ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) TRONG PHÁT HIỆN NHANH LISTERIA MONOCYTOGENES Nguyễn Thị Kim Hoa, Tô Kim Anh Viện Công nghệ sinh học-Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà nội 1, Đại Cồ Việt, Hai Bà trưng Hà nội Fax: 868 2452, tokimanh@mail.hut.edu.vn I MỞ ĐẦU L monocytogenes có khả gây bệnh listeriosis với hậu trầm trọng sảy thai, thai chết lưu đẻ non phụ nữ mang thai, gây nhiễm trùng máu viêm màng não trẻ em người có hệ miễn dịch Liều gây nhiễm chúng thấp khoảng 102 CFU/g người trưởng thành 10 CFU/g trẻ em phụ nữ mang thai [7, 8, 11, 13, 14, 16 17] Ở nước phát triển, L monocytogenes tiêu kiểm soát nghiêm ngặt quản lý chất lượng thực phẩm Tuy nhiên Việt nam, chưa có tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm kiểm soát tác nhân gây bệnh chưa có số liệu đề cập tình trạng nhiễm L monocytogenes thực phẩm không qua xử lý nhiệt bảo quản lạnh dài ngày [1] Các phương pháp truyền thống phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm bao gồm bước nuôi cấy môi trường chọn lọc hàng loạt thử nghiệm hoá sinh để khẳng định diện loài gây bệnh định, thường kéo dài vài ngày đến vài tuần [3, 6, 8] Trong năm vừa qua, phương pháp nhanh hơn, chuyên biệt nhằm phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm dựa nguyên tắc sinh học phân tử miễn dịch học phương pháp lai phân tử, PCR, ELISA…đã thiết lập PCR (Polymerase Chain Reaction) kỹ thuật ứng dụng phổ biến khắc phục nhược điểm phương pháp truyền thống nhờ khả phát nhanh đặc hiệu mầm bệnh Các nghiên cứu giới tập trung vào khẳng định khả sử dụng PCR phương pháp tiêu chuẩn để kiểm tra vệ sinh thực phẩm [4, 11] Với mục tiêu góp phần kiểm soát an toàn thực phẩm, viết này, trình bày khảo nghiệm xây dựng quy trình phát nhanh L monocytogenes kỹ thuật PCR với cặp mồi LM-F LM-R công cụ kiểm soát loài vi khuẩn nguy hiểm II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Các chủng vi sinh vật Quy trình phát xây dựng chủng L monocytogenes 0704 phòng thí nghiệm vi sinh vật ENSAT, Trường Đại học Bách khoa Toulouse, Pháp cung cấp Các chủng thử nghiệm khác dẫn bảng Hoá chất Hoá chất sử dụng cho tách chiết DNA tổng số, hoá chất cho điện di gel agarose, thang DNA chuẩn 100 bp 1000bp Sigma cung cấp Các hoá chất sử dụng cho phản ứng PCR Amersham Phamacia Biotech cung cấp Các hoá chất sử dụng cho phân tích trình tự gen (Kanamyxin, Xgal, Eco RI, kit tách dòng Topo TA Cloning Kit, kit tách tinh plasmid QIA prep Spin Miniprep Test Kit) Invitrogen PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com cung cấp, kit xác định trình tự BigDye Terminator v3.1 Applied Biosystem cung cấp Các hoá chất khác độ tinh khiết phân tích Mồi cho phản ứng PCR Dựa trình tự gen hlyA chủng L monocytogenes công bố ngân hàng gen, cặp mồi LM-F LM-R thiết kế bao gồm 20 bp/mồi cho sản phẩm PCR 468 bp [2] Xác định tính đặc hiệu mồi Khả bắt cặp xác mồi khẳng định cách phân tích trình tự sản phẩm PCR theo phương pháp Sanger cộng [15] so sánh với trình tự gen đích hlyA L monocytogenes theo phần mềm BLAST Tính đặc hiệu mồi khảo sát cách kiểm tra khả bắt cặp mồi thiết kế với khuôn DNA vi khuẩn L monocytogenes L monocytogenes phản ứng PCR Phản ứng PCR DNA khuôn từ L monocytogenes 0704 thu nhận cho phản ứng PCR cách tách làm DNA với chloroform [4] xử lý nhiệt tế bào 1000C 10 phút Tối ưu hoá điều kiện PCR nồng độ Mg2+ (1,5 - 4,0 mM), nồng độ mồi (0,1 - 0,5 pmol/mồi) nồng độ dNTPs (100 - 250 µM/mỗi loại) Phản ứng PCR thực với thể tích hỗn hợp 25 µl với chu trình nhiệt gồm 940C - phút, (940C phút, 600C phút, 720C phút) x 30 chu trình, 720C - phút 40C - phút Đánh giá kết phản ứng PCR dựa phân tích sản phẩm PCR gel agarose 1% với µl sản phẩm Xác định độ nhạy phương pháp Canh trường nuôi qua đêm L monocytogenes môi trường LEB định lượng, pha loãng tới mật độ thích hợp Ly tâm thu sinh khối ml canh trường hòa tan 100 µl TE, xử lý nhiệt thu DNA cho phản ứng PCR µl dịch tế bào qua xử lý nhiệt sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Đánh giá kết phản ứng PCR nhờ phân tích sản phẩm điện di agarose 1% III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tách DNA gen DNA gen từ L monocytogenes 0704 tách làm dùng làm khuôn cho phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen mục tiêu hlyA với cặp mồi LMFLMR, Kết phản ứng PCR với khuôn DNA tinh thể hình 1giếng cho thấy băng DNA có kích thước nằm khoảng kích thước sản phẩm PCR thiết kế Với mục đích thu nhận DNA mẫu cho phản ứng PCR cách đơn giản hơn, huyền phù L monocytogenes 500bp4 400bp4 Hình 1: Sản phẩm khuyếch đại với cặp mồi LM-F, LM-R từ khuôn DNA L monocytogenes Giếng 1: marker DNA 100bp; Giếng 2: PCR với DNA tinh Giếng 3: PCR với DNA sau xử lý nhiệt PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com xử lý nhiệt 1000C 10 phút để phá vỡ tế bào, giải phóng DNA, ly tâm 10000 vòng/phút x 10 phút, thu dịch ly tâm chứa DNA làm khuôn cho phản ứng PCR Kết phản ứng PCR với khuôn DNA tách xử lý nhiệt thể hình 1, giếng Bảng Danh mục chủng vi sinh vật thử nghiệm STT Tên chủng Xuất xứ Listeria monocytogenes 0704 Listeria spp Bacillus cereus BC1 Bacillus cereus BC2 Bacillus subtilis FS-2 10 Salmonella spp Salmonella typhi Staphylococcus aureus Vibrio cholerae serovar inaba Vibrio cholerae serovar ogawa E coli Phòng thí nghiệm vi sinh vật, ENSAT, Đại học Bách khoa Toulouse, Pháp Khoa Sinh học, Đại học KHTN - Đại học quốc gia TPHCM Khoa Sinh học, Đại học KHTN - Đại học quốc gia TPHCM Bảo tàng giống VSV, Viện công nghiệp thực phẩm, Hà nội Viện công nghệ sinh học - công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa, Hà nội Bộ môn vi trùng, Viện thú y, Hà nội Bộ môn vi sinh, Viện công nghệ sau thu hoạch, Hà nội Bộ môn vi trùng, Viện thú y, Hà nội Bộ môn vi sinh, Viện công nghệ sau thu hoạch, Hà nội Bộ môn vi sinh, Viện công nghệ sau thu hoạch, Hà nội 11 Bộ môn vi trùng, Viện thú y, Hà nội Kết hình cho thấy, hai trường hợp sử dụng DNA tinh (giếng 2) DNA xử lý nhiệt (giếng 3) thu nhận tín hiệu đoạn khuyếch đại có kích thước nằm khoảng 400-500 bp Việc tách chiết DNA gen L monocytogenes chloroform phải trải qua nhiều công đoạn, thời gian hoá chất, đó, phương pháp xử lý nhiệt để trích ly DNA làm khuôn cho phản ứng PCR đơn giản, tốn thời gian rẻ tiền, cho kết tương đương Do vậy, để tiến đến khả áp dụng cho phân tích thông dụng, phương pháp xử lý nhiệt để trích ly khuôn DNA chọn để thu nhận DNA mẫu cho phản ứng PCR Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi LM-F, LM-R Để khẳng định khả bắt cặp xác cặp mồi LM-F, LM-R với gen hlyA L monocytogenes, trình tự sản phẩm PCR cặp mồi xác định so sánh với trình tự gen đích hlyA L monocytogenes Sản phẩm PCR sau khuếch đại cặp mồi LM-F,LM-R gắn trực tiếp vào vectơ pCR4 - TOPO DNA plasmid chứa sản phẩm PCR tách dòng E.coli DH5α Tiến hành tách chiết tinh plasmit tái tổ hợp (sử dụng kit QIA prep Spin Miniprep Test Kit), kiểm tra sản phẩm agarose 1% Kết điện di cho thấy plasmit khuẩn lạc trắng có kích thước lớn so với đối chứng (không trình bày hình 500 bp „ 400 bp „ Hình 2: Kết cắt plasmid tái tổ hợp Eco RI 1: marker DNA 100 bp 2: sản phẩm PCR 3-6: plasmid tái tổ hợp cắt với Eco RI PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com ảnh điện di) Sản phẩm PCR gắn plasmid kiểm tra cách cắt với EcoRI Kết xử lý plasmid tái tổ hợp với EcoRI trình bầy hình cho thấy đoạn DNA chèn vào plasmid có kích thước tương ứng với kích thước sản phẩm PCR Chúng tiến hành xác định trình tự sản phẩm Trình tự sản phẩm PCR xác định thiết bị xác định trình tự tự động ABI 3100 Avant, kết trình bày bảng Trình tự so sánh với trình tự hlyA L monocytogenes công bố Kết so sánh cho thấy sản phẩm PCR khuyếch đại cặp mồi LM-F, LM-R có kích thước 468 bp, đạt độ tương đồng trình tự >98 % với trình tự hlyA 53 chủng L Monocytogenes công bố (không trình bày kết quả) Như vậy, cặp mồi LM-F, LM-R thiết kế cho phép nhân xác đoạn gen hlyA L monocytogenes Bảng Trình tự sản phẩm PCR với cặp mồi LM-F, LM-R SEQUENCE 468BP 186A 81C 94G 107T AAAAGAGAGG GGTGGCAAAC GGTATTTGGC ATTATTAGGT TAAAAAATGT AGAAGGAGAG TGAAACCCAT GAAAAAAATA ATGCTAGTTT TTATTACACT TATACCAGTT AGTCTACCAA TTGCGCAACA AACTGAAGCA AAGGATGCAT CTGCATTCAA TAAAGAAAAT TCAATTTCAT CCATGGCACC ACCAGCATCT CCGCCTGCAA GTCCTAAGAC GCCAATCGAA AAGAAACACG CGATGAAAT CGATAAGTAT ATACAAGGAT TGGATTACAA TAAAAACAAT GTATTAGTAT ACCACGGAGA TGCAGTGACA AATGTGCCGC CAAGAAAAGG TTACAAAGAT GGAAATGAAT ATATTGTTGT GGAGAAAAAG AAGAAATCCA TCAATCAAAA TAATGCAGAC ATTCAAGTTG TGAATGCAAT TTCGAGCCTA ACCTATCCAG GTGCTCTCGT AAAAGCGA Để xác định tính đặc hiệu cặp mồi LM-F LM-R việc phát L monocytogenes, phản ứng PCR thực khuôn DNA vi khuẩn khác Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR (hình 3) cho thấy có giếng có tín hiệu băng 468 bp, giếng lại thể kết PCR âm tính Như vậy, cặp mồi LM-F, LM-R có khả phát đặc hiệu L monocytogenes 468bp„ Hình Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi LM-F LM-R marker DNA 100bp L monocytogenes 0704 Salmonella typhy Salmonella spp Bacillus cereus BC1 Bacillus cereus BC2 Bacillus subtilis FS-2 Listeria spp Staphylococus aureus 10 Vibrio cholerae serovar inaba 11 Vibrio cholerae serovar ogawa 12 E coli PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com Xác định điều kiện tối ưu cho PCR Nồng độ Mg2+ Phản ứng PCR thực nồng độ cuối Mg2+ từ 1,5 mM đến 4,0 mM Kết thể hình cho thấy phản ứng PCR với nồng độ Mg2+ từ 1,5 mM cho kết dương tính Nồng độ dNTPs Phản ứng PCR thực với nồng độ dNTPs từ 100 µM đến 250 µM Kết thể hình cho thấy nồng độ dNTPs 100, 150, 200, 250 µM, PCR cho tín hiệu khuyếch đại (giếng 2, 3, 4, 5) Như vậy, dNTP 100 µM chọn để thực phản ứng PCR Nồng độ mồi PCR thực nồng độ mồi khác từ 0,1 đến 0,5 pmol Kết thể hình Chỉ có giếng 5, (hình 7) cho tín hiệu vạch 468 bp, tương ứng với PCR nồng độ mồi 0,4 pmol, 0,5 pmol Vậy nồng độ 0,4 pmol /mồi chọn cho phản ứng PCR dương tính Như vậy, điều kiện phù hợp cho phản ứng PCR với quy trình chọn để phát L monocytogenes với cặp mồi LM-F, LM-R là: 0,4 pmol /mồi; 100 µM dNTPs, Mg2+ 1,5 mM Độ nhậy phương pháp PCR phát L Monocytogenes 468bp4 Hình 4: Ảnh hưởng nồng độ Mg2+ lên phản ứng PCR 1: marker DNA 100 bp; 2: 1,5 mM 5: 3,0 mM 3: 2,0 mM 6: 3,5 mM 4: 2,5 mM 7: 4,0 mM 3468bp Hình 5: Ảnh hưởng nồng độ dNTPs lên phản ứng PCR Giếng 1: marker DNA 100 bp; Giếng 2: 100µM Giếng 4: 200µM Giếng 3: 150µM Giếng 5: 250µM 3468bp Hình 6: Ảnh hưởng nồng độ mồi lên phản ứng PCR Giếng 1: marker DNA100 bp, Giếng 4: 0,3 pmol; Giếng 2: 0,1 pmol Giếng 5: 0,4 pmol; Giếng 3: 0,2 pmol Giếng 6: 0,5 pmol PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com Dịch tế bào xác định mật độ phương pháp đếm khuẩn lạc Pha loãng dịch vi khuẩn tới nồng độ khác (bảng 3), xử lý nhiệt dịch huyền phù vi khuẩn µl dịch sinh khối vi khuẩn sau xử lý nhiệt dùng làm khuôn cho phản ứng PCR Kết thể hình cho thấy phản ứng PCR cho kết dương tính với mẫu có mật độ tế bào ≥ 6x102 /phản ứng (giếng 5, 6, 7, 8) tương ứng với mật độ tế bào từ 2.104 CFU/ml Bảng 3: Mật độ tế bào mẫu kiểm tra độ nhạy phản ứng PCR Mẫu Mật độ tế bào (CFU/phản ứng) 6x105 6x104 6x103 6x102 6x 10 6.10-1 2x107 2x106 2x105 2x104 2x103 2x102 2x10 + + + + - - Mật độ tế bào (CFU/ml) Kết PCR - Như vậy, phương pháp PCR phát L monocytogenes có độ nhạy tương đương với kít thương mại BAXTM Qualicon Inc., (104 CFU/ ml) nhỏ Listeria monocytogenes LightCycler Roche (103 CFU/ ml) Các nghiên cứu tiếp tục tiến hành để nâng cao độ nhạy phương pháp Các khảo nghiệm phân tích vi khuẩn mật 468bp„ độ nhiễm thấp kiểm tra mẫu thực phẩm gây nhiễm nhân tạo IV.KẾT LUẬN Cặp mồi LM-F, LM-R thiết kế đặc hiệu với L monocytogenes, cho phép phát vi khuẩn gây bệnh L monocytogenes mật độ 6.102 CFU/phản ứng (2 104CFU/ml) Các điều kiện PCR tối ưu hoá nhằm giảm tối đa chi phí cho phân tích Đây nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR phân tích L monocytogenes Việt nam Hình Sản phẩm PCR theo mật độ tế bào Giếng 1: marker DNA100 bp, Giếng 2: mẫu Giếng 5: mẫu Giếng 3: mẫu Giếng 6: mẫu Giếng 4: mẫu Giếng 7: mẫu Nghiên cứu thực tài trợ dự án hợp tác nghiên cứu Vlir HUT AP05\Prj3\Nr01 phần đề tài KC 04-30 Các tác giả cám ơn TS Piveteau, ENSBANA, Cộng hòa Pháp việc cung cấp chủng L monocytogenes quan khác cung cấp chủng VSV thử nghiệm SUMMARY PCR applied in detection of pathogens is one of approaches to overcome the difficulty of the conventional labor- and time-consuming analysis method used in actual food borne pathogen analysis To reach the goal, the study of detection L monocytogenes by PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com PCR using newly desinged primers LM-F, LM-R for the amplicon of 468 bp was carried out The nucleotide sequence of the amplicon was determined and achieved the homogeneity of more than 98% with hlyA sequence of 53 L monocytogenes strains published in Gene bank showing the stringent annealing of the primers with target DNA of L monocytogenes LM-F, LM-R primers were found to be specific for L monocytogenes in giving positive result uniquely with DNA from L monocytogenes but not with any non-L monocytogenes The PCR procedure consisted of 25 µl reaction mixture run with thermal cycles for the LM-F, LM-R of 940C for then 30 cycles of (940C for min., 600C for min., and 720C min.) following by 720C for and finally 40 C for PCR was optimized with concentrations of primers of 0,4 pmol /each, of dNTPs of 100 µM/each and of Mg2+ of 1,5 mM using DNA template released from heat treated cells of L monocytogenes in order to lower the cost The detection limit of the developed PCR was determined as 6.102 CFU/reaction (equivalent to 2.104/ml) It was the first study for L monocytogenes detection by PCR in Vietnam and open possibility to control and warning the deadly bacterium infection from food and environment The authors express many thanks for the kind gift of L monocytogenes from Dr Lebrihi, ENSAT, France and other species by various institutions This research was done under the support of project KC-30 and a grant from the VLIR-HUT cooperative research program AP05\Prj3\Nr01 TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Y tế, Báo cáo tình hình ngộ độc thực phẩm năm 1999, 2000, 2001, 2002, 2003 Nguyễn Kim Hoa (2004), Phát triển kỹ thuật PCR phân tích Listeria monocytogenes gây bệnh thực phẩm, Luận văn cao học, Đại học Bách khoa Hà nội, 11, 2004 Trần Linh Thước (2003), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo Dục Ausubel F M., Brent R., Kingston R R., Moore D D., Seigman J G., Smith J A., Struhl K (1995) Short protocols in Molecular biology, 3rd ed Border, P.M., Howard, J.J., Plastow, G.S and Siggens, K.W (1990), “Detection Listeria species and Listeria monocytogenes using polymerase chain reaction ”, Lett Appl Microbiol 11, 158 - 162 FAO (1992), “Chapter 11 Listeria”, in Microbiologycal analysis, 119 - 130 Fsihi, H., Steffen, P and Cossart, P (2001), “Listeria monocytogenes”, Principles of Bacterial Pathogenesis, ed E.A Groisman, Academic Press, San Diego, 751 803 Harrigan, Wilkie F (1998), Laboratory methods in Food microbiology, Academic Press, 198 - 200 Holko, I., Urbanovas, J., Kantíková, M., Pástorová, K., Kmet, V (2002), “PCR detection of Listeria monocytogenes in milk and milk products and differentiation of suspect isolates ”, Acta Vet Brno 71, 125 - 131 10 Johnson, E A (2003), “Chapter Bacterial Pathogens and Toxins in Foodborne Disease”, in Food Safety: Contaminants and Toxins, ed J P F D’Mello, CAB International, 25 - 45 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com 11 Lou, Y and Yousef, A.E (1999), “Characteristics of Listeria monocytogenes important to food processors”, in Listeria, Listeriosis and Food Safety, ed E.T Ryserand E.H Marth, Marcel Dekker, Inc., New York, 131 - 224 12 Olsen J.E., Aabo S., Hill W., Noterman S., Wernars K., Granum P E., Pôpvic T., Rasmussen H N., Olsvik F (1995), Probe and polymerase chain reaction for detection of food-borne bacterial pathogens, Inter J Food Microbiol 28, 1-78 13 Rocourt, J and Cossart, P (1997), “Listeria monocytogene ”, in Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers, ASM Press, Washington, D.C, 337 352 14 Ryser, E.T and Marth, E.H (1991), Listeria, Listeriosis and Food Safety, Marcel Dekker, Inc., New York 15 Sanger et al (1977), “DNA sequencing with Chan termination Inhibitors”, Academic, Science, USA, Vol 74, pp.54-62 16 Slutsker, L and Schuchat A (1999), “Listeriosis in humans”, Listeria, Listeriosis and Food Safety, ed E.T Ryserand E.H Marth, Marcel Dekker, Inc., New York, 75 - 95 17 Swaminathan, B (2001), “Chapter 18 Listeria monocytogenes”, in Food Microbiology: Fundamentals and Frontiers, ed M P Doyle, L R Beuchat, T J Montville, ASM Press, Washington, D.C, 383 - 409 PDF created with FinePrint pdfFactory Pro trial version www.softwarelabs.com ... cặp mồi thiết kế với khuôn DNA vi khuẩn L monocytogenes L monocytogenes phản ứng PCR Phản ứng PCR DNA khuôn từ L monocytogenes 0704 thu nhận cho phản ứng PCR cách tách làm DNA với chloroform [4]... đó, phương pháp xử lý nhiệt để trích ly DNA làm khuôn cho phản ứng PCR đơn giản, tốn thời gian rẻ tiền, cho kết tương đương Do vậy, để tiến đến khả áp dụng cho phân tích thông dụng, phương pháp. .. bp, tương ứng với PCR nồng độ mồi 0,4 pmol, 0,5 pmol Vậy nồng độ 0,4 pmol /mồi chọn cho phản ứng PCR dương tính Như vậy, điều kiện phù hợp cho phản ứng PCR với quy trình chọn để phát L monocytogenes