Ước lượng có khoảng 120 gene mã hoá cho miRNA ở giun tròn , ở người có khoảng 250 gene và 50% gene mã hoá protein ở người đang bị kiểm xoát bởi miRNA

- Thông thường các gene miRNA được điều hoà theo kiểu chỉ biểu hiện vào những thời điểm nhất định và ở các mô nhất định trong quá trinh phát triển của cá thể

- Đáng chú ý là 30% các phân tử miRNA ở giun trong có trình tự rất giống ở ruồi giấm và động vật có vú => điều này cho thấy, dường như cơ chế điều hoà biểu hiện gene bởi miRNA đã có nguần gốc từ lâu trong quá trình tiến hoá và vai trò của chúng trong việc “ lập trình” biểu hiện của hệ gene là rất quan trọng đối với giới sinh vật

Hình 9 Cơ chế làm tắt gene bởi miRNA

V Những thành tựu và triển vọng của việc nghiên cứu ứng dụng RNAi

1 Những thành tưu khoa học ứng dụng RNAi

1.1 Trong nông nghiệp

- Tạo Hoa Hồng Xanh:

Hình 10 Sự hình thành màu hoa hồng ở hoa

Hình 11 Cơ chế hình thành màu hoa hồng ở hoa hồng xanh của Florigene

Hình 12 Hoa hồng xanh

1.2 iRNA với ung thư

Trong những năm gần đây, ARN can thiệp (iRNA) đã nổi lên như là một

cơ chế quản lý lớn trong biểu hiện gene ở sinh vật có nhân điển hình Người

ta hiểu rằng thay đổi ở các cấp độ trong quá khứ liên quan trực tiếp đến bệnh ung thư và các gene đột biến gây ung thư (oncogene) Hơn nữa, can thiệp RNA đã được biến thành một công cụ mạnh cho biểu hiện gene nhân tạo điều chỉnh thông qua sự biểu hiện của RNA can thiệp có kích thước nhỏ (siRNA) Những công cụ này giúp phân định vai trò của các yếu tố di động trong oncogenesis và ức chế khối u, đặt nền móng cho các phương pháp tiếp cận mới trong phát hiện gene Hơn nữa, thành công ức chế sự phát triển của

tế bào ung thư bằng cách can thiệp ARN nhằm tới oncogene in vitro và in vivo hỗ trợ nhiệt tình tiềm năng cho các ứng dụng điều trị của kỹ thuật này Theo Pai SI, Lin YY, Macaes B, Meneshian A, Hưng CF, Wu TC - Bộ môn Tai Mũi Họng và Phẫu thuật cổ - Đại học Y khoa Johns Hopkins, Baltimore,

Mỹ (2006), can thiệp ARN (iRNA) là một quá trình mạnh mẽ đầy hứa hẹn trong lĩnh vực điều trị ung thư Việc phát hiện ra can thiệp ARN đã tạo ra động lực trong cộng đồng khoa học, không chỉ vì nó đã được sử dụng để nhanh chóng xác định các phân tử quan trọng tham gia vào nhiều quá trình mắc bệnh, bao gồm ung thư, mà còn vì can thiệp RNA có tiềm năng được trở thành một công nghệ với các ứng dụng lớn trong điều trị Nhiều sản phẩm gene liên quan đến ung thư đã được khám phá như là mục tiêu cho ARN can thiệp Trong hầu hết các nghiên cứu, sự im lặng của sản phẩm gene quan trọng nhờ công nghệ iRNA đã tạo ra ảnh hưởng đáng kể chống lại