ĐỀ TÀI TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP PCR

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP HCM KHOA CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM  Mơn: Phân tích vi sinh thực phẩm PHƯƠNG PHÁP PCR GVHD: Nguyễn Thị Mỹ Lệ Lớp: 01DHTP3 GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION(PCR) PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH SALMONELLA SPP., SALMONELLA ENTERI TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA M NỘI DUNG GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) • Là phương pháp in vitro để tổng hợp AND dựa khuôn Khái niệm Lịch sử đời nguồn gốc trình tự đích AND ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khn thành hàng triệu • Kary Mullis cộng (Mỹ) phát minh năm 1985 • Ơng đoạt giải Nobel Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu Nguyên tắc Tạo lượng lớn đoạn DNA đặc thù từ DNA phương khuôn dựa sở hoạt động DNA- pháp PCR polymerase để tổng hợp sợi bổ sung Sợi khn DNA cần biết trình tự nucleotide đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide Các yếu tố thực phản ứng PCR Đoạn DNA cần nhân phải mở xoắn thành mạch đơn, cần có cặp mồi (mồi xuôi, mồi ngược) Hai đoạn mồi ngắn để xác định điểm bắt đầu tổng hợp DNA Có đầy đủ loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq), DNA polymerase Kỹ t ậ u th g PCR g m n o đ i a i Tổng hợp mạch Biến tính ADN Bắt cặp bổ nhờ enzym ADN sung với polymerase(giai đoạn mồi ( giai kéo dài) đoạn lai) PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG 2.1.Các thành phần chủ yếu phản ứng PCR mồi CácĐoạn nucleotid Enzyme DNA-polymerase DNA mẫu DNA mẫu - DNA thật tinh sạch, đặc biệt DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào cho kết tốt nhất, nhiên sử dụng mẫu có độ tinh khơng cao để sử dụng - Mẫu DNA không dài quá, thường khuếch đại tốt đoạn DNA dài khoảng 1÷1,5kb Xác định DNA với lượng thấp, khoảng nhỏ 100 ng (1g = 109ng) VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Tổng cộng có 260 mẫu thực phẩm được mua chợ địa bàn thành phố Cần Thơ vào buổi sáng chiều: • 40 mẫu thịt heo, 40 mẫu thịt bò, 60 mẫu thịt gà, 20 mẫu lòng trắng, đỏ trứng gà, • 20 mẫu vỏ trứng gà, 20 mẫu nem chua, 20 mẫu chả lụa, 10 mẫu ba khía, 10 mẫu da heo 20 mẫu sò huyết VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguồn vi sinh vật Viện Pasteur TPHCM Các giống vi khuẩn S enteritidis, S typhimurium Viện CNSH Ðại học Cần Thơ Salmonella spp., Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus E.coli PhƯƠng pháp huẩn bị mẫu Cân 25g mẫu Thêm vào túi 225 ml dung dịch mơi trường BPW Đồng hóa mẫu máy Stomacher 30s Ủ 37oC 5h Chuyển 1ml dung dịch qua bình tam giác 50ml có chứa 9ml mơi truờng TT nuôi 42oC 4h Cho 1ml dung dịch mẫu nuôi cấy từ môi trường TT qua bình tam giác 50ml có chứa ml mơi truờng RV, ni 42oC 15h Ly trích DNA Ly trích DNA (phương pháp phenol-chroroform) • Cho vào nhựa ml dung dịch nuôi vi khuẩn, ly tâm với tốc độ 13000 vòng/p 10p • Hồ tan phần tủa với 1ml TE (10 mM Tris + mM EDTA, pH 8), ly tâm 13000 vòng/p 5p • Hồ tan phần tủa với 350µl TE, cho tiếp 30 µl lysozyme (50 mg/ml) lắc nhẹ, đặt nước đá khoảng 30p Cho vào 40µl SDS 10%, lắc dung dịch đồng Thêm 40µl proteinase K (10mg/ml), lắc ủ nhiệt độ phòng t 27-30 oC 2-3h Cho 800 àl phenol (pH=7) vào, lắc đến có màu trắng đục, ly tâm 13.000 vòng/p 10p Ly trích DNA (phương pháp phenol-chroroform) • Hút phần dung dịch phía cho vào nhựa 1.5ml có sẵn 150 µl TE Thêm vào khoảng 700 µl Phenol-Chloroform-isoamyl alcohol lắc dung dịch có màu trắng đục, ly tâm 13.000 vòng/p 10p • Sau ly tâm, chuyển phần phía sang nhựa 1.5 ml có chứa sẵn 75 µl Natri acetate (3M, pH=7.2), lắc tay Thêm vào 1ml ethanol 96 %, lắc đều, đặt nước đá 10p Ly tâm 13000 vòng/p 15p, giữ lại phần tủa Thêm ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/p 5p, làm khơ phần tủa hồ tan DNA với 30 µl nước cất vơ trùng, trữ -20oC Thiết kế đoạn mồi PCR từ vi khuẩn Salmonella • Các đoạn mồi thiết kế cho Salmonella spp S enterica dựa trình tự gen invA gen spvC • Trình tự nucleotid gen invA spvC sẵn có từ GenBank Accession number M90846 gen invA Accession number FN432031 gen spvC Cặp mồi invA chuyên biệt để phát dòng vi khuẩn Salmonella spp V Cặp mồi spvC chuyên biệt để phát dòng vi khuẩn S enteritica Phối hợp hai cặp mồi phản ứng PCR giúp phát lúc hai dòng vi khuẩn Salmonella spp S enteritia giúp tiết kiệm thời gian kinh phí PhẢn Ứng PCR ĐA MỒI Thành phần phản ứng PCR đa mồi gồm: 50-100ng DNA 2.5 buffer 10X (Tris 100mM, KCl 500mM, pH 9.0, 1% (v/v) Triton X-100) 0.25 Taq DNA polymerase (5U/ ), 0.25 BSA(0.1%) MgCl2 25mM, dNTP (0.2 mM loại), M loại mồi (mồi ngược mồi xuôi) Thêm nước cất vô trùng cho đủ thể tích 25 PhẢn Ứng PCR ĐA MỒI Tiến hành phản ứng 94oC 2p Gắn mồi 60oC 1p kéo dài 72oC 1p30s Sau phản ứng trì 72oC 7p Phân tích sẢn phẨm PCR Sử dụng thang chuẩn 100bp • Những mẫu xuất hai vạch 600bp 400bp chứng tỏ mẫu có chứa vi khuẩn S enteritica • Những mẫu xuất vạch 600bp chứng tỏ mẫu chứa vi khuẩn Salmonella spp không chứa chủng S enteritica Kết nghiên cứu cho thấy Qui trình PCR mang lại kết xác, nhanh gọn độ nhạy cao Hiện trạng ô nhiễm thức ăn cao Phần lớn thực phẩm bị nhiễm Salmonella spp., thực phẩm nhiễm S enteritica có mang gen spvC thấp _THE END_ THANK YOU FOR YOUR LISTENING! HAVE A NICE DAY! Phương pháp ELISA • Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có nhiều dạng mà đặc điểm chung dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, kháng thể gắn với enzyme Khi cho thêm chất thích hợp (thường nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme thủy phân chất thành chất có màu Sự xuất màu chứng tỏ xảy phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên thông qua cường độ màu mà biết nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát ... THIỆU PHƯƠNG PHÁP POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) PHƯƠNG PHÁP PCR VÀ ỨNG DỤNG XÁC ĐỊNH SALMONELLA SPP., SALMONELLA ENTERI TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA M NỘI DUNG GIỚI THIỆU PHƯƠNG PHÁP... PHÁP PCR XÁC ĐỊNH SALMONELLA SPP., SALMONELLA ENTERICA TRONG THỰC PHẨM BẰNG KỸ THUẬT PCR ĐA MỒI TRÌNH TỰ XÁC ĐỊNH SALMONELLA BẰNG PP PCR Vật liệu Chuẩn bị mẫu Thiết kế đoạn mồi PCR Phản ứng PCR. .. tăng sinh đơn giản không cần thiết Nhược điểm Kích thước trình tự cần khuếch đại: phương phápvới PCR •• Phương pháp khơng phân biệt tế bào sống tế không bào hoạt động vớidẫn DNA 3kb chết, vậyđược