ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY ĐỂ KHẢO SÁT SỰ NHIỄM VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ

Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), hàng năm có tới 30% dân số ở các nước phát triển bị bệnh do thực phẩm, chủ yếu là ngộ độc thực phẩm (NĐTP), ở các nước đang phát triển các trường hợp ngộ độc thực phẩm lại cao hơn nhiều

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH PHẠM THỊ HỮU KIỀU ỨNG DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION) VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY ĐỂ KHẢO SÁT SỰ NHIỄM VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã số : 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TRẦN LINH THƯỚC Thành Phố Hồ Chí Minh - 2007 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và chân thành, em xin cảm ơn: Quý Thầy, Cô Khoa Sinh Trường Đại Học Sư Phạm TP. HCM đã cung cấp cho em những kiến thức quý báu trong cả khóa học, dặc biệt là TS. Trần Thanh Thủy và TS. Trần Thị Thanh đã tận tình giúp đỡ, chỉ dẫn, động viên em trong suốt quá trình học tập. Em xin chân thành cảm ơn Thầy PGS.TS. Trần Linh Thước đã luôn tận tâm hướng dẫn và tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt luận văn này. Xin cảm ơn các bạn Nhân, Linh, Vân, Dung, Na, Ánh và tất cả các thành viên của Lab A, đặc biệt là Ths. Nguyễn Thị Bạch Huệ, đang công tác tại Phòng Thí Nghiệm Công Nghệ Sinh học Phân tử, Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh họcTrường ĐHKHTN, ĐHQG T P. HCM, đã hết lòng giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực nghiệm. Xin cảm ơn các bạn lớp cao học K.15 - VSV và các thành viên Cao học khóa 15 đã cùng gắn bó với tôi. Cảm ơn Anh! Người đã luôn sát cánh và ở cạnh tôi. Lời cảm ơn cuối cùng, con xin gởi đến tất cả “Ba Mẹ” và đại gi a đình thân yêu của con đã luôn yêu thương, đùm bọc con, là điểm tựa vững chắc và niềm tin của con trong suốt cuộc đời. TP. HCM, nam 2007 Phạm Thị Hữu Kiều DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AC : Relative Accuracy (Độ chính xác tương đối) AOAC : Association of Official Analytical Chemists ATP : Adenosine triphosphat bp : base pair (cặp base) BPW : Buffer Pepton Water (đệm pepton) cAMP : cyclic Adenosine Monophosphate cGMP : cyclic Guanosine Monophosphate DNA : Deoxyribose nucleic acid dNTP : deoxynucleotide triphosphate EDTA : Ethylene Diamine Tetra Acetic acid ELISA : Enzyme - Linked Immuno Sorbent Assay (Phương pháp hấp thụ miễn dịch gắn enzyme) FN : False Negative (âm tính giả) NC : nuôi cấy FP : False Positive (dương tính giả) HUS : Haemolytic-Uraemic Syndrome (hội chứng tan huyết) LDC : Lysine Decarboxylase MMC : Microbiological Methods Committee MR : Methyl Red MYP : Mannitol - Egg York - Polymycin NordVal : Nordic System for Validation of Alternative PCR : Polymerase Chain Reaction SE : Relative Sensitivity (Độ nhạy tương đối) SP : Relative Specificity (Độ đặc hiệu tương đối) TAE : Tris-Acetate-EDTA TE : Tris-Acetate-EDTA TSB : Tryptone Soya Broth TSI : Triple Sugar Iron Agar VP : Voges - Proskauer WHO : World Health Organization XLD : Xylose Lysine Desoxycholate ISO : International Standards Organization EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Triệu chứng của ngộ độc thực phẩm do một số vi khuẩn .8 Bảng 1.2. Tình hình ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và năm 2006 9 Bảng 1.3. Ngun nhân gây ngộ độc thực phẩm tại Việt Nam năm 2005 và năm 2006 .10 Bảng 1.4. Thống kê tình hình ngộ độc thực phẩm tại TP. HCM từ năm 2001 đến 2006 .11 Bảng 1.5. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát 14 Bảng 1.6. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm thực phẩm chế biến từ sữa 14 Bảng 1.7. Tiêu chuẩn của Bộ Y tế đối với nhóm sữa chua 15 Bảng 1.8. Tiêu của Bộ Y tế đối với nhóm kem, nước đá .15 Bảng 1.9. Bảng phân loại độc tố của C. perfringens 22 Bảng 2.1. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm sữa .44 Bảng 2.2. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với các loại nước giải khát 44 Bảng 2.3. Chỉ tiêu phân tích vi sinh của Bộ Y tế đối với nhóm kem .44 Bảng 2.4. Kích thước vạch khuếch đại của các vi khuẩn nghiên cứu 49 Bảng 2.5. Trình tự các mồi được sử dụng trong phản ứng PCR .50 Bảng 3.1. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm sữa tại TP. HCM theo phương pháp PCR và ni cấy 63 Bảng 3.2. Thống kê kết quả kiểm tra trên mẫu sữa tại TP. HCM bằng phương pháp PCR và ni cấy 66 Bảng 3.3. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nước giải khát tại TP. HCM theo phương pháp PCR và ni cấy .68 Bảng 3.4. Thống kê kết quả kiểm tra trên nhóm nước giải khát tại TP. HCM theo phương pháp PCR và ni cấy .70 Bảng 3.5. Kết quả khảo sát tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm kem tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy .72 Bảng 3.6. Thống kê kết quả kiểm tra trên nhóm kem tại TP. HCM theo phương pháp PCR và nuôi cấy 73 Bảng 3.7. Tính tương đồng của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy đối với chỉ tiêu Salmonella, E. coli và S. aureus .77 Bảng 3.8. Tính tương đồng của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy đối với chỉ tiêu B. cereus và C. perfringens77 DANH MUẽC CAC HèNH Trang Hỡnh 2.1. Thang DNA 100bp .37 Hỡnh 2.2. Cỏc bc ca phn ng PCR . 38 Hỡnh 2.3. S bn sao DNA tng theo tng chu k trong phn ng PCR .39 Hỡnh 2.4. a mu vo mỏy PCR .48 Hỡnh 3.1. Th nghim sinh húa khng nh Salmonella 58 Hỡnh 3.2. Th nghim sinh húa khng nh E. coli 58 Hỡnh 3.3. Th nghim sinh húa khng nh S. aureus .59 Hỡnh 3.4. Th nghim sinh húa khng nh B. cereus . 59 Hỡnh 3.5. Th nghim sinh húa khng nh C. perfringens .59 Hỡnh 3.6. Kt qu phỏt hin E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus v C. perfringens bng k thut PCR .59 Hỡnh 3.7. Khun lc B. cereus . 60 Hỡnh 3.8. Th nghim sinh húa khng nh B. cereus . 60 Hỡnh 3.9. Th nghim sinh húa khng nh C. perfringens 60 Hỡnh 3.10. Khun lc C. perfringens .61 Hỡnh 3.11. Kt qu phỏt hin E. coli, Salmonella, B. cereus, S. aureus v C. perfringens bng k thut PCR 62 DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ Trang Biểu đồ 3.1. Tình hình nhiễm vi sinh vật trong mẫu sữa trên địa bàn TP. HCM 63 Biểu đồ 3.2. Tình hình nhiễm vi sinh vật trên nước giải khát tại địa bàn TP. HCM .66 Biểu đồ 3.3. Tình hình nhiễm vi sinh vật trên nhóm kem tại địa bàn TP. HCM .68 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Theo báo cáo của tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), hàng năm có tới 30% dân số ở các nước phát triển bị bệnh do thực phẩm, chủ yếu là ngộ độc thực phẩm (NĐTP), ở các nước đang phát triển các trường hợp ngộ độc thực phẩm lại cao hơn nhiều [25]. Ngộ độc thực phẩm trong những năm gần đây được ghi nhận khá thường xuyên và đã trở thành mối quan tâm của toàn xã hội. Ở các nước phát triển, tình hình ngộ độc thực phẩm luôn là vấn đề được quan tâm vì những tổn thất lớn về kinh tế và con người do ngộ độc thực phẩm gây ra. Tại Mỹ, theo thống kê của trung tâm Kiểm soát và Phòng chống bệnh (CDC), hàng năm có khoảng 76 triệu ca ngộ độc thực phẩm và 5.000 trường hợp tử vong. Thiệt hại do các trường hợp ngộ độc thực phẩm ước tính khoảng từ 5 đến 17 tỉ USD [34]. Cũng như nhiều quốc gia khác, tại Việt Nam vấn đề ngộ độc thực phẩm ngày càng gia tăng, đặc biệt trong hai năm gần đây hiện tượng này càng phổ biến hơn. Mỗi năm, nước ta có 250 - 500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000 - 10.000 nạn nhân và 100 - 200 ca tử vong. Nhà nước cũng phải chi trên 3 tỉ đồng cho việc điều trị, xét nghiệm và truy tìm nguyên nhân [50]. Theo thống kê chưa đầy đủ của cục Vệ sinh an toàn thực phẩm từ năm 2000 đến năm 2006, cả nước đã xảy ra 988 vụ ngộ độc thực phẩm với 23.190 người bị ngộ độc và 263 người chết [44]. Trong đó, có 155 vụ ngộ độc tại bếp ăn tập thể với 14.653 người bị ngộ độc bao gồm : 97 vụ NĐTP tại các khu công nghiệp, khu chế xuất với 9.989 người bị ngộ độc; 58 vụ NĐTP trong các trường học với 3.790 cháu bị ngộ độc và 2 cháu tử vong. Riêng tại TP. HCM có 113 vụ NĐTP với 7.688 người bị ngộ độc và 7 người tử vong. Tại Hà Nội xảy ra 37 vụ NĐTP với 370 người ngộ độc và 2 người tử vong [49]. Trong tổng số 988 vụ ngộ độc thực phẩm của cả nước (từ năm 2000 đến năm 2006), có 161 vụ NĐTP do thức ăn đường phố (thực phẩm chế biến sẵn bán trên vỉa hè trước các chợ, công viên, trường học) với 3.759 người bị ngộ độc và 7 người tử vong. Thực trạng vấn đề ngộ độc do thức ăn đường phố hiện nay ở nước ta ngày càng gia tăng, hiện tượng vi phạm quy định về vệ sinh an toàn thực phẩm đối với nhó m thực phẩm đường phố phổ biến. Trong khi đó, tình hình kiểm tra, giám sát của cơ quan chức năng đối với nhóm thực phẩm này gặp nhiều khó khăn và chưa đạt hiệu quả [48]. Có nhiều nguyên nhân khác nhau có thể gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm như nhiễm vi sinh, nhiễm các hóa chất độc hại hoặc dư lượng thuốc trừ sâu và thuốc bảo vệ thực vật trong thực phẩm quá mức cho phép, nhưng phần lớn các trường hợp có nguồn từ vi sinh vật, do sự hiện diện của vi si nh vật gây bệnh hay sự hiện diện của độc tố tiết ra bởi các vi sinh vật gây bệnh [46]. Ngày nay, yêu cầu an toàn vệ sinh thực phẩm nhất là về phương diện vi sinh trở thành một trong những tiêu chuẩn không thể thiếu đối với chất lượng thực phẩm. Việc phân tích, phát hiện vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm và thực hiện các biện pháp đảm bảo đạt tiêu chuẩn về an toàn vi sinh trong sản xuất chế biến thực phẩm, đặc biệt là nhóm thực phẩm đường phố ngày càng được quan tâm [43]. Chính vì những lí do trên, chúng tôi chọn đề tài “Ứng dụng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố” 2. Sơ lược vấn đề nghiên cứu Tại Việt Nam, việc phát hiện các vi sinh vật gây bệnh chủ yếu dựa vào phương pháp nuôi cấy truyền thống, tốn nhiều thời gian, thao tác phức tạp và độ nhạy chưa cao. Trong khi đó, nhiều phương pháp mới như: phương pháp ELISA, phương pháp PCR, phương pháp sử dụng mẫu dò, phương pháp phát hiện vi sinh vật dựa trên kỹ thuật phát quang sinh học,… có nhiều ưu điểm về thời gian, độ nhạy và độ chính xác cao đang đư ợc phát triển rộng rãi trên thế giới và đang dần thay thế cho phương pháp truyền thống. Cũng như các nước, nhu cầu thực tế tại Việt Nam hiện nay là cần ứng dụng những kỹ thuật mới này vào việc kiểm tra, giám sát tình hình nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm để nhanh chóng phát hiện các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm và ngăn ngừa một cách có hiệu quả các tác hại từ ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật gây ra. Với nhu cầu thực tiễn như trên, Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học phân tử Trường Đại học Kh oa học tự nhiên, ĐHQG TP. HCM đã tiến hành xây dựng các quy trình và bộ kit PCR phát hiện nhanh các vi sinh vật gây ngộ độc trên thực phẩm như: Escherichia coli, Salmonella, Staphylococcus aureus, Bacillus cereus và Clostridium [...]... được ứng dụng để khảo sát tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm trên các mẫu thực tế và so sánh với kết quả theo phương pháp nuôi cấy truyền thống Tuy nhiên, trong thực phẩm đường phố chưa được nghiên cứu và khảo sát để đưa ra kết luận cụ thể về mức độ nhiễm vi sinh ở nhóm thực phẩm này Vì thế, đề tài luận văn này phần nào đáp ứng được nhu cầu thực tế về kiểm tra vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố hiện... khát và kem tại các Quận: 3, 5, 8, 10 và quận Tân Bình thuộc địa bàn TP HCM 6 Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân tích các chỉ tiêu vi sinh vật gây bệnh trong các mẫu thực phẩm đường phố bằng phương pháp PCR và phương pháp nuôi cấy truyền thống - Đánh giá tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong nhóm thực phẩm đường phố trên so với chỉ tiêu cho phép của Bộ Y tế - So sánh, đánh giá kết quả phân tích của phương. .. khó xử lý, vì vậy mà vi c giám sát vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố hiện đang gặp rất nhiều khó khăn và cần sự phối hợp đồng bộ của toàn xã hội để giám sát tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm đường phố hiện nay ở nước ta [48] Chính vì những lí do trên mà hiện nay, vi c khảo sát để đưa ra kết luận về tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố so với tiêu chuẩn cho phép... 1.3 Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong thực phẩm 1.3.1 Phương pháp truyền thống Phương pháp nuôi cấy có lịch sử phát triển và ứng dụng lâu dài từ những năm 80 của thế kỷ XIX, nên đã được các cơ quan có thẩm quyền công nhận ở mức quốc gia cũng như quốc tế Hiện nay, các phương pháp nuôi cấy đang được sử dụng rộng rãi và được công nhận là phương pháp chuẩn trong xét nghiệm vi sinh vật gây bệnh [7],... hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm trong khoảng 1 - 2 ngày, trong khi đó, phương pháp nuôi cấy truyền thống là 5 - 7 ngày [8] + Thao tác đơn giản, có thể phân tích những vi sinh vật khó nuôi cấy, vi c nuôi cấy tăng sinh đơn giản không cần qua giai đoạn tăng sinh chọn lọc + Hoá chất cần cho phản ứng PCR dễ tìm, dễ bảo quản Không sử dụng nhiều môi trường nuôi cấy phức tạp như phương pháp nuôi cấy [4]... các vi sinh vật trong môi trường nuôi cấy [8], [24] 1.3.3 Ưu điểm và nhược điểm của các phương pháp - Phương pháp truyền thống để phát hiện vi sinh vật gây bệnh được xem là phương pháp chuẩn và đang được sử dụng phổ biến trong các phòng thí nghiệm và các trung tâm phân tích Tuy nhiên, vi c phát hiện bằng phương pháp này tốn nhiều thời gian (5 - 7 ngày), tốn kém và mất nhiều công sức [8] - Phương pháp. .. điểm trên mà phương pháp PCR đang ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các xét nghiệm vi sinh 1.4 Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR vào vi c kiểm tra các vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm trên thế giới và tại Vi t Nam 1.4.1 Lịch sử ra đời kỹ thuật PCR Phương pháp PCR được Kary Mullis người Mỹ phát minh vào năm 1985 và được thừa nhận chính thức từ năm 1993, ông đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng... nghiên cứu Mục đích nghiên cứu của đề tài luận văn này là ứng dụng các quy trình và bộ kit PCR nói trên để phát hiện E coli, S aureus, Salmonella, B cereus và C perfringens trong thực phẩm đường phố tại TP HCM, đồng thời so sánh với kết quả theo phương pháp nuôi cấy Từ đó, khảo sát được tình hình nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố trên địa bàn TP HCM so với chỉ tiêu cho phép của nhà... liệu Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và biện luận Kết luận và đề nghị Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thực trạng vấn đề ngộ độc thực 1.1.1 Khái niệm ngộ độc thực phẩm Ngộ độc thực phẩm là khái niệm chung để chỉ các triệu chứng gây ra do sử dụng thực phẩm bị nhiễm vi sinh vật gây bệnh, các chất độc từ môi trường hoặc chất độc tự nhiên có trong bản thân thực phẩm [27] Theo... - So sánh, đánh giá kết quả phân tích của phương pháp PCR so với phương pháp nuôi cấy truyền thống - Rút ra kết luận của đề tài - Đề nghị và hướng phát triển của đề tài 7 Phương pháp nghiên cứu - Các phương pháp phân tích chỉ tiêu vi sinh: phương pháp PCR, phương pháp nuôi cấy, phân lập, các phương pháp thử nghiệm hóa sinh - Xử lí kết quả bằng phương pháp thống kê toán học đơn giản 8 Dự kiến cấu trúc . REACTION) VÀ PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY ĐỂ KHẢO SÁT SỰ NHIỄM VI SINH VẬT GÂY BỆNH TRONG THỰC PHẨM ĐƯỜNG PHỐ Chuyên ngành : Vi sinh vật học . Reaction) và phương pháp nuôi cấy để khảo sát sự nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm đường phố 2. Sơ lược vấn đề nghiên cứu Tại Vi t Nam, vi c phát