Tiểu luận môn Sinh Học Phân Tử ARN CAN THIỆP

Đó là những đoạn RNA ngắn có thể ức chế sự biểu hiện của các gene có trình tự tương đồng với nó.. Các phân tử RNAi này có thể gây lên các hiêu ứng: ức chế dịch mã đơn vị mRNA, ức chế sự

ĐẠI HỌC HUẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

-TIỂU LUẬN

HỌC PHẦN: SINH HỌC PHÂN TỬ

Đề tài:

ARN CAN THIỆP

Giảng viên hướng dẫn: Học viên thực hiện:

PGS.TS Nguyễn Bá Lộc Phạm Thị Việt Hà

Lớp: Thực vật học - K22

Huế, 01/2014

A ĐẶT VẤN ĐỀ

RNA Can thiệp (RNA inteference, RNAi) là một trong những đột phá công nghệ quan trọng nhất trong sinh học hiện đại Phát minh RNA can thiệp – một cơ chế điều khiển hoạt hóa gen mới, mang tính đặc thù cao và tính phổ biến rộng ở sinh vật nhân chuẩn RNAi có thể làm ngừng hoàn toàn ( knock out) hoặc làm giảm ( knock down) biểu hiện của gen đặc thù Hoạt động của RNAi làm cho cơ thể phân hóa và phát triển bình thường, có khả năng miễn dich với các tác nhân gây bệnh nhất là virus Dựa trên cơ chế này, khoa học hiện đại đã biến chúng thành một công cụ để chữa bệnh và chống lại các tác nhân gây bệnh ở thực vật, động vật

B NỘI DUNG

I GIỚI THIỆU VỀ RNA CAN THIỆP

1 Khái niệm RNAi

RNA can thiệp ( RNAi, RNA interference ) là một hệ thống bên trong các tế bào sống , giúp kiểm soát được các gene đang hoạt động Đó là những đoạn RNA ngắn có thể ức chế sự biểu hiện của các gene có trình tự tương đồng với nó

Các phân tử RNAi này có thể gây lên các hiêu ứng: ức chế dịch mã đơn

vị mRNA, ức chế sự phiên mã của gene ở trong nhân, phân giải mRNA

2 Lịch sử nghiên cứu

Năm 1984, Pesthea và các cộng sự đã nghiên cứu kỹ thuật RNA trên vi khuẩn Escherichia Coli được đăng trên tạp chí PNAS số 81 Trong nghiên cứu này một cấu trúc plasmid được thiết kế để tổng hợp đoạn

Antiense-RNA bổ sung cho phân tử mAntiense-RNA beta-galactosidase dưới sự điều khiển của một promoter PL Khi phân tử RNA chiều ngược (antisense RNA) được hình thành thì các nhà khoa học quan sát được rằng sự tổng hợp protein beta-galactosidase bị ức chế gần như hoàn toàn (98%) Tuy nhiên trong giai đoạn này các nhà khoa học vẫn chưa hình dung được cơ chế nào gây ra sự

Năm 1994, Cogoni và cộng sự đã tiến hành thí nghiệm tăng màu cam của nấm Neurospora crassa thông qua việc chuyển một gen có chức năng tạo

ra carotenoid Tuy nhiên thay vì tạo ra màu cam như mong muốn thì nấm hầu như không thể hiện Hiện tượng này được các nhà khoa học đặt tên là

"quelling"

Năm 1995, trên tạo chí Cell số 81, nhóm nghiên cứu của Guo và Kemphues đã đưa ra bằng chứng đều tiên trên tuyến trùng Caenorhabditis

elegans rằng phân tử RNA chiều thuận vẫn có thể gây ra ức chế gen với hiệu quả tương đương với phân tử RNA chiều ngược Trong thí nghiệm này các tác giả đã tiêm phân tử RNA chiều ngược vào trong C.elegans để ức chế gen par-1 nhằm xác định chức năng của gen này và đồng thời cũng tiến hành thí nghiệm tương tự với phân tử RNA chiều thuận Kết quả là các phân tử RNA của cả hai chiều đều ức chế sự biểu hiện của gen par-1 Điều này gây ra một

sự lúng túng bởi vì điều mong đợi nhất của các nhà khoa học là phân tử RNA sẽ bắt cặp với mRNA chiều thuận (sense mRNA) của gen par-1 nhằm

ức chế khả năng mã hóa protein của nó

Phải đến 3 năm sau, năm 1998, nhóm nghiên cứu của Fire đã giải thích được điều nghịch lý này bằng những thí nghiệm cũng trên tuyến trùng C.elegans Mục đích của những thí nghiệm này là kiểm tra xem sự hỗ trợ lẫn nhau giữa các phân tử RNA theo cả hai chiều trong quá trình ức chế sự biểu hiện của gen Kết quả là phức chất dsRNA ức chế sự biểu hiện của gen gấp

10 lần so với việc dùng phân tử RNA đơn lẻ theo chiều thuận hay chiều nghịch Hơn thế nữa khi loại bỏ dsRNA thì các phân tử đơn RNA theo chiều thuận hay chiều nghịch dần dần mất tác dụng ức chế gen Như vậy nhóm nghiên cứu của giáo sư Fire đã xác định được nguyên ngân chủ yếu của hiện tượng RNA silencing chính là do phân tử dsRNA gây nên Hiện tượng này được các nhà khoa học đặt cho một thuật ngữ là RNA interference (RNAi) Việc tiêm mRNA mã hóa protein cơ không gây ra sự thay đổi nào ở giun

Mã di truyền của mRNA được mô tả như là một trình tự “có ý nghĩa” (sense) Việc tiêm RNA “vô nghĩa” (antisense), một trình tự bổ sung với mRNA, cũng không mang lại tác động nào Nhưng khi Fire và Mello tiêm RNA “có ý nghĩa” và “vô nghĩa” cùng với nhau thì họ quan sát thấy giun có

những biểu hiện co giật đặc trưng Những biểu hiện tương tự cũng được ghi nhận ở các giun bị khuyết hoàn toàn gene chức năng mã hoá cho protein cơ

Hình 1 Thí nghiệm của Andrew Fire và Craig MelloKhi phân tử RNA “có ý nghĩa” và “vô nghĩa” gặp nhau, chúng bổ sung cho nhau và hình thành nên RNA sợi đôi Có phải phân tử RNA sợi đôi

có khả năng gây bất hoạt gene mang cùng mã di truyền với nó? Fire và Mello đã kiểm tra giả thuyết này bằng cách tiêm các phân tử RNA sợi đôi chứa mã di truyền mã hóa cho một số protein khác ở giun tròn Ở mỗi thí nghiệm, RNA sợi đôi đã làm bất hoạt gene tương ứng mang mã di truyền giống nó Protein được mã hóa bởi gene đó không còn được hình thành nữa

Một số kết luận rút ra từ kết quả thí nghiệm: (1) Chỉ có RNA sơi kép (dsRNA) có khả năng gây bất hoạt gen một cách hiệu quả, RNA sợi đơn sense hoặc antisense chỉ có khả năng gây bất hoạt yếu hoặc không có khả năng gây bất hoạt gen (2)DsRNA gây bất hoạt một cách rất đặc thù, nó chỉ phân hủy một phân tử mRNA có các trình tự tương đồng với nó, các phần tử mRNA khác không bị ảnh hưởng (3)Các sợi dsRNA chỉ có khả năng gây

bất hoạt gen khi có trình tự tương đồng với mRNA đã thành thục (mature RNA) ( tức là mRNA đã ở ngoài tế bào chất và không còn mang các trình tự intron); các trình tự RNA tương đồng với intron hoặc Promotor đều không

có tác dụng điều này cho thấy dsRNA gây bất hoạt ở giai đoạn sau phiên mã (post - trascriptional gene silencing) và xãy ra ở tế bào chất (4)Phân tử mRNA đích biến mất, chứng tỏ nó đã bị phân hủy (5)Chỉ cần một vài phân

tử dsRNA trong một tế bào là đủ để hoàn thành quá trình phân hủy mRNA Điều này chứng tỏ dsRNA đã bđược nhân bản và tác dụng như một tác nhân xúc tác (6)Tác động của dsRNA có thể được lan rộng từ mô này sang mô khác và thậm chí được cac thế hệ sau điều này chứng tỏ khả năng lan truyền,

“ di căn” giữa các tế bào

Năm 2006 giải thưởng Nobel sinh lý và y học cho phát hiện cơ chế RNAi của 2 nhà bác học Mỹ là Andrew Fire (ĐH Stanford) và Craig Mello (ĐH Massachusetts)

Ý nghĩa khoa học của công trình nghiên cứu:

+ Cung cấp lời giải thích cho các hiện tượng nghiên cứu ở thưc vật:

Phiên mã bổ nhiệm gen im lặng ( PTGS- post transcriptional gene silening )

từ đó làm sáng tỏ nhiều quan sát thí nghiệm mâu thuẫn và khó hiểu trong nhiều năm trước đây

+ Đồng thời nó tiết lộ một cơ chế tự nhiên để kiểm soát dòng thông tin

di truyền trong tế bào

+ RNAi được sử dụng trong khoa học cơ bản nghiên cứu chức năng của gene

+ Với nghiên cứu mới này , giới khoa học cũng đang tìm ra các ứng dụng của RNAi trong những nghiên cứu y học chữa bệnh băng liệu pháp gene, các ứng dụng trên cây trồng, vật nuôi trong nông nghiệp nhằm tạo ra các sản phẩm với chất lượng tốt hơn.

+ Từ kết quả của nghiên cứu này đã mở ra nhiều hướng nghiên cứu

và được tạp chí Science bình chọn là “ Break Through in 1998 “(Bước đột phá của năm 1998 ) dựa theo số lượng ra tăng cấp số nhân các bài báo khoa học đăng trên các tạp chí khoa học quốc tế hàng đầu

Năm 2000, trên tạp chí Nature cũng công bố việc phát hiện hiện tượng RNAi trên loài ruồi dấm ProSophila do nhóm nghiên cứu của Richard Cathew tiến hành Nhóm nghiên cứu đã chứng minh rằng tiêm phân tử dsRNA vào trong các phôi tế bào của ruối hay dùng súng bắn gen dẫn đến hiện tượng silencing hiệu quả hơn là dùng các tế bào yeast chứa các dsRNA cho ruồi dấm ăn Bằng phương pháp tiếp cận này mà nhóm nghiên cứu của Cathew đã ức chế được khoảng 20 gen của loải ruồi dấm bao gồm frizzled2

và wingless liên quan đến sự hình thành và phát triển của cánh Cùng lúc đó nhóm nghiên cứu của giáo sư Hannon ở phòng nghiên cứu Cold Spring Habor, New York, USA cũng đã thành công trong việc ức chế sự biểu hiện của 2 gen cyclinE và myc liên quan đến chu trình phát triển và phân chia tế bào của ruồi dấm bằng phương pháp RNAi

Trên đối tượng thực vật, kể từ khi phát hiện hiện tượng

"cosuppression" trên hoa petunia thì việc ức chế các gen tương đồng chuyên biệt (homology dependent gene silencing) hay được viết tắt là HDGS được xem là rất phổ biến trên cây trồng Hiện tại có hai khái niệm về hiện tượng HDGS bao gồm TGS (transcriptional gene silencing) và PTGS (post-

transcriptional gene silencing) Đối với trường hợp ức chế gen theo kiểu TGS thì các gen chuyển vào sẽ không được phiên mã bởi vì đoạn promoter

bị ức chế do cơ chế methyl hóa DNA (DNA methylation) Trong khi đó ức chế gen theo kiểu PTGS thì các mRNA của gen chuyển vào thực sự bị suy giảm trong suốt quá trình phiên mã do cơ chế ức chế gen Gần đây các nhà khoa học đã khám phá ra rằng hiện tượng PTGS không chỉ xuất hiện trên cây trồng mà còn xuất hiện trên nấm, động vật v.v Bằng việc khám phá vai trò của dsRNA liên quan đến việc phân hủy các mRNA trong suốt quá trình tìm hiểu cơ chế của RNAi và PTGS người ta đã nhận ra rằng cơ chế chung ảnh hưởng đến biểu thị của gen đối với quá trình quelling, cosupression, RNAi hay PTGS đều tương tự như nhau vì trong cơ chế của chúng đều có sự hiện diện của phân tử siRNA (small intefering RNA) dẫn đến việc hình thành các phức chất siRNA-RISC và cuối cùng là sự phân hủy các phân tử RNA dẫn đến việc ức chế sự biểu hiện kiểu hình của gen Tựu chung lại người ta đặt một thuật ngữ mới là RNA silencing

3 Ý nghĩa của việc phát hiện ra RNAi

a Can thiệp RNA chống lại sự nhiễm virus

Phát hiện của Fire và Mello tế bào có thể hoàn thiện tiêm RNA mạch kép và loại trừ RNA mạch đơn tương đồng giúp đề xuất can thiệp RNA cấu tạo nên cơ chế bảo vệ chống lại sự xâm nhập của virus Tế bào thực vật có

cơ chế bảo vệ chống lại sự xâm nhập của virus dựa trên hiện tượng gen im lặng PTGS , đề xuất ứng dụng của can thiệp RNA liên quan tới sự bảo vệ tế bào chống lại sự xâm nhập của virus

b Can thiệp RNA bảo đảm ổn định hệ gen

Người ta đã đề xuất sớm rằng RNAi/PTGS ở C.elegans và thực vật

có thể cản trở hoạt động của transposon (các nhân tố di động trong hệ gen) Tiếp theo, có thể nhận thấy trong cơ chế can thiệp RNA bị đột biến ở C.elegans, transposon được hoạt hóa và nhân tố di động này là nguyên nhân xáo trộn chức năng hệ gene Từ đó các nhà khoa học đề xuất rằng transposon-chứa đựng những vùng hệ gen chứa cả mạch DNA được phiên

mã, RNA mạch kép được định dạng và quá trình can thiệp RNA loại trừ những sản phẩm không phù hợp Như thể là RNA mạch kép ngắn cũng có thể chỉ đạo điều hành nhiễm sắc tử và tăng cường phiên mã, điều này sẽ gây nên sự bất hoạt transposon Ngay nếu như cơ chế này vẫn chưa sảy ra, thì rõ ràng rằng nếu cơ chế can thiệp RNA không có hiệu lực, các transposon không bi giữ lại bởi kiểm soát dưới, nó có thể bắt đầu nhảy và là nguyên nhân của hiệu ứng có hại của hệ gen

Điều đó chứng tỏ RNA im lặng có thể tái hiện một sự "bảo vệ miễn dịch" của hệ gene Gần 50% hệ gene chúng ta có virus và nhân tố transposon

mà chúng phải xâm lấn hệ gene chúng ta trong một khóa học tiến hóa Cơ chế can thiệp RNA có thể nhận ra sự xấm lấn của virus RNA mạch kép (hoặc mạch kép sao chép định dạng từ virus RNA) và tăng cường lây nhiễm bởi sự suy thoái RNA Hệ thống can thiệp RNA vì thế chia sẻ những điểm đặc biệt quan trọng với hệ thống miễn dịch động vật có xương sống: nó nhận

ra các điểm xâm lấn (RNA mạch kép), nuôi dưỡng các phản ứng đáp ứng ban đầu và tiếp theo khuyếch đại để loại trừ nhân tố ngoại lai

c Can thiệp RNA như cơ chế kiểm soát quá trình tổng hợp protein và điều khiển sự phát triển.

Ngay sau khi khám phá ra RNA ngắn là hiệu ứng của can thiệp RNA, người ta nhận thấy rằng có một lớp RNA trong hệ gene cùng một kích thước

ở sâu bọ có cánh, ở chuột và người; RNA nhỏ này gọi là microRNA (miRNA) Thực vật cũng chứa đựng một lớp phân tử RNA này trong hệ gene Sự soi rạng cơ chế hoạt động của miRNA mở đầu cho những nghiên cứu sôi nổi trong tự nhiên về lớp phân tử RNA này Các RNA của C.elegans-lin4 và let7.RNAs được chú ý như nguyên mẫu, và những ví dụ cho trường hợp thỉnh thoảng phát giác ở một vài tổ chức miRNA nhỏ được hoàn thiện từ thể kẹp tóc lớn hơn-như điềm báo trước từ can thiệp RNA-như

cơ chế miRNAs có thể điều hòa biểu hiện gene bằng cách bắt cặp base với mRNA, kết quả là suy thoái mRNA hay tăng cường dịch mã.Hiện nay,ước lượng có khoảng 500 miRNAs ở tế bào động vật có vú,và khoảng 30% điều hòa bởi miRNAs Điều đó cho biết miRNAs đóng vai trò quan trọng trong suốt qua trình phát triển ở thực vật, C.elegans và động vật có vú Vì thế, miRNAs phụ thuộc biểu hiện gene đặc trưng cho nguyên tắc cơ bản mới của điều hòa gene Tuy nhiên, ý nghĩa đầy đủ của RNAs điều hòa nhỏ có lẽ vẫn chưa rõ ràng

d Can thiệp RNA như cơ chế bảo vệ nhiễm sắc tử cô đặc và tăng cừơng phiên mã

Những nghiên cứu ở thực vật cho thấy gene im lặng có thể chỉ dừng biểu hiện ở mức độ phiên mã (TGS) Sau khi khám phá ra can thiệp RNA, trong những thí nghiệm tiếp theo người ta thấy TGS ở thực vật điều hành thông qua can thiệp RNA như cơ chế Ở nấm sinh sản bằng cách phân đôi Schizosaccharomyces pombe , muộn hơn là ruồi giấm và động vật có xương sống, đôi khi có những quá trình giữ cho vùng dị nhiễm sắc được cô đặc và

tăng cường phiên mã Thêm vào đó, cơ chế can thiệp RNA điều hòa hoạt động những gene nằm trực tiếp kế bên khối nhiễm sắc đặc Hiện tượng này khó giải thích ở mức độ phân tử, mặc dù quá trình biến đổi histone - vị trí bám chuyên biệt của protein làm cô đặc nhiễm sắc thể (HP1) và methyl hóa DNA đều đóng vai trò quan trọng Tuy thế, hoạt động này trên nhiễm sắc tử

là khá quan trọng cho chức năng chính xác của hệ gene và bảo quản hệ gene được nguyên vẹn

e Can thiệp RNA cống hiến một phương pháp mới để kiềm chế gene chuyên biệt

Mục tiêu hoạt động của can thiệp RNA trực tiếp đề xuất rằng hiện tượng này có thể sử dụng như một phương pháp kiểm soát hoạt động của gen với kiểu hình có thể dự đoán trước nhờ đó mà có thể nghiên cứu được chức năng của các gen chưa biết trong tổ chức Sau những nghiên cứu ban đầu được tìm thấy ở C.elegans, kỹ thuật này gần như có thể ứng dụng được trên một phạm vi rộng , từ tế bào đến hầu hết các tổ chức khác, kể cả tế bào động vật có vú Can thiệp RNA vừa có một ý nghĩa to lớn trong việc nghiên cứu chức năng các gene riêng biệt Kỹ thuật này bây giờ được khai thác không những trong nuôi cấy tế bào mà còn trong cấy chuyển gene Khung DNA được gửi gắm vào trong các tổ chức dưới sự kiểm soát của đoạn khởi động (promoter), và RNA mạch kép cấu trúc thể kẹp tóc được sản xuất và hoàn thiện hơn nữa để đạt tới những hiệu ứng chuyên biệt trong điều hòa hoạt động gene

f Can thiệp RNA đã đề xuất một giải pháp hiệu quả trong điều trị bệnh di truyền trong tương lai

Khả năng can thiệp của RNA chi phối điều hoà hoạt động gene đặc biệt là trong cấy chuyển gene đã khuyến khích những nghiên cứu sâu hơn về vaan đề này, mặt khác có thể là một lựa chọn hữu dụng trong điều trị y học Những kết quả hứa hẹn đã được công bố ở một vài động vật thí nghiệm và ngay cả trong những thử nghiệm lâm sàng gần đây được tiến hành trên người, nhưng vẫn chưa thể khẳng định trước nói trước kết quả của những thử nghiệm này.

Sự khám ra một cơ chế tăng cường biểu hiện của các gene trong tế bào có cấu trúc tương đồng bằng việc nhận ra và hoàn thiện mạch kép RNA

đã mở rộng hiểu biết của chúng ta về kiểm soát hoạt động của gene Đặc biệt, cơ chế can thiệp RNA có thể sử dụng RNA mạch kép vào trong tế bào như là RNA mạch kép thế hệ sau trong tế bào Sự phát triển của một tổ chức

và chức năng chính xác của mỗi tế bào và mô tùy thuộc vào một cơ chế can thiệp RNA còn nguyên vẹn Sự nhiễm virus RNA có thể bị cản trở bởi can thiệp RNA, đăc biệt ở thực vật và động vật bậc thấp, những nhân tố AND ngoại lai trong hệ gene (virus và transposon) có thể bị giữ im lặng

II CƠ CHẾ ARN CAN THIỆP

1 Các thành phần tham gia vào quá trinh can thiệp RNAi

* Các thành phần cơ bản tham gia vào quá trinh can thiệp RNAi:

+ SiRNA (small interfeing RNA ) và miRNA, trong đó siRNA (small interfering RNA) là RNA can thiệp kích thước nhỏ khoảng 20-25 nu được tạo ra từ dsRNA và miRNA là những đoạn RNA ngắn khoảng từ 19 – 24 nu không tham gia vào quá trình tổng hợp protein

+ dsRNA ( double strand RNA – RNA sợi đôi ) : là những đoạn RNA dài mạch kép có trình tự bổ xung với gene đích ( target RNA ).

+ Dicer: là một ribonuclease thuộc họ Rnase III, đây là một multidomain protein, có khối lượng phân tử khoảng 200 kDa Dicer có khả năng phân cắt các RNA mạch kép và tiền microRNA (miRNA) thành những đoạn RNA mạch kép ngắn gọi là siRNA

+ Phức hệ RISC (RNA – incluced silencing complex ): Phức hệ gắng gene kích ứng bởi RNA Phức hệ này có chứa enzyme helicase và một số protein trong đó quan trọng nhất là protein thuộc họ Agronaut ( liên kết RNA ) hoạt động như một endonuclea và cắt mRNA

Quá trình can thiệp RNAi được thực hiện bởi 2 cơ chế : siRNA và miRNA Ngoài những yếu tố trên, bộ máy RNA can thiệp thông qua miRNA còn chứa một số thành phần: Pri- mRNA( primary-mRNA ) là chuỗi mRNA nguyên thuỷ, dài hàng nghìn nu và mang đầu 5’CAP, đuôi poly A chứa ít nhất một hay nhiều vòng kẹp tóc ( hairpin ) mỗi vòng dài khoảng 70 nu; Hai enzyme cắt: Drosha hoạt động ở trong nhân tế bào và Dicer hoạt động ở ngoài tế bào chất

2 Cơ chế RNA can thiệp

a Cơ chế chung