PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, gọi là “phản ứng khuếch đại gen”.Phương pháp PCR là 1 phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là 1 trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM BỘ MÔN PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction) DANH SÁCH NHÓM Trần Nguyễn Yến Linh Phạm Trần Quỳnh Như Mai Thị Ngọc Bích Phạm Thị Luân Triết Nguyễn Thị Thu Hiền Lê Nguyễn Hoàng Tuấn I • GIỚI THIỆU II • THÀNH PHẦN CHỦ YẾU III • CÁC GIAI ĐOẠN CỦA PHẢN ỨNG IV • MỘT SỐ KỸ THUẬT PCR V • THIẾT BỊ VI • ỨNG DỤNG Chương I: GIỚI THIỆU Phương pháp PCR Kary Mullis cộng phát minh năm 1985, ông đoạt giải nobel hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, sau năm ông đưa ý tưởng Ý tưởng: phát triển quy trình mà DNA nhân lên nhiều lần cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ chép enzyme DNA polymerase PCR chữ viết tắt cụm từ Polymerase Chain Reaction, gọi “phản ứng khuếch đại gen” PCR kỹ thuật nhằm khuyếch đại đoạn DNA mà không cần sử dụng sinh vật sống Phương pháp dựa khám phá hoạt tính sinh học nhiệt độ cao DNA polymerase tìm thấy sinh vật ưa nhiệt PCR sử dụng nghiên cứu sinh học y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, phát bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen xác định huyết thống NGUYÊN TẮC Phương pháp PCR phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa khuôn trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng khuôn thành hàng triệu nhờ hoạt động enzyme polymerase cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA Theo Mullis, enzyme phản ứng nhân DNA thực ống nghiệm Sợi DNA đôi bị tách thành sợi đơn đun nóng 96 °C Không có hiệu cao, cần lượng lớn DNA polymerase phải liên tục lưu ý suốt trình PCR DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic tên thermostable sống mạch nước phun 110 °C,và dùng PCR không bị phá vỡ Quá trình chép DNA đơn giản tự Chương II: Thành phần chủ yếu Phương pháp PCR a DNA mẫu b Mồi c Enzyme polymerase chịu nhiệt d Các loại Nucleotid e Nước f Dung dịch đệm Sử dụng phương pháp PCR để phát vi khuẩn Salmonela thực phẩm so sánh kết với phương pháp xét nghiệm vi khuẩn Đặt vấn đề Trong năm gần đây, vấn đề VSAT thực phẩm thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học Nhiều kết nghiên cứu đưa số cảnh báo tình trạng ATTP đặc biệt tình trạng nhiễm vi khuẩn tươi sống Trong đó, không nói đến vi khuẩn Salmonella Phương pháp nuôi cấy tăng sinh xét nghiệm vi khuẩn cho kết chậm Đặt vấn đề Nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR việc phát vi khuẩn Salmonella thực phẩm sử dụng để đánh giá thực trạng ô nhiễm lưu thông địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế Nội dung nghiên cứu So sánh phương pháp PCR với phương pháp xét nghiệm vi khuẩn Xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella mẫu thịt lấy từ chợ thời điểm khác ngày Vật liệu Mẫu thịt bò, gà, heo lấy từ lò mổ sạp bày bán chợ Môi trường nuôi cấy tăng sinh chọn lọc Các hoá chất dùng cho PCR chạy điện di Primer dùng cho phản ứng PCR Phương pháp nghiên cứu Phương pháp PCR Phương pháp xét nghiệm vi khuẩn Phương pháp PCR Phương pháp PCR Phương pháp PCR III KẾT QUẢ So sánh kết phương pháp PCR phương pháp xét nghiệm vi khuẩn phát ô nhiễm Salmonella thực phẩm Kết phát Salmonella thịt bò Kết phát Salmonella thịt gà Kết luận đề nghị PCR phương pháp phát Salmonella thực phẩm đơn giản, nhanh, có độ nhạy cao so với phương pháp phát vi khuẩn Tỷ lệ nhiễm Salmonella mẫu thị địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế tương đối cao, cần có biện pháp đảm bảo vệ sinh giết mổ bảo quản THANK YOU !!! [...]... sản phẩm cần nhân bản IV Một số kỹ thuật PCR c Kỹ thuật PCR đảo (Inverse PCR) Nguyên lý: - PCR đảo là phương pháp PCR để nhân một đoạn DNA chưa biết trên phân tử DNA, nằm trước hoặc nằm sau một đọan DNA đã biết một trình tự - Kỹ thuật PCR đảo do Jonathan và Silver cải tiến từ PCR chuẩn năm 1989 IV Một số kỹ thuật PCR c Kỹ thuật PCR đảo (Inverse PCR) Các bước tiến hành: •Do chỉ biết trước một đoạn trình... (Nested PCR) c Kỹ thuật PCR đảo (Inverse PCR) d Real-time PCR IV Một số kỹ thuật PCR a Kỹ thuật PCR ngược Nguyên lý: - Được cải tiến dựa trên kỹ thuật PCR chuẩn để nhân các gen (các đoạn DNA) từ mạch khuôn là mRNA - Phương pháp PCR ngược được sử dụng để phân lập 1 đoạn DNA cạnh một trình tự đã biết trong DNA genome IV Một số kỹ thuật PCR a Kỹ thuật PCR ngược Cách tiến hành: - Người ta thiết kế một cặp... thuật PCR b Kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR) Kỹ thuật PCR lồng là kỹ thuật thực hiện 2 lần PCR chuẩn kế tiếp nhau Trong đó, lần PCR thứ 2 (Nested 2) sử dụng cặp mồi thứ 2 và kết quả khuếch đại các đoạn DNA của lần PCR thứ nhất (Nested 1) làm khuôn, để nhân các đoạn DNA có tính đặc hiệu cao Cách tiến hành như vậy nhằm làm tăng tính đặc hiệu, chính xác cho sản phẩm cần nhân bản IV Một số kỹ thuật PCR c... PHẢN ỨNG PCR Bước 1: BIẾN TÍNH ADN Nhiệt độ tăng 94-96 để tách hai sợi DNA ra Trước chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn Chương IV: GIỚI THIỆU MỘT SỐ KỸ THUẬT PCR MỘT SỐ KỸ THUẬT PCR a Kỹ thuật PCR ngược b Kỹ thuật PCR lồng (Nested PCR) c Kỹ thuật PCR đảo (Inverse PCR) d... đích hiển thị ngay mỗi chu kì nhiệt của phản ứng Bao gồm 3 phương pháp phổ biến là: Real-time PCR sử dụng mẫu dò Taqman (còn gọi là kỹ thuật 5’ nuclease) Realtime PCR sử dụng mẫu dò Beacon (mẫu dò dạng kẹp tóc) Realtime PCR sử dụng mẫu dò lai (hybridization probe) Real-time PCR sử dụng mẫu dò Taqman (còn gọi là kỹ thuật 5’ nuclease) Realtime PCR sử dụng mẫu dò Beacon (mẫu dò dạng kẹp tóc) Vòng lặp:... bằng kỹ thuật PCR chuẩn •Sử dụng các loại enzyme giới hạn (RE) cắt ở giữa đoạn trình tự đã biết •Sử dụng enzyme DNA ligase nối đảo 2 đầu tạo nên đoạn DNA có các trình tự đã biết nằm ở hai đầu đoạn chưa biết Từ các trình tự đã biết, thiết kế cặp mồi đặc hiệu và thực hiện kỹ thuật PCR chuẩn để nhân đoạn DNA chưa biết theo ý muốn IV Một số kỹ thuật PCR d Kỹ thuật Realtime - PCR Là kỹ thuật PCR mà kết quả...II Thành phần chủ yếu a DNA mẫu Phản ứng PCR tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch lẫn DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Có độ dài nhỏ hơn 1,5kb Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm khi dùng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao (