Tìm hiểu phương pháp Lai Phân Tử

Trường Đại Học Công Nghiệp Thực Phẩm TPHCM Khoa Công Nghệ Thực Phẩm • • • • Bộ mơn : Phân Tích Vi Sinh Thực Phẩm GVHD : Nguyễn Thị Mỹ Lệ Đề tài : Lai Phân Tử Nhóm : 12, Tiết 9-10, thứ Nội dung • • • • • I Lịch sử lai phân tử II Khái niệm lai phân tử III Các phương pháp lai phân tử IV Ứng dụng lai phân tử V Ví dụ lai phân tử I Lịch sử lai phân tử • • 1960 Julius Marmur đồng nghiệp ông quản lý, ngành học đại học Harvard khám phá trình ủ lại (reannealing) Quá trình bao gồm kết hợp lại mạch đơn thành phân tử mạch đơi bền vững Từ khám phá q trình reannealing, phương pháp lai sour nucleic phát triển Sử dụng kỹ thuật mạch bổ sung từ nguồn khác acid nucleic trộn lẫn thành dạng phân tử mạch đôi đặt tên thể lai (hybrid) • • II Khái niệm lai phân tử Sau hai mạch phân tử DNA tách rời tác động Tm, bắt cặp không xảy nhiệt độ phản ứng hạ xuống đột ngột Lúc phân tử DNA tồn môi trường dạng mạch đơn cấu hình khơng gian vơ trật tự Ngược lại, sau hai mạch tách rời, nhiệt độ giảm từ từ cộng với điều kiện thí nghiệm thích hợp, hai mạch bắt cặp trở lại Hiện tượng gọi lai phân tử (molecular hybridization) II Khái niệm lai phân tử • Đặc điểm : Đặc hiệu tuyệt đối : tái bắt cặp xảy hai trình tự hồn tồn bổ sung Các trình tự bổ sung DNA hay RNA, dẫn đến hình thành phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay phân tử lai DNA-RNA II Khái niệm lai phân tử Hình – lai DNA RNA II Khái niệm lai phân tử Nhiệt độ Nồng độ DNA thời gian phản ứng Các yếu tố Độ dài ảnh hưởng trình tự Lực ion Nồng độ DNA thời gian phản ứng - Nồng độ DNA nghĩa số lượng trình tự bổ sung cao xác suất chúng tiếp xúc với tăng, kết tốc độ phản ứng lai phân tử tăng lên - Thời gian phản ứng dài xác suất lớn số lượng phân tử lai tăng dần tồn trình tự bổ sung tái bắt cặp (lai) nhiệt độ • Tốc độ phản ứng lai phụ thuộc nhiệt độ Thông thường phản ứng lai cực đại nhiệt đố thấp Tm nucleic acid độ 25% IV.Ứng dụng lai phân tử Y học Sinh học Ứng dụng Thực phẩm Nông nghiệp Chăn ni IV Ứng dụng lai phân tử • Trong sinh học : tRNA (transfer RNA–RNA vận chuyển) tạo nhân sau tống xuất khỏi nhân lần Nhưng trưởng thành q trình chuyển vận từ nhân tế bào chất thật không đơn giản trước người ta nghĩ, thực tế phức tạp nhiều IV Ứng dụng lai phân tử • Trong y học : Đối với tác nhân gây bệnh khó ni cấy hay khơng thể ni cấy kỹ thuật sinh học phân tử giải pháp Đặc biệt phương pháp lai chỗ cho phép xác định trực tiếp virus lát cắt sinh thiết IV Ứng dụng lai phân tử • Trong nơng nghiệp : Chẩn đốn virus gây bệnh thực vật có ý nghĩa quan trọng bảo vệ trồng IV Ứng dụng lai phân tử • Trong chăn nuôi : ngành thủy sản, dùng phương pháp lai chỗ (in situ hybridization) để chẩn đốn bệnh virus đốm trắng tơm IV Ứng dụng lai phân tử • Trong thực phẩm : dùng phương pháp lai phân tử để kiểm tra thực phẩm biến đổi gen V Ví dụ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT LAI HUỲNH QUANG TẠI CHỖ TRONG CHẨN ĐOÁN TRƯỚC SINH CÁC LỆCH BỘI NHIỄM SẮC THỂ THƯỜNG GẶP Lai huỳnh quang chỗ (FISH) kỹ thuật trung gian di truyền tế bào sinh học phân tử, đầu dò đặc hiệu lai với nhiễm sắc thể (NST) kỳ giữa, và/hoặc nhân tế bào gian kỳ, nhằm phát cách xác bất thường NST Kỹ thuật lai huỳnh quang chỗ (FISH: Fluorescence insitu hybridization) Kỹ thuật trung gian di truyền tế bào sinh học phân tử, đầu dò đặc hiệu lai với nhiễm sắc thể (NST) kỳ giữa, và/hoặc nhân tế bào gian kỳ, nhằm phát cách xác bất thường NST (6) Một ứng dụng kỹ thuật FISH chẩn đoán trước sinh nhằm phát lệch bội NST thường gặp 13,18,21, X,Y (10) Đối tượng nghiên cứu: Tiến hành kỹ thuật FISH nuôi cấy NST theo phương pháp cho 28 thai phụ mang thai 17-25 tuần có nguy cao bị dị tật Phương pháp nghiên cứu:           Các thai phụ có kết siêu âm bất thường xét nghiệm ba (Triple test) thuộc nhóm nguy cao bác sỹ Sản khoa bác sỹ chuyên khoa Di truyền tư vấn phương pháp chọc hút nước ối, kỹ thuật FISH nuôi cấy tế bào ối, nguy cơ, giới hạn kỹ thuật 3.Quy trình chọc hút nước ối - Siêu âm kiểm tra thai: số đo, tim thai, vị trí bánh rau Chọn vị trí chọc kim thuận lợi (khoang ối rộng, xa phần thai, đặc biệt đầu thai nhi) - Kim chọc ối: dùng kim chọc tủy sống số 22G - Dùng bơm tiêm ml hút loại bỏ ml dịch ối để tránh lẫn tế bào mẹ - Thay bơm tiêm 20ml, hút 15-18ml dịch ối Dịch ối có màu vàng sáng, khơng lẫn máu mẹ - Mẫu dịch ối lấy vào ống Falcon 15ml vô trùng Bảo quản C từ 24 - 48h kể từ lấy mẫu Chuyển Khoa Di truyền- Bệnh viện Nhi TW làm FISH với tế bào ối trực tiếp, song song với nuôi cấy NST từ tế bào ối Mục đích ni cấy NST để kiểm chứng độ nhạy đặc hiệu kỹ thuật FISH, phát bất thường NST khác khơng nằm nhóm NST mà kỹ thuật FISH sàng lọc Kỹ thuật FISH -Xử lý bệnh phẩm: Mẫu xử lý theo quy trình thống Trypsin-EDTA 1X (Gibco),  dung dịch KCl 0.075M, dung dịch cố định Methanol.  - Tạo tiêu bản: Nhỏ cặn tế bào lên lam kính Đánh giá mật độ tế bào kính hiển vi soi ngược - Nhỏ đầu dò : 10µl đầu dò đặc hiệu cho NST 13,18,21,X,Y (Vysis) vùng tế bào đánh dấu Vùng lai với đầu dò phủ DAPI (Sigma), cuối phủ lamme 22x22mm (BDH) - Phân tích hệ thống kính hiển vi huỳnh quang với phần mềm ISIS (Metasystem) Đếm tối thiểu 50 nhân tế bào loại đầu dò Kết luận kết lai bình thường 80% nhân tế bào có tín hiệu loại đầu dò Kết luận kết lai bất thường có 30% nhân tế bào có số tín hiệu bất thường loại đầu dò   Kỹ thuật ni cấy nhiễm sắc thể từ tế bào ối           Nuôi cấy NST từ tế bào ối theo phương pháp lammen 22x22mm Thực chụp ảnh 05 cụm NST hệ thống Karyotyping (Karl Zeiss) phân tích phần mềm IKaros (Metasystem) Đếm 20 cụm kính hiển vi thường Kết Kết FISH sau 24 - 48 h thấy có trường hợp lệch bội với NST 13 trường hợp lệch bội với NST 21 01 trường hợp có bất thường nhánh dài NST 16, khơng nằm nhóm NST mà kỹ thuật FISH sàng lọc 100% kết FISH phù hợp với kết phân tích NST từ tế bào ối sau 10 ngày THANK YOUR FOR LISTENING! ...Nội dung • • • • • I Lịch sử lai phân tử II Khái niệm lai phân tử III Các phương pháp lai phân tử IV Ứng dụng lai phân tử V Ví dụ lai phân tử I Lịch sử lai phân tử • • 1960 Julius Marmur đồng... III Các phương pháp lai phân tử Lai pha lỏng Lai pha rắn Lai chỗ Gồm phương pháp Lai pha lỏng • Ngun tắc : Các trình tự bổ sung (các mạch đơn) nằm môi trường lỏng dung dịch đệm Sự lai phân tử xảy... bổ sung DNA hay RNA, dẫn đến hình thành phân tử DNA-DNA, RNA-RNA hay phân tử lai DNA-RNA II Khái niệm lai phân tử Hình – lai DNA RNA II Khái niệm lai phân tử Nhiệt độ Nồng độ DNA thời gian phản