PHƯƠNG PHÁP PCR (Polymerase Chain Reaction)

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, gọi là “phản ứng khuếch đại gen”.Phương pháp PCR là 1 phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là 1 trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này

TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM

5 Nguyễn Thị Thu Hiền

6 Lê Nguyễn Hoàng Tuấn

Chương I:

GIỚI

THIỆU

Phương pháp PCR được Kary Mullis và

cộng sự phát minh năm 1985, ông đã đoạt giải nobel về hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này, chỉ sau 7 năm khi ông đưa

ra ý tưởng

Ý tưởng: phát triển một quy trình mà DNA

có thể nhân lên nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase

PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, gọi là “phản ứng khuếch đại gen”.

PCR là kỹ thuật nhằm khuyếch đại một đoạn DNA

mà không cần sử dụng các sinh vật sống

Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt

PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học

và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau, như phát hiện các bệnh di truyền, nhận dạng, chẩn đoán những bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen và xác định huyết thống

NGUYÊN TẮC

Phương pháp PCR là 1 phương pháp invitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn

là 1 trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp mồi đặc hiệu cho đoạn DNA này

Theo Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA

được thực hiện trong ống nghiệm Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn khi đun nóng ở

96 °C

Không có hiệu quả cao, cần một lượng lớn DNA polymerase và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR

DNA-Polymerase lấy từ vi khuẩn thermophilic tên thermostable sống trong mạch nước phun

trên 110 °C,và khi dùng trong PCR nó không bị phá vỡ

Quá trình sao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn

Chương II:

Thành phần chủ yếu

của Phương pháp PCR

II Thành phần chủ yếu

a DNA mẫu

Phản ứng PCR tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch lẫn DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào Có độ dài nhỏ hơn 1,5kb

Lượng DNA sử dụng có khuynh hướng giảm khi dùng các enzyme DNA polymerase cho hiệu quả cao (<100mg)

Lượng DNA mẫu nếu cao quá phản ứng PCR sẽ không xảy ra

Nguyên tắc

Cùng tnc Đặc hiệu

Kích thước tối thiểu 18base

Tránh sự bổ sung giữa 2

II Thành phần chủ yếu

c Enzyme polymerase chịu nhiệt

Enzyme sử dụng trong phản ứng PCR là enzyme DNA polymerase từ Thermus aquaticus (Tag – polymerase) không biến tính sau mỗi chu kì

Hiện nay có nhiều enzyme chịu nhiệt khác được

sử dụng là: Vent – polymerase (Tli – polymerase), Pfu – polymerase, rTth

Hiệu suất tương đối (relative efficiency)

Tần số lỗi (error rate)

Tần số mở rộng (extention rate)

Exo 3’ – 5’

Exo 5’ – 3’

Taq –

polymerase 88 2 x 10-4 75 Không CóVent-

polymerase 70 4 x 10-5 67 Có KhôngPfu -

polymerase 60 7 x 10-7

Không xác đinh. Có KhôngrTth Không xác

định.

Không xác định. 60 Không Có

II Thành phần chủ yếu

c Enzyme polymerase chịu nhiệt

II Thành phần chủ yếu

e Nước

Nước sử dụng cho phản ứng PCR phải thật tinh khiết, không chứa ion nào, không chứa DNAase, RNAase, enzyme cắt hạn chế… Nói cách khác là không chứa bất kì một thành phần nào khác

II Thành phần chủ yếu

f Dung dịch đệm

Dung dịch đệm 10X (100mM KCl, 100mM (NH4)2SO4 200mM Tris – Cl pH 8.8, 20mM MgSO4, 1% (w/v) Triton X-100)

Thành phần quan trọng của dung dịch đệm là Mg2+ giúp tạo phức với dNTP, cần thiết để gắn dNTP vào enzyme Kích thích hoạt tính polymerase

Nồng độ ion Mg2+ tối ưu là 150 - 200µM

Chương III:

CÁC GIAI ĐOẠN CỦA PHẢN ỨNG

PCR

Bước 1: BIẾN TÍNH

ADN

Nhiệt độ tăng

94-96 để tách hai sợi

DNA ra Trước chu

kỳ 1, DNA thường

được biến tính đến

thời gian mở chuỗi

để đảm bảo mẫu

DNA và mồi được

phân tách hoàn toàn

và chỉ còn dạng sợi

đơn.

Chương IV:

GIỚI THIỆU MỘT SỐ KỸ THUẬT

PCR

- Phương pháp PCR ngược được sử dụng để phân lập 1 đoạn DNA cạnh một trình tự đã biết trong DNA genome

- Đóng vòng phân đoạn trên DNA và mở vòng bằng

1 enzyme hạn chế 6 base khác ở trong vùng đã biết trình tự Sử dụng 1 trong 2 mồi để đọc trình tự vùng chưa biết trình tự

Cách tiến hành như vậy nhằm làm tăng tính đặc hiệu, chính xác cho sản phẩm cần nhân bản

- Kỹ thuật PCR đảo do Jonathan và Silver cải tiến từ PCR chuẩn năm 1989

•Sử dụng các loại enzyme giới hạn (RE) cắt ở giữa đoạn trình tự đã biết

•Sử dụng enzyme DNA ligase nối đảo 2 đầu tạo nên đoạn DNA có các trình tự đã biết nằm ở hai đầu đoạn chưa biết

Từ các trình tự đã biết, thiết kế cặp mồi đặc hiệu

và thực hiện kỹ thuật PCR chuẩn để nhân đoạn DNA chưa biết theo ý muốn

IV Một số kỹ thuật PCR

d Kỹ thuật Realtime - PCR

Là kỹ thuật PCR mà kết quả khuyếch đại DNA đích hiển thị ngay mỗi chu kì nhiệt của phản ứng

Bao gồm 3 phương pháp phổ biến là:

Real-time PCR sử dụng mẫu dò Taqman (còn gọi là kỹ thuật 5’ nuclease)

Realtime PCR sử dụng mẫu dò Beacon (mẫu dò dạng kẹp tóc)

Realtime PCR sử dụng mẫu dò lai (hybridization probe)

Real-time PCR sử dụng mẫu dò

Taqman (còn gọi là

kỹ thuật 5’

nuclease).

Realtime PCR

sử dụng mẫu dò Beacon (mẫu dò dạng kẹp tóc)

Vòng lặp: Đây là cơ sở khu vực 18-30 cặp đèn hiệu phân tử bổ sung cho chuỗi đích Thân: Thân đèn hiệu được hình thành bởi các tập tin đính kèm, để cả hai trạm cuối

của vòng lặp, hai (5-7 dư lượng nucleotide) oligonucleotide ngắn mà bổ sung cho

nhau.

5 'huỳnh quang: Ở 5' của ngọn hải đăng phân tử, một loại thuốc nhuộm huỳnh quang

được liên kết hóa trị kèm theo.

3 'khử (không huỳnh quang): Thuốc nhuộm khử được liên kết hóa trị gắn liền với đầu

3' của ngọn hải đăng phân tử Khi đèn hiệu là trong hình dạng vòng khép kín, các khử

cư trú ở gần các huỳnh quang, kết quả là dập tắt sự phát xạ huỳnh quang sau này.

Realtime PCR

sử dụng mẫu dò lai (hybridization probe)

Chương 5: THIẾT BỊ

V Thiết bị kỹ thuật PCR

a Máy PCR

Dùng để khuếch đại từ một mẫu DNA cho trước thành nhiều mẫu mà không có thiết bị đọc kết quả, phải kết hợp với các thiết bị khác để đọc được kết quả mong muốn

Nhược điểm lớn nhất của máy PCR là chỉ khuếch đại DNA chứa không đưa ra một kết quả cuối cùng là số lượng DNA khuếch đại và sản phẩm DNA mong muốn Nên phải

có các bước tiếp theo để đọc kết quả

V Thiết bị kỹ thuật PCR

a Máy Realtime - PCR

Realtime PCR (Real time PCR) là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại DNA đích được hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ của phản ứng PCR

Có thêm một thiết bị quang học có 2 chức năng:

Có các nguồn sáng phát ra được các tia sáng kích thích (excitation light) có bước sóng xác định lên các

Chương VI: Ứng dụng

PHẠM VI SỬ DỤNG

Sản xuất mẫu dò

Khuếch đại số lượng RNA

Khuếch đại DNA và RNA ngay tại hệ mô

Định lượng DNA

Sản xuất mẫu dò:

PCR giúp sản xuất nhanh một lượng lớn mẫu dò đánh dấu phóng xạ khi thực hiện các phản ứng với cặp mồi

chuyên biệt và các nucleotit đánh dấu, phù hợp với

phương pháp lai giữa DNA và DNA, RNA và DNA

Khuếch đại số lượng RNA:

dưới mức cho phép nên người ta dùng phương pháp RT - PCR để tăng nồng

độ mRNA đến một giới hạn phát hiện bằng cách phiên

mã ngược: mRNA → cDNA

Từ cDNA, ta đánh giá được mRNA

Khuếch đại DNA và RNA ngay tại hệ mô:

Kỹ thuật này được tiến hành ngay trên lát cắt mô, tế bào cố định trên lame trong thiết bị PCR có bộ phận tạo nhiệt cho lame

Định lượng DNA:

Khi nồng độ DNA thấp, dùng phương pháp PCR nhân lên đến mức xác định Người ta xác định được số lượng bản mẫu ban đầu qua tính toán dựa vào sản phẩm cuối cùng và số chu kỳ nhân

• Xét nghi ệm

tro

ng c hẩn đoá

n vi êm não , v iêm m àng não

, . và C B êu vi an si m g viê ây us g vir

• P hát hi

ện n hanh n

hóm

vi khu

ẩn tro

ng d ịch n

ão t

ủy, c

ác tác nh. gây bệ vật nh i si n v nhâ

• Phá

t hi

ện, đ ịnh

y, đ ịnh typ háp y… c, p mô họ

Y khoa

• Xác đị

nh t

ác n hân

gây bện

h d

o vi khu ẩn,

viru

s có tr ong mẫu hẩm c p c thự gộ độ y n gâ hẩm c p thự

• Dùn

g đ

ể c hẩn đoá

n thự

c p hẩm

có ngu

ồn g

ốc t

ự n hiê

g tr ong ch

ọn g iốn

g và xác đ

ịnh yế

u tố gây

bệ

nh t ron

g rồng cây t

• Chẩ

n đ oán bệnh t

rong côn

g tá

c c hăn n uôi

, c họn giố

nă

ng su

ất si

nh sản tro

ng , gen gen tro es thể thụ nh gen đị xác ệc vi như heo uôi n n chă

thụ th

ể p rol act in

Nông

nghiệp

Ứng dụng phương pháp PRC

Phát hiện vi khuẩn SALMONELLA

Trong thực phẩm

Sử dụng phương pháp PCR để phát hiện vi khuẩn Salmonela trong thực phẩm và so sánh kết quả với phương pháp xét nghiệm vi khuẩn

Đặt vấn đề

Trong những năm gần đây, vấn đề VSAT thực phẩm thu hút được nhiều sự quan tâm của các nhà khoa học

Nhiều kết quả nghiên cứu đã đưa ra những con số cảnh báo về tình trạng mất ATTP đặc biệt là tình trạng nhiễm vi khuẩn trong tp tươi sống Trong đó, không thể không nói đến vi khuẩn Salmonella

Phương pháp nuôi cấy tăng sinh và xét nghiệm vi khuẩn cho kết quả chậm

Đặt vấn đề

Nghiên cứu ứng dụng phương pháp PCR trong việc phát hiện vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm đã được sử dụng để đánh giá thực trạng ô nhiễm của tp lưu thông trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế

Nội dung nghiên cứu

So sánh phương pháp PCR với phương

pháp xét nghiệm vi khuẩn

Xác định tỷ lệ nhiễm Salmonella của các mẫu thịt được lấy từ các chợ tại các thời điểm khác nhau trong ngày.

Vật liệu

Mẫu thịt bò, gà, heo được lấy từ các lò mổ và các sạp bày bán trong chợ

Môi trường nuôi cấy tăng sinh chọn lọc

Các hoá chất dùng cho PCR và chạy điện di

Primer dùng cho phản ứng PCR

Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp PCR

Phương pháp xét nghiệm vi khuẩn

Phương pháp PCR

III KẾT QUẢ

So sánh kết quả của phương pháp PCR và phương pháp xét nghiệm vi khuẩn phát hiện ô nhiễm Salmonella trong thực phẩm

Kết quả phát hiện Salmonella ở thịt bò

Kết quả phát hiện Salmonella ở thịt gà

Kết luận và đề nghị

PCR là một phương pháp phát hiện Salmonella trong thực phẩm đơn giản, nhanh, có độ nhạy cao hơn so với phương pháp phát hiện vi khuẩn

Tỷ lệ nhiễm Salmonella trong mẫu thị trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế còn tương đối cao, cần có những biện pháp đảm bảo vệ sinh trong giết mổ và bảo quản

THANK YOU !!!