ĐỀ TÀI TÌM HIỂU PHƯƠNG PHÁP ELISA

ĐỊNH NGHĨAELISA Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Phương pháp hấp thụ miễn dịch dùng enzyme hay EIA Enzyme ImmunoAssay là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên t

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP

NỘI DUNG

PHƯƠNG PHÁP ELISA

ĐỊNH NGHĨA

MỘT SỐ KHÁI NIỆM NGUYÊN TẮC PHƯƠNG PHÁP ELISA

CÁC PHƯƠNG PHÁP ELISA

ỨNG DỤNG

VÍ DỤ THỰC TIỄN

ĐỊNH NGHĨA

ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ) Phương pháp hấp thụ miễn dịch dùng enzyme hay EIA (Enzyme ImmunoAssay) là một kỹ thuật sinh hóa

để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm

ĐỊNH NGHĨA

- Ví dụ: Enzyme peroxidase phản ứng với một

số cơ chất nhất định như: Tetramethylbenzidine

hay 3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonic acid sẽ

phát màu Màu sinh ra từ các phản ứng này có

thể được sử dụng làm tín hiệu nhận biết (tín hiệu chỉ thị)

MỘT SỐ KHÁI NIỆM

 Kháng nguyên: là những chất có khả năng huy

động hệ miễn dịch tiết ra kháng thể đặc hiệu, kháng

nguyên bao gồm: protein lạ, acid nucleic, một số

lipid và polysaccharide.

 Kháng thể: thành phần gramma globulin trong

các protein máu Kháng thể là những protein hòa

tan do các tế bào B hay tương bào tiết ra để đáp ứng với 1 kháng nguyên và chúng có thể gắn đặc hiệu

NGUYÊN TẮC

- Dựa trên sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên

và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với một

enzyme

- Sử dụng kháng thể đơn dòng phủ lên bề mặt những đĩa giếng Nếu có sự hiện diện của kháng nguyên trong mẫu, kháng nguyên sẽ tạo phức hợp với kháng thể cố định trên giếng và kháng thể tự do có gắn enzyme tạo thành 1 phức hợp kép

NGUYÊN TẮC

- Khi bổ sung cơ chất đặc hiệu vào enzyme xúc

tác phản ứng thủy phân cơ chất để tạo thành các

sản phẩm có màu hay phát sáng

- Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng

đặc hiệu giữa kháng thể và kháng nguyên và

thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ

kháng nguyên hay kháng thể cần phát hiện

NGUYÊN TẮC

PHƯƠNG PHÁP ELISA TRỰC TIẾP

- Đây là dạng đơn giản nhất của phương

pháp ELISA Trong đó kháng nguyên cần

phát hiện sẽ được gắn trực tiếp lên bề mặt

giá thể và sẽ được phát hiện bằng một

kháng thể duy nhất (kháng thể này đã được gắn với enzyme).

PHƯƠNG PHÁP ELISA TRỰC TIẾP

Bước 1: Cho kháng nguyên vào đĩa

Bước 2: Đem ủ đĩa chứa kháng nguyên

Bước 3: Rửa đĩa

Bước 4: Thêm kháng thể có gắn với enzyme

Bước 1: Cho kháng nguyên vào đĩa

Bước 2: Đem ủ đĩa chứa kháng nguyên

Bước 3: Rửa đĩa

Bước 4: Thêm kháng thể có gắn với enzyme

Độ đặc hiệu bị giới hạn vì thường thì kháng

nguyên có ít nhất là 2 epitope (trình duyệt kháng

nguyên) mà phương pháp này chỉ sử dụng 1

kháng thể gắn vào một epitope

Phải đánh dấu cho từng kháng thể chuyên biệt với từng đối tượng

PHƯƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP

- Phương pháp này khác với ELISA trực

tiếp ở chỗ kháng thể bắt kháng nguyên

không được gắn với enzyme mà nó là mục

tiêu gắn đặc hiệu của một kháng thể khác

( kháng thể này mới là kháng thể được gắn

với enzyme).

PHƯƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP

Bước 1: Cho kháng nguyên vào đĩa

Bước 2: Đem ủ, rửa

Bước 1: Cho kháng nguyên vào đĩa

Bước 2: Đem ủ, rửa

PHƯƠNG PHÁP ELISA GIÁN TIẾP

- Ưu điểm : kháng thể gắn với enzyme có thể sử

dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên

nên tiện lợi và kinh tế hơn , dễ dàng thương mại

hóa.

- Nhược điểm : độ đặc hiệu của từng kháng

huyết thanh là khác nhau Điều này dẫn đến các kết quả khác nhau giữa các thí nghiệm và do đó cần

phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết thanh khác

SANDWICH ELISA

Đây là một dạng ELISA được sử dụng phổ biến nhất trong thực tiễn do nó có phản ứng mạnh và

nhạy kết quả thí nghiệm được đánh giá thông qua

sự kết hợp của hai loại kháng thể : kháng thể bắt

(capture antibodies) và kháng thể phát hiện

(detection antibodies)

Kỹ thuật này chia làm 2 dạng: Sandwich Elisa trực tiếp, Sandwich Elisa gián tiếp

SANDWICH ELISA

Bước 1 Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT.

Bước 2.Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc

hiệu trên bề mặt

Bước 3 Phủ mẫu chứa KN cần xác định đem ủ

Bước 1 Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT.

Bước 2.Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc

hiệu trên bề mặt

Bước 3 Phủ mẫu chứa KN cần xác định đem ủ

Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN trong mẫu nghiên cứu và bao gồm các bước cơ

bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều trường hợp):

SANDWICH ELISA

Bước 4 Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết

sẽ bị rửa trôi

Bước 5 Thêm các KT đặc hiệu cho KN cần

chuẩn đoán đem ủ

Bước 6 Thêm KT thứ cấp đã được gắn với

enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho KT sơ cấp ở

bước 5)

SANDWICH ELISA

Bước 7 Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa

trôi

Bước 8 Thêm cơ chất Enzym sẽ biến đổi cơ

chất tạo màu, phát quang hay tín hiệu hóa điện

Bước 9 Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳnh

quang, tín hiệu điện hóa qua đó xác định sự có

ELISA CẠNH TRANH

Bước 1 "Ủ" Kháng Thể không được đánh dấu với

Kháng Nguyên.

Bước 2 Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi

phiếm có chứa Kháng Nguyên.

Bước 3 Rửa đĩa, Kháng Thể không được gắn kết

sẽ bị rửa trôi Lượng Kháng Nguyên càng lớn,

lượng Kháng Thể gắn thành công với Kháng

Nguyên trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh".

ELISA CẠNH TRANH

Bước 4 Thêm Kháng Thể thứ cấp (Kháng

Thể của Kháng Thể ở bước 1) Kháng Thể

thứ cấp gắn với enzym.

Bước 5 Thêm cơ chất Lượng enzym còn

dư sẽ giải phóng tín hiệu huỳnh quang hay

tín hiệu màu.

Bổ sung một loại enzyme chất nền- nhiễm sắc thuốc thử

là tác nhân tạo màu

ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM

- Độ nhạy cao xác định kháng nguyên hoặc

ƯU ĐIỂM VÀ NHƯỢC ĐIỂM

Nhược điểm

- Đòi hỏi thời gian (có kết quả sau 5h).

- Yêu cầu kỹ thuật phân tích cao.

- Trang bị kĩ thuật hiện đại chi phí lớn.

ỨNG DỤNG CỦA ELISA

Trong thực phẩm

- Phát hiện độc tố trong tảo

- Phát hiện vi khuẩn E.coli, Salmonella,

Staphylococcus aureus,sán lá gan… trong thực

phẩm

- Phát hiện chất chloramphenicol (chất không được phép có trong tôm, cá và các sản phẩm thuỷ sản

khác)

ỨNG DỤNG CỦA ELISA

Trong nông nghiệp

- Chuẩn đoán bệnh Tristeza (tác nhân gây bệnh

héo rũ) trên cây cam quýt

- Phát hiện kháng thể chống Mycoplasma

hyopnewmonia(MH) ở heo

VÍ DỤ THỰC TIỄN

Chế phẩm HIV UNIFORM II Plus O phát hiện nhiễm HIV

Nguyên tắc

Là phản ứng ELISA “Sandwich“

- Kháng nguyên gắn trên giếng là các protein vỏ gp160 của

HIV-1 và ANT70 (nhóm O) gp36 của HIV2

- Nếu trong mẫu thử có kháng thể kháng HIV, kháng thể này

sẽ gắn đặc hiệu với kháng nguyên cố định trên giếng Đồng thời khối cầu cộng hợp là kháng nguyên HIV gắn men cũng có sẵn trong mỗi giếng sẽ tạo phức hợp : Kháng nguyên -Kháng

Rửa giải các thành phần khác trong huyết thanh

Nếu có kháng thể HIV thì KT này sẽ được giữ lại.

Thêm KT thứ cấp đặc hiệu với KT HIV vào đĩa

QUY TRÌNH

Rửa giải KT thứ cấp có gắn enzyme

Cho cơ chất đặc hiệu với enzyme của kháng thể thứ cấp

Đo OD ở bước sóng 450nm

So sánh kết quả với kết quả mẫu huyết thanh của người bình thường

Mẫu mất màu vàng ban đầu

Enzyme : Horsesal peroxidase

Cơ chất TMB

Thank You !