Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên men acetic để làm giấm trái cây

Trong các loại thực phẩm lên men thì giấm ăn là loại gia vị, thực phẩm phổ biến và phần lớn các gia đình Việt Nam đều sử dụng. Giấm sử dụng trong che biến thực phẩm hàng ngày, bảo quản thực phẩm, làm gia vị chế biến thực phẩm. Ngoài ra, giấm được dùng như bài thuốc chữa nấc cục, buồn nôn, tàn nhang, lở loét, các vết cắn của chó, bò cạp, rết hay côn trùng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP.HCM

NGUYỄN TRƯƠNG BẢO TRÂN

CHỌN GIỐNG VI KHUẨN VÀ KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN ACETIC

ĐỂ LÀM GIẤM TRÁI CÂY

Chuyên ngành : Vi sinh vật học

Mã Số : 60 42 40

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS TRỊNH THỊ HỒNG

Thành phố Hồ Chí Minh – 2007

LỜI CẢM ƠN

Em xin chân thành cảm ơn CÔ- TIẾN SĨ TRỊNH THỊ HỒNG- đã

tạo điều kiện và tận tình chỉ bảo để em hoàn thành luận văn này

Em vô cùng cảm ơn CÁC THẦY CÔ KHOA SINH HỌC TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM đã truyền những kiến thức quý báu

trong suốt quá trình em học tại trường

Em xin chân thành cảm ơn CÁC THẦY CÔ VÀ CÁC BẠN PHÒNG THÍ NGHIỆM BỘ MÔN VI SINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN đã giúp đỡ và tạo điều kiện tốt cho em trong

suốt thời gian em thực hiện đề tài

Tôi xin cảm ơn CÁC BẠN HỌC VIÊN CAO HỌC KHOÁ 15 cùng ĐỒNG NGHIỆP BẠN BÈ đã ở bên cạnh giúp tôi hoàn thành

luận văn này

Con vô cùng biết ơn BA MẸ và MỌI NGƯỜI TRONG GIA ĐÌNH mãi mãi là chỗ dựa vững chắc và ấm áp cho con

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Trong các loại thực phẩm lên men thì giấm ăn là loại gia vị, thực phẩm phổ biến và phần lớn các gia đình Việt Nam đều sử dụng Giấm sử dụng trong che biến thực phẩm hàng ngày, bảo quản thực phẩm, làm gia vị chế biến thực phẩm Ngoài ra, giấm được dùng như bài thuốc chữa nấc cục, buồn nôn, tàn nhang, lở loét, các vết cắn của chó, bò cạp, rết hay côn trùng

Ở Việt Nam, quá trình “lên men” acetic rất quen thuộc với nhân dân thông qua việc nuôi giấm trong gia đình Giấm được tạo ra bằng phương pháp lên men dân gian từ các nguyên liệu như chuối, dứa, nước dừa, rượu ngũ cốc, rượu trái cây Nước ta có rất nhiều loại trái cây, có thể sử dụng các loại trái cây này để làm giấm

Do đó, đề tài “Chọn giống vi khuẩn và khảo sát một số điều kiện lên

men acetic để làm giấm trái cây” rất có ý nghĩa đối với sản xuất và đời sống

2 Mục đích của đề tài nghiên cứu

Tìm điều kien để vi khuẩn sinh acetic acid sinh trưởng mạnh

Tìm biện pháp tối ưu để tăng hiệu suất lên men acetic trong thời gian ngắn, tạo ra những sản phẩm giấm trái cây thơm ngon và có giá trị dinh dưỡng cao

3 Phương pháp nghiên cứu

Phương pháp nghiên cứu tài liệu nhằm xây dựng tổng luận nghiên cứu: Thu thập tài liệu, nghiên cứu, phân tích, tổng hợp những tài liệu về những nội dung có liên quan đến đề tài

Phương pháp thực nghiệm, chứng minh

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Các loại giấm thông dụng và một số vấn đề về giấm trái cây

1.1.1 Sơ lược lịch sử lên men acetic [12], [31], [32]

Từ đầu thế kỷ XIV ở Pháp đã có những cơ sở công nghiệp sản xuất giấm Đến năm 1786 người ta đã bắt đầu để ý đến vai trò cua oxy và nhấn mạnh

độ thoáng khí ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ tạo thành giấm

Năm 1822 Person đã chú ý đến 1 lớp màng mỏng phát triển trên bề mặt

giấm và ông đặt tên Mycoderma (là 1 loài vi khuẩn hiếu khí )

Từ năm 1837 đến 1838 Turpin và Kiizing đã nhấn mạnh quá trình lên men

acetic là do vi sinh vật và đặt tên vi sinh vật đó là Ulviva acetic

Năm 1862 đến 1868, nhà bác học người Pháp Louis Pasteur khám phá ra được bản chất của quá trình lên men này Ông miêu tả được vi khuẩn sinh acid acetic hiện diện trong màng mỏng của giấm, và chứng minh được quá trình lên men giấm thực chất là quá trình chuyển hóa rượu thành acid acetic

trong điều kiện có oxy và ông đặt tên vi khuẩn này là Mycoderma aceti

Năm 1901 M.W Bejerinck phân lập thuần khiết được vi khuẩn lên men

acetic và gọi là vi khuẩn Acetobacter

Ngày nay ứng dụng của quá trình lên men acetic, người ta đã sản xuất nhiều loại giấm khác nhau, thường là giấm ăn chứa khoảng 3% acid acetic

1.1.2 Các loại giấm thông dụng [28], [42]

- Giấm cồn “Spirit vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua, dung dịch cồn nguyên chất được pha loãng, có bổ sung các muối vô cơ và chất dinh dưỡng

- Giấm vang “Wine vinegar” : là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch rượu vang nho

- Giấm gạo “Rice vinegar”: là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch bột gạo đã được chuyển hoá thành đường rồi thành rượu

- Giấm mạch nha “Malt vinegar” là sản phẩm của quá trình lên men chua dịch tinh bột đã được chuyển hoá thành malt

- Ngoài ra giấm còn được làm từ các loại nước trái cây khác : nước ép thơm, nước ép trái điều, nước dừa Từ rượu vang các loại: vang dứa, vang sơri, vang mít…

1.1.3 Thành phần của giấm ăn [28], [42]

Bên cạnh acetic acid và ethanol, giấm còn chứa các sản phẩm thứ cấp,

có vai trò quan trọng trong việc tạo mùi vị… Những thành phần này có nguồn gốc từ nguyên liệu hay được bổ sung trong khi lên men, tạo thành do vi khuẩn Acetic hoặc do mối tương tác giữa các sản phẩm tạo thành Trong giấm còn

có những hợp chất không giải thích được nguồn gốc

Trong giấm chứa nhiều amino acid (ví dụ giấm cồn có 18 loại amino acid), nguồn gốc amino acid được tạo ra chủ yếu từ sự tự phân của vi khuẩn Acetic

Các hợp chất bay hơi: Trong giấm có chứa nhiều hợp chất bay hơi khác nhau như ethylacetate, aldehyt, ethylformate…

1.1.4 Nguyên liệu sử dụng để làm giấm [12], [24]

Ethanol là nguyên liệu trực tiếp để lên men tạo acid acetic Ngòai ra còn dùng dung dịch chứa đường như: mật rỉ đường, mật ong, các loại trái cây có chứa đường (nho, lê, đào, táo, chuối,mận,dứa…) hay tinh bột đã qua quá trình đường phân

Nguyên liệu có bột  Đường  Rượu  acid acetic

Nguyên liệu có đường  Rượu  acid acetic

Nguyên liệu có rượu  acid acetic

Các muối khoáng, nguồn Nitơ dễ đồng hóa (muối Amon) hết một lượng

ít acid acetic để tạo pH ban đầu thích hợp cho vi khuẩn họat động lên men Nồng độ rượu thích hợp là 6-15% Khi hết rượu vi khuẩn có thể oxy hóa acid acetic thành CO2 và H2O theo phương trình:

CH3COOH + 2O2  CO2 + H2O

Vì thế trong quá trình lên men bao giờ cũng phải đảm bảo hàm lượng ethanol tối thiểu là 0,3-0,5%

1.1.5 Đặc điểm 1 số loại trái cây sử dụng để làm giấm

I.1.5.1 Đặc điểm của dứa [9] ,[29]

Dứa có tên khoa học là Ananas Comonus thuộc họ Bromeliace (lớp thứ Một lá mầm ), là cây ăn quả nhiệt đới có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới Châu Mỹ- Braxin hay Paragoay, do đó thích hợp nhiệt độ cao và độ ẩm cao Dứa là loại cây không kén đất vì chúng có thể sinh trưởng trên các vùng gò đồi, dốc (20 độ trở xuống), nghèo dinh dưỡng như đất phèn ở Đồng bằng Sông Cửu Long, đất đá vôi, đất vàng đỏ ở ở các tỉnh miền Bắc Sau 1-2 năm trong dứa có thể cho năng suất 10-12 tấn/ha, thậm chí là 30-35 tấn/ha

Hàm lượng đường trong dứa trung bình từ 8-12%, có nơi trồng giống tốt

và chăm sóc tốt tỷ lệ đường đạt đến 15-16% (trong đó 66% đường dưới dạng saccaroz và 34% dưới dạng fructoz và glucoz )

Dứa có độ acid khoảng 0,6% (trong đó có tới 87% acid citric)

Hàm lượng chất tro chiếm 0,4-0,6% trọng lượng (chủ yếu là kali, magie

và canxi)

Trong dứa có chứa nhiều vitamin C : 24-28mg/100g

Trong dứa có enzym Bromelin có tác dụng tiêu hoá rất tốt

Dứa cung cấp năng lượng đáng kể cho cơ thể con người: 1kg trái dứa cho 400-420 calo hoặc 150ml nước dứa cung cấp 100-150 calo

Bảng 1.1 : Thành phần dinh dưỡng của dứa

B1 B2

PP

C

0,05 0,01 0,1

14

1.1.5 Đặc điểm của nho [9], [29]

Nho là loại cây ăn trái có giá trị dinh dưỡng và kinh tế cao, được nhập vào Việt Nam vào đầu của thập niên 70 thế kỉ trước và ngày càng được trồng

phổ biến ở một số vùng của nước ta

Thành phần dinh dưỡng của nho được trình bày ở bảng sau

Bảng 1.2: Thành phần dinh dưỡng của nho

Pyridoxin (B6) mg 0,16-0,5

1.1.6 Các tác nhân gây hại giấm [18], [20], [24], [28]

Giấm dễ bị hỏng trong thời gian bảo quản do nhiều nguyên nhân

Giấm chưa đạt chất lượng dễ bị oxy hóa quá mức tạo thành CO2 và

H2O làm giấm bị giảm độ chua và vẩn đục

Các vi sinh vật làm hư giấm như nấm men thuộc giống Candida

Các sinh vật làm hư giấm như: lươn giấm, ruồi giấm, bọ giấm…

Lươn giấm có tên là Anguila aceti, là loại sâu phổ biến trong

sản xuất giấm Nó có dạng giống giun tròn, có thể nhìn thấy bằng kính lúp Chúng xúât hiện trong thùng lên men giấm và trong dung dịch rượu trước khi lên acid hóa Con đực trưởng thành dài 1mm, con cái dài 1-2mm Lươn giấm sinh sản và phát triển mạnh ở nồng độ giấm thấp, ở nồng độ acid cao từ 9-10% chúng bị ưc chế nhưng không hoàn toàn ngưng sinh sản, với nồng độ cao hơn chúng mới chết Lươn giấm sống bằng cách ăn vi khuẩn acetic, một phần rượu, acid acetic, đạm, các khoáng hòa tan làm giảm độ chua của giấm Lươn giấm không độc đối với nguời, nhưng với số lượng lớn, chúng làm vỡ màng giấm, làm vẩn đục giấm và giấm không ngon Lươn giấm có trong giấm là do không vệ sinh sạch sẽ trong quá trình lên men

Ruồi giấm : làm giảm acid, sinh ấu trùng, có thể ăn vi khuẩn

Acetic

Vi khuẩn Lactic:Vi khuẩn Lactic tạo mùi khó chịu và làm mất màu giấm, giảm độ chua Có 3 cách chống vi khuẩn lactic:

o Lọc và tiệt trùng rượu đã lên men

o Bổ sung giấm ngon vào dịch trước khi lên men

tạo độ chua ban đầu để hạn chế vi khuẩn lactic

o Bổ sung SO2 vào giấm

Giấm chuyển thành màu đen: do 3 nhân tố là tannin,sắt và các men oxy hóa Khắc phục tannin và sắt bằng cách thông khí và lọc Một số men oxy hóa cũng làm thay đổi màu

giấm, khắc phục bằng cách thanh trùng Pasteur

1.1.7 Các tiêu chuẩn về thực phẩm của giấm ăn [26], [28], [42]

Giấm ăn là loại thực phẩm không độc đối với người và không có vi sinh vật gây bệnh Một mẫu giấm phải đạt các tiêu chuẩn sau:

Trạng thái cảm quan tốt: giấm trong suốt hoặc hơi đục (nếu nguyên liệu là tinh bột), màu trắng trong (giấm rượu, nước dừa…) hoặc có màu vàng nhạt đến nâu (giấm bia, rượu vang, rỉ đường, trái cây…) Mùi vị chua dịu, có thể có mùi của nguyên liệu như rượu, bia, rỉ đường…Nếu giấm có nhiều mùi vị của nguyên liệu thì sự lên men chưa đạt, giấm chóng hỏng

Không có lươn giấm

Không chứa acid vô cơ tự do

Không có kim loại nặng

Không chứa phẩm màu

Không chứa chất sát trùng

Không chứa hơn 2% ethanol

1.1.8 Bảo quản giấm ăn [28], [42]

Giấm thu được sau khi lên men gọi là giấm tươi, giấm có ít hoặc nhiều

vẩn đục do chứa vi khuẩn acetic và các chất phân hủy từ nguyên liệu ban đầu

nên cần được xử lý trước khi tiêu thụ

Phương pháp thanh trùng Pasteur

Các loại giấm sản xuất từ rượu vang, dịch ép trái cây thường tạo tủa ở đáy chai sau 1 thời gian bảo quản Người ta thanh trùng bằng cách đun sôi ở 75o-

80oC trong 30-40 giây,nếu thanh trùng ở nhiệt độ cao thì ảnh hưởng đến mùi

vị và giấm bị đục

Sử dụng chất chống oxy hóa (Sulfit)

SO2 là tác nhân chống oxy hóa được phép sử dụng trong bảo quản thực phẩm với hàm lượng thấp hơn 10mg/l SO2 được thêm vào dạng khí hoặc

K2SO3 ngay trước khi đóng chai SO2 có tác dụng làm giảmvận tốc oxy hóa các chất có gốc aldehyt, aceton tự do trong giấm

Màu và sự khử màu

Các chất màu có trong giấm có nguồn gốc từ nguyên liệu sử dụng ban đầu hoặc các chất tạo ra trong quá trình lên men Ví dụ: màu vàng do caramen hoặc những chất màu khác cho phep sử dụng trong thực phẩm Giấm làm từ nguyên liệu tự nhiên đôi khi cần có màu như màu đỏ của giấm làm từ vang

đỏ có ý nghĩa cảm quan Ở một số nước giấm được bán sau khi đã qua khử màu bằng than hoạt tính

Đóng chai và bảo quản sản phẩm

Giấm thành phẩm dùng trong gia đình được chứa trong chai nhựa hoặc chai thủy tinh và bảo quản bằng cách gắn xi trên nắp chai

Giấm sử dụng trong chế biến bảo quản thực phẩm được chứa trong những thùng có dung tích lớn và kín

Trong gia đình, có thể bảo quản những lọ giấm bằng cách cho cào vài tép tỏi hoặc 1 ít muối ăn

Bảo quản giấm ở điều kiện thóang mát, tránh ánh sáng mặt trời và nhiệt độ cao Giấm đã qua lọc bảo quản được lâu hơn

1.2 Vi khuẩn lên men sinh Acid Acetic

1.2.1 Đặc điểm chung [13], [30], [37], [42], [47],[50]

Vi khuẩn sinh acetic acid là những vi sinh vật Gram âm, hiếu khí bắt buộc, có hình que và rất phổ biến trong tự nhiên Chúng sử dụng oxygen làm chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp Vi khuẩn sinh acetic acid thường hiện diện trong những môi trường có đường, alcohol hay các môi trường acid hoá như trái cây, các loài hoa hoặc các sản phẩm lên men rượu Khả năng oxy hoá ethanol tạo thành acetic acid và tiết ra môi trường được

xem là đặc điểm chung của vi khuẩn sinh acetic acid Vi khuẩn Acetic di động

nhờ 1-8 tiêm mao ở cực hay chu mao, hoặc không di động Không hình thành nội bào tử

Đặc điểm hình thái [13]

Các đặc điểm hình thái thường được khảo sát gồm màu sắc, hình dạng khuẩn lạc, trạng thái Gram, cách sắp xếp, hình dạng và kích thước tế bào Ngoài ra, số lượng và cách sắp xếp roi trên tế bào cũng có vai trò trong việc định danh vi khuẩn sinh acid acetic

Đặc điểm sinh thái [13], [39]

Đặc điểm phân bố của vi khuẩn sinh acid acetic thường gắn liền với nguồn dinh dưỡng chứa đường hay alcohol như các loại hoa, quả, bia, rượu

và ở các nơi sản xuất giấm

Đặc điểm sinh lý, sinh hóa [13], [30], [34], [38], 40], [41],[42], [48], [49]

Các đơn vị phân loại thuộc nhóm vi khuẩn sinh acetic acid được phân biệt bởi các điểm sinh lý, sinh hoá sau:

- Oxy hoá acetate và lactate tạo CO2 và H2O

- Phát triển ở các khoảng nhiệt độ, áp suất thẩm thấu và pH khác nhau

- Phát triển sinh khối khi nuôi cấy trong các môi trường chứa: D-glucose 30%; acid acetic 0.35%; KNO3 1.0%; methanol; glutamate; mannitol

- Sinh acetic acid từ nguồn cơ chất ethanol

- Tạo sắc tố hoà tan trong nước

- Tạo các polysaccharide có cấu trúc giống levan

- Đồng hoá ammonia trong môi trường chứa D-glucose, D-mannitol hay ethanol

- Tạo dihydroxyaceton từ glycerol

- Phát triển sinh khối và tạo acid trong các môi trường có nguồn carbon duy nhất là: D-glucose, D-mannose, D-galactose, D-fructose, L-sorbose, D-

xylose, D-arabinose, L-rhamnose, D-mannitol, D-sorbitol, D-arabitol,

meso-ribitol, dulcitol, meso-erythritol, myo-inositol, glycerol, maltose, lactose, melibiose, sucrose, sucrose, raffinose và ethanol

1.2.2 Vai trò của vi khuẩn sinh acetic acid [13]

Các ứng dụng và triển vọng sử dụng vi khuẩn sinh acetic acid

- Sản xuất giấm

- Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học: Đặc tính oxy hoá không

hoàn toàn nhiều loại nguồn carbon khác nhau của giống Gluconobacter đặc

biệt có ý nghĩa trong công nghệ sinh học và sản xuất công nghiệp Ví dụ:

G.oxydans có vai trò rất quan trọng ở giai đoạn chuyển hoá D-sorbitol thành

L-sorbose trong nghành công nghiệp sản xuất vitamin C; G.oxydans còn được

sử dụng trong sản xuất dihyroxyacetone (DHA) nhờ quá trình chuyển hoá glycerol

- Sản xuất một số loại nước giải khát lên men truyền thống Ví dụ: sản xuất rượu Kombucha, 1 loại nước giải khát có vị hơi chua và sủi bọt được ưa thích ở Nhật Bản, Trung Quốc, An Độ và một số nước Châu Au, là quá trình

lên men trà đen đã bổ sung đường bởi tổ hợp nấm men cùng 3 giống

Acetobacter, Gluconobacter và Gluconacetobacter

-Sản xuất cellulose vi khuẩn

1.2.3 Phân loại [13]

Vi khuẩn sinh acetic acid được phân loại trong họ Acetobacteraceae

thuộc phân lớp -Proteobacteria Theo International Journal of Systematic

and Evolutionary Microbiology (IJSEM)- Tạp chí Quốc Tế về Phân loại và

Tiến hóa của Vi sinh vật, cho đến nay họ Acetobacteraceae có 10 giống gồm:

Acetobacter Beijerinck 1898, Gluconobacter Asai 1935, Acidomonas

Urakami và cộng sự 1989, Gluconacetobacter Yamada và cộng sự 1998,

Asaia Yamada và cộng sự 2000, Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002, Saccharibacter Jojima và cộng sự 2004, Swaminathania Loganathan và Nair

2004, Neoasaia Yukphan và cộng sự 2006, và Granulibacter Greenberg và

cộng sự 2006

1.2.3.1 Giống Acetobacter Beijerinck 1898

Beijerinck (1898) dùng thuật ngữ “ Acetobacter” để chỉ các vi khuẩn

hiếu khí hình que, Gram âm, có khả năng sinh acetic acid từ ethanol Các

chủng Acetobacter có thể dễ dàng phân biệt với các loài thuộc những giống khác trong họ Acetobacteraceae bởi các đặc điểm kiểu hình sau: Q-9 là thành

phần ubiquinone chính trong màng tế bào và oxy hoá 2 nguồn cơ chất acetate

và lactate cho sản phẩm cuối cùng là CO2 và H2O

Hiện nay, giống Acetobacter gồm 16 loài gồm: A aceti,

A.pasteurianus, A.pomorum, A.indonesiensis, A.tropicalis, A.orientalis, A.syzygii, A.cibinogensis, A.tropicalis, A.orientalis, A.cibinogensis, A.estunensis, A.orleanensis, A.peroxydans, A.cerevisiae, A.malorum, A.oeni

và A.nitrogenifigens; A.aceti là loài điển hình của giống

1.2.3.2 Giống Gluconobacter Asai 1935

Giống thứ hai trong họ Acetobacteraceae, Gluconobacter được đề

nghị bởi Asai vào năm 1935 Vào thời điểm này tất cả các chủng vi khuẩn có

khả năng sinh acetic acid đều được định danh là giống Acetobacter, Asai đã

đề nghị phân loại các chủng có khả năng tạo acetic acid từ ethanol kém nhưng oxy hoá mạnh D-glucose thành D-gluconic vào 1 nhóm phân loại mới với tên

giống là Gluconobacter, các chủng có khả năng oxy hoá mạnh ethanol thành acetic acid vẫn được xác định là Acetobacter

1.2.3.3 Giống Acidomonas Urakami và cộng sự-1989

Tên giống Acidomonas được đề nghị bởi Urakami và cộng sự (1989) với chỉ 1 loài là Acidomonas methanolica Giống này được công nhận với các

đặc điểm Gram âm, tế bào hình que, ưa acid và đặc biệt là có khả năng dinh dưỡng methyl tùy ý

1.2.3.5 Giống Asaia Yamada và cộng sự-2000

Giống Asaia được giới thiệu là giống thứ năm trong họ

Acetobacteraceae bởi Yamada và cộng sự (2000) Các loài Asaia có những

đặc điểm khá khác biệt so với các giống đã biết; Không sinh acetic acid hoặc tạo thành 1 lượng rất ít từ nguồn cơ chất ethanol và hầu như bị kìm hãm phát

triển trong môi trường có chứa acid acetic với nồng độ 0,35% Hầu như tất cả

các chủng Asaia được phân lập từ các loài hoa ở vùng nhiệt đới và phát triển

tốt trong môi trường có nguồn cơ chất là đường

1.2.3.6 Giống Kozakia Lisdiyanti và cộng sự 2002

Giống mới Kozakia được phát hiện khi Lisdiyanti (2002) khảo sát 1

cụm phát sinh loài mới trên cây phát sinh loài của vùng trình tự 16S đối với các chủng vi khuẩn sinh acetic acid phân lập tại Indonesia

1.2.3.7 Giống Swaminathania Loganathan và Nair 2004

Các chủng Swaminathania phân lập từ cây lúa hoang mọc ở khu vực

sinh thái ngập mặn Loganathan và Nair (2004) xác định giống

Swaminathania dựa vào khả năng sinh acetic acid từ ethanol và vị trí phân

loại của các chủng thuộc giống này trên cây phát sinh được xây dựng dựa vào trình tự 16S rDNA

1.2.3.8 Giống Saccharibacter Jojima và cộng sự 2004

Đặc điểm nổi bật của Saccharibacter là tính ưa áp suất thẩm thấu, chỉ

có thể tồn tại và phát triển trong môi trường có nồng độ đường cao từ 5-40%

Ngoài ra, Saccharibacter không sinh acid acetic từ ethanol và không thể phát

triển trong môi trường có 0,35% c acid acetic

1.2.3.9 Giống Neoasaia Yukphan và cộng sự 2006

Neoasaia, giống thứ chín trong họ Acetobacteraceae, được Yukphan

và cộng sự phát hiện và chỉ có 1 loài là Ne chiangmaiensis Giống này được

phân loại dựa vào đặc điểm kiểu hình cùng với kết quả phân tích trình tự vùng 16S rDNA, 16S-23S rDNA ITS và kết quả lai DNA bộ gen với loài điển hình của các chủng đã biết

1.2.3.10 Giống Granulibacter Greenberg và cộng sự 2006

Granulibacter là giống thứ 10 trong họ Acetobacteraceae được công

bố trên tạp chí IJSEM vào cuối năm 2006 Đây là giống đầu tiên thuộc họ

Acetobacteraceae được biết đến như chủng gây bệnh cho người khi được

phân lập từ bệnh nhân bị u hạch mãn tính

1.3 Cơ chế của quá trình lên men “Acetic” và 1 số phương pháp lên men

1.3.1 Cơ chế của quá trình lên men acetic [2], [12]

Acid acetic thu nhận từ nhiều phương pháp: Chưng cất gỗ, tổng hợp hóa học hay sinh học lên men Lên men acetic thực chất là quá trình oxy hóa không hoàn toàn ethanol thành acid acetic dưới tác dụng của vi khuẩn

Louis Pasteur là người khám phá ra cơ chế của quá trình lên men acetic vào năm 1802

Phương trình tổng quát:

CH3CH2OH + O2  CH3COOH +H2O + 117kcal Thực chất trải qua các giai đọan sau:

2CH3CH2OH + O2  CH3CHO +2H2O ethanol Acetaldehyt

CH3CHO + H2O  CH3CH(OH)2 Hydrat của acetaldehyt

CH3CH(OH)2 +1/2 O2 CH3COOH + H2O Acid acetic

Ngoài ra vi khuẩn Acetic còn có khả năng oxy hóa nhiều chất khác nhau như:

Propanol  acid propionic

Lactic acid  acetoin

Glycerine  dyhiroxyacetol

D-sorbitol  L-sorbose

D-Ribit  L-ribulose

D-Manit  D-Fructose

D-Glucose  acid gluconic  D-5-ketogluconic

Lactic acid  pyruvic acid

1.3.2 Những yếu tố ảnh hưởng đến sự lên men.[12]

1.3.2.1 Ảnh hưởng của nồng độ acid

Trong quá trình lên men acetic, nồng độ acid ảnh hưởng rất quan trọng đến sự lên men

Nếu nồng độ acid acetic đạt 8% sẽ ức chế họat động của vi khuẩn và nếu nồng độ đạt acid acetic từ 12-14% sẽ ức chế hoàn toàn vi khuẩn

1.3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ rượu

Nồng độ rượu trong môi trường lên men là 6-7% thể tích hoặc 14% đối với lọai vi khuẩn khác Nếu trong môi trường không có rượu thì vi khuẩn tiếp tục oxy hóa acid acetic để thu nhận năng lượng dùng trong sự sống Vì thế đây là 1 quá trình có hại

Việc sử dụng acid acetic bởi vi khuẩn dấm gọi là sự quá oxy hóa và acid acetic bị mất đi theo phản ứng:

CH3COOH + 2O2 =2CO2 +2H2O Trong sản xuất người ta thường giữ lại độ rượu trong môi trường là 0,3-0,5%

Sự quá oxy hóa phụ thuộc vào độ acid của môi trường Đối với những lòai vi khuẩn khác nhau tồn tại một giá trị pH giới hạn làm ngừng sự quá oxy hóa Giá trị pH đối với sự quá oxy hóa luôn cao hơn giá trị pH giới hạn đối với sự oxy hóa rượu 1 ít Do đó khi có rượu thì sẽ kìm hãm sự quá oxy hóa Đầu tiên rượu có mặt bị oxy hóa và chỉ khi độ acid chuyển sang giá trị giới hạn thì sự quá oxy hóa bắt đầu

1.3.2.3.Nhiệt độ

Vi khuẩn Acetobacter thuộc nhóm ưa ấm, nhiệt độ thích hợp đối với

chúng là từ 25-32oC Ở nhiệt độ thấp thì quá trình lên men xảy ra chậm.Ở nhiệt độ cao sẽ ức chế họat động và đến mức độ nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào làm tăng sự tổn thất cho vi khuẩn và hiệu suất của quá trình lên men giảm do sự bay hơi của acid acetic và rượu etylic

Tùy theo từng lòai mà nhiệt độ tối ưu cho quá trình oxy hóa sẽ thay đổi Nhưng trong sản xuất người ta dùng những lòai vi sinh vật thích ứng cho quá trình oxy hóa là 30-400C

1.3.2.4 Độ thoáng khí

Oxy là 1 yếu tố quan trọng và là nhân tố điều chỉnh quá trình lên men Theo cơ chế của quá trình oxy hóa, lượng không khí cung cấp cho quá trình lên men là tương đối lớn

Trong thực tế càng thóang khí năng suất càng cao( có giới hạn do năng suất của chủng vi khuẩn)

1.3.2.5 Ảnh hưởng của nguồn C.N P và các nguyên tố vi lượng

Để quá trình oxy hóa xảy ra nhanh, trong dịch lên men ngòai acid acetic, rượu etylic, dung dịch lên men cần đượcc bổ sung 1 số muối khóang (NH4)2SO4, (NH4)2PO4, KH2PO4, MgSO4, CaHPO4, FeCl3…tùy theo nhu cầu

cụ thể của từng loài Ngòai ra trong môi trường dung dịch còn được bổ sung thêm vitamin và chất kích thích sinh trưởng: pepton, cao nấm men, cao thịt, sữa…Theo nghiên cứu của 1 số tác giả Nhật Bản trong môi trường dung dịch còn được bổ sung sake, myglycerin, lactic acid …

1.3.3 Các phương pháp lên men [12], [20]

1.3.3.1 Phương pháp chậm

Nguyên lý

Phương pháp chậm còn được gọi là phương Pháp – Orleans, được biết đến từ năm 1670, khời đầu là vùng nho nổi tiếng cuả Pháp Người ta thấy dịch

vang nho để trong thùng gỗ bị hở nắp dần dần đục hơn, có màng phủ trên bề mặt và trở nên chua

Để sản xuất giấm theo phương pháp này, người ta dùng những thùng

gỗ đứng có vòi tiếp nguyên liệu và rót giấm (thường bằng thủy tinh, nhựa…) Vật liệu cấy là dấm tươi lấy từ thùng lên men khác, cho vào 1/5 thể tích thùng

là dấm tươi, sau đó đổ dịch lên men vào đến khoảng ½ thùng Tiếp đó cứ theo

1 chu kỳ( 1tuần) đổ thêm dịch lên men vào cho đến khi đầy thùng Thường dịch lên men là hỗn hợp của rượu vang và acid tạo nên dung dịch có nồng độ

từ 1-2% acid, 2-4% rượu Vi khuẩn Acetobacter phát triển trên bề mặt chất lỏng và “cái giấm” hình thành chứa chứa 1 lượng lớn vi khuẩn Acetobacter

Sở dĩ ngươi ta cho acetic acid trước là để tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, mặt khác là để ngăn ngừa các vi khuẩn khác phát triển, không bị nhiễm

Quá trình lên men diễn ra chậm chạp do sự thâm nhập hạn chế của oxy qua bề mặt dung dịch bị che phủ một lớp cái dấm Thường quá trình kết thúc sau 5 tuần nuôi cấy Lúc đó nồng độ dịch lên men vào để lên men tiếp Trong quá trình lên men do bị chấn động( va chạm )” cái dấm” chìm xuống và tiêu thụ 1 lượng cơ chất mà không tạo thành acid acetic Đây là nguyên nhân giảm độ acid trong giấm thành phẩm Sau đó trên bề mặt thóang khí lại hình thành 1 lớp màng vi khuẩn mới và lại diễn ra quá trình lên men như trên Giấm lấy ra được lọc trong và thanh trùng Pasteur để bảo quản được lâu

Ưu điểm

-Cho chất lượng giấm thơm ngon

-Thiết bị sản xuất không phức tạp, phù hợp với các cơ sở sản xuất nhỏ ở các địa phương

Nhược điểm

- Thời gian lên men dài

- Năng suất thấp

- Nồng độ acid thấp

- Mặt bằng sản xuất phải lớn

- Khó cơ khí hóa, tự động hóa

- Hiện nay chỉ còn 1 vài nước chậm phát triển còn sử dụng như biện

pháp duy nhất để sản xuất giấm trong đó có Việt Nam

1.3.3.2 Phương pháp nhanh

Nguyên lý

Phương pháp nhanh còn được gọi là phương pháp Đức Phương pháp này được tìm ra vào năm 1823, do Schiizenbachi, cho phép thời gian lên men giảm xuống đáng kể

Nguyên tắc của phương pháp này là tạo bề mặt tiếp xúc lớn hơn giữa

vi khuẩn Acetobacter với không khí để oxy hóa rượu Bề mặt lớn được tạo ra

khi sử dụng vật liệu xốp (thường dùng vỏ bào, lõi ngô xếp trong thiết bị dạng thap, trụ, nón cụt…), tháp lên men thông thường làm bằng gỗ, thường có chiều cao gấp đôi đường kính 2,5 – 6m x 1,2 -3m Vi khuẩn acetic được bám trên vat liệu xốp (vật liệu mang) Những vật liệu này có bề mặt tiếp xúc riêng lớn ,thể tích tự do lớn, khối lượng riêng bé, độ bền cơ học cao, rẻ tiền, dễ kiếm, phải có đủ độ nhám, độ xốp để màng vi sinh vật có thể bám lên đó, dịch lên men cho phương pháp nhanh thường là hỗn hợp acid 6% và 3% rượu etylic để thu được dấm 8-9%

Dịch lên men được chuyển từ trên xuống và không khí được chuyển từ dưới lên Phản ứng sinh học được thực hiện trong khối tế bào cố định, dịch lên men được chuyển hóa nhanh thành acid acetic nhờ vi khuẩn

Khi hầu hết rượu etylic được oxy hóa thành acid acetic người ta thường để trong dung dịch lên men khỏang 0,2-0,5% rượu etylic để tránh quá

trình oxy hóa ngược làm giảm nồng độ acid acetic Cuối cùng rút giấm thành phẩm và bắt đầu 1 chu kỳ mới Thời gian lên men khỏang 6 ngày

Trong thực tế sản xuất người ta cho dịch lên men chảy qua thành thùng theo nhiều phương pháp, nhưng phổ biến nhất là 1 trong 3 phương pháp sau: vận hành đơn, vận hành kép, tuần hòan Trong thiết bị, dịch lên men không lấp trùm tháp mà chỉ thấm dần dần qua lớp đệm khi cho đi từ đỉnh tháp qua khối vật liệu mang Dịch lên men được tuần hòan nhiều lần qua thiết bị , khi chảy qua lớp đệm, rượu dần dần bị oxy hóa thành acid acetic Lưu lượng được tính sao cho quá trình oxy hóa trong tháp diễn ra nhanh nhất Không khí được đưa vào trong thiết bị thông qua các lỗ nhỏ dưới đáy tháp và bên thành tháp Sự thông khí nhờ sự chênh lệch nhiệt độ giữa trong và ngòai thiết bị Để giảm bớt tổn hao acid acetic và rượu etylic do sự bay hơi theo khí thải, người

ta bố trí 1 thiết bị hấp phụ phía sau tháp Với thiết bị như vậy có thể ổn định làm việc trong 1 thời gian dài ( 20-30 năm), quá trình này được sử dụng trong

1 thế kỷ hoặc lâu hơn nữa, nhưng nếu phá vỡ quy định bình thường nào đó thì

sẽ dẫn đến hậu quả không hay và có khi ngừng sản xuất

Do việc thông khí phụ thuộc nhiều vào độ chênh lệch giữa trong và ngoài thiết bị nên quá trình sản xuất phụ thuộc nhiều vào điều kiện thời tiết

Sự giảm hệ số nhiệt độ làm giảm sự thông khí cho thiết bị và họat động oxy hóa của vi khuẩn Điều đó dẫn đến sự giảm nhiệt độ trong thiết bị và giảm độ thông khí, dẫn đến sự đình chỉ hòan tòan quá trình sản xuất khi nhiệt độ môi trường quá cao( to > 30oC ) Vấn đề kiểm tra nhiệt độ tự động trong thiết bị được giải quyết bằng cách làm lạnh dịch lên men trước khi bơm tuần hòan trở lại thiết bị tới nhiệt độ 26-28oC Nồng độ oxy được kiểm tra bằng Oxygemeter, nồng độ oxy trong khí thải được bảo đảm lớn hơn 12%

Có thể coi phương pháp sản xuất acid acetic theo phương pháp công nghiệp của Đức là ứng dụng đầu tiên về phương pháp cố định tế bào vi sinh vật vào công nghiệp lên men

1.3.3.3 Phương pháp chìm

Nguyên lý

Phương pháp chìm còn gọi là phương pháp sục khí Việc sử dụng phương pháp chìm cho oxy hóa rượu etylic thành acid acetic do Ebner và Hromatka phát hiện ra vào năm 1949

Trong phương pháp chìm không khí được sục qua khối dịch lên men

mãnh liệt và tạo thành 1 thể huyền phù có pha rắn là Acetobacter và pha lỏng

là dịch lên men trong các nồi lên men đặc biệt Trong nồi lên men dịch rượu etylic được chuyển thành acid acetic khá nhanh Để lên men, dịch lên men đưa vào thiết bị gồm 6-12% rượu etylic cộng 1-3% acid acetic Thời gian 1 chu trình sản xuất khoảng 40-96 giờ Sản phẩm tạo thành 7-13% acid acetic, 0,2-0,5% rượu sót Thiết bị lên men chìm nổi tiếng nhất của Tây Đức gọi là Axetator-Frings Cho tới năm 1981 tòan thế giơí có khỏang 440 Axetator-

Frings họat động Trong khi đó ở Việt Nam chưa có Axêtator-Frings nào họat động

Ở thiết bị Axetator-Frings tổng hàm lượng rượu và acid cho mỗi chu kỳ khỏang 7-15% khi hàm lượng rượu trong thùng lên men còn 0,2-0,5%, quá trình được coi là kết thúc

Người ta lấy 40-60% dịch lên men ra với tốc độ sao cho tránh tiêu hao toàn bộ rượu etylic Sau đó cho dịch lên men mới vào đúng đến lượng ban đầu, quá trình này diễn ra từ từ tránh tác động đến tế bào do sự thay đổi nồng

độ cơ chất trong dung dịch Thùng lên men được gắn với 1 máy nén khí,một

bộ phận khuấy và 1 bộ phận phá bọt Acid acetic và rượu etylic được xác định

tự động Tùy loại nguyên liệu sử dụng và lượng rượu etylic cho vào, quá trình lên men có thể kéo dài 40-96 giờ với hiệu suất 90-95%

Mặc dù có những ưu điểm rất lớn nhưng mãi cho đến gần đây nó mới được sử dụng rộng rãi trong đời sống, nguyên nhân kìm hãm là do nhu cầu phức tạp của thiết bị, tính ổn định không cao, quan trọng nhất là yêu cầu nghiêm ngặt của việc cung cấp oxy liên tục Những công trình ngiên cứu từ

năm 1949 đã chỉ ra rằng các vi khuẩn Acetobacter khi ở trạng thái lơ lửng

trong môi trường gồm dấm, cồn, nước sẽ trở nên nhạy cảm với việc cung cấp oxy ở những giai đọan ngắn nhất, đặc biệt khi nồng độ acid acetic đã khá cao

Ví dụ: nồng độ tổng là 5%, khi ngừng cung cấp oxy trong khỏang 120 giây sẽ làm chết 1/3 số vi khuẩn có mặt trong môi trường lên men, nếu nồng độ tổng

là 12% thì chỉ cần ngắt oxy trong 10-12 giây đã đủ làm chết 1/3 tổng số vi khuẩn

Ưu điểm

- Thời gian lên men nhanh

- Thiết bị nhỏ hơn, gọn hơn, năng suất cao hơn

- Hiệu suất cao( 90-95%)

- Có khả năng tự động hóa cao

- Tổng sản lượng dấm sản xuất theo phương pháp đến năm 1981 là767 triệu lít năm (giấm10%), trong đó chủ yếu là nước Mỹ, Nhật Bản, Pháp, Tây Đức và 1 số nước khác Ở Việt Nam đã tiên hành lên men dấm và acid acetic theo phương pháp chậm,đang nghiên cứu các phương pháp lên men nhanh và chìm

Ưu điểm

Phương pháp này có ưu điểm khi hệ thống lên men đang họat động, nếu ngừng cung cấp điện ( ngừng cung cấp oxy qua bộ phận sục khí ) vẫn không ảnh hưởng đến vi khuẩn Lúc đó các van thông khí bên trong thiết bị được mở

ra và không khí vào nhờ vào sự thông khí tự nhiên, do đó màng vi khuẩn trên đệm không bị chết, nhưng chỉ đảm bảo phần trên máy còn phần dưới vẫn phụ thuộc vào nguồn điện thông khí cho vi khuẩn họat động

Phương pháp này phát huy được ưu điểm của cả 2 phương pháp nhanh

và chìm

Nhược điểm

-Thiết bị yêu cầu phức tạp, cồng kềnh

-Giống vi khuẩn phải phù hợp cả 2 phương pháp

1.3.3.5 Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật

1.3.3.5.1 Định nghĩa tế bào cố định

Tế bào cố định là tế bào có sự chuyển động trong không gian bị giới hạn, sự giới hạn của tế bào có được bằng đưa nó vào 1 phase cách ly với phase dung dịch tự do Phase chứa tế bào thường không tan trong nước, là polymer cao phân tử ưa nước

1.3.3.5.2 Các phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trên bề mặt chất mang

Phương pháp này dự trên sự liên kết giữa chất xúc tác sinh học và chất mang không tan trong nước

a.Phương pháp liên kết cộng hóa trị

Đây là phương pháp sử dụng để cố định enzyme và không được sử dụng rộng rãi đối với tế bào vi sinh vật, vì tác nhân cần thiết đe tạo liên kết cộng hóa trị có thể gây độc đến tế bào và gây khó khăn cho việc cố định

Chất mang thường được sử dụng trong phương pháp này là polypeptide, polysaccharide, dẫn xuất cellulose như DEAE-cellulose, DEAE-saphadex…., agarrose, các polyme tổng hợp

Phương pháp tiến hành

Kỹ thuật cố định tế bào vi sinh vật theo phương pháp này dựa trên liên kết cộng hoá trị giữa bề mặt chất mang đã được họat hóa và tế bào vi sinh vật Quá trình liên kết cộng hóa trị giữa tế bào vi sinh vật và bề mặt chất mang có thể xảy ra theo một hay hai giai đọan

Một giai đọan nếu chất mang có chứa các nhóm có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm chức của protein màng tế bào vi sinh vật

2 giai đọan diễn ra như sau

Giai đọan 1 :

Họat hóa chất mang bằng cách gắn lên bề mặt chất mang các nhóm chức

có khả năng phản ứng hơn, dễ liên kết với tế bào vi sinh vật

-Khả năng trao đổi chất cao

-Độ bền liên kết giữa tế bào vi sinh vật và chất mang tốt

- Tế bào cố định vi sinh vật theo phương pháp này có tính chống chịu tốt với các yếu tố gây biến tính

Nhược điểm

- Ảnh hưởng đến sự sống và hoạt tính của tế bào

- Tế bào được cố định phải có phản ứng đặc thù để liên kết với chất mang và chất mang phải được họat hóa dẫn đến tốn chi phí và phức tạp

b Phương pháp hấp phụ

Cơ sở của phương pháp là dựa trên mối liên kết hóa học giữa màng tế bào và bề mặt chất mang Ở phương pháp này ngòai liên kết cộng hóa trị ra, tế bào chất mang còn liên kết với nhau bởi nhiều liên kết khác Các liên kết này

thể hiện ở các cơ chế sau: tạo liên kết hóa học giữa màng tế bào và bề mặt

chất mang, sự tương tác ion , và lực mao quản

Chất mang

Chất không có cấu trúc xốp như thủy tinh

Chất mang có cấu trúc xốp như than họat tính

Chất mang có điện tích như nhựa trao đổi ion

Phương pháp tiến hành

Phương pháp cổ điển

Ngâm chất mang vào dung dịch huyền phù vi sinh vật, vi sinh vật sẽ tự động kết lắng và liên kết với chất mang bằng cách hấp phụ trên chất mang đó

Phương pháp cổ điển có cải tiến

Sử dụng thêm cánh khuấy nhằm mục đích phân bố đều tế bào vi sinh vật

và chất mang trong dung dịch

Phương pháp bơm canh trường vi sinh vật qua cột chứa chất mang

Phương pháp này cần có hồi lưu dòng canh trường để nâng cao hiệu suất gắn tế bào vi sinh vật vào chất mang

Ưu nhược điểm của phương pháp

- Tế bào vi sinh vật dễ bị tách khỏi chất mang khi có tác động cơ học hay điều kiện môi trường thay đổi

- Lượng vi sinh vật cố định lên bề mặt chất mang không cao

- Quá trình thực hiện thụ động và khó điều khiển vì vậy hiệu suất cố định thường không cao

- Giới han trong việc lựa chọn chất mang

- Vật mang có thể xảy ra hấp phụ không đặc hiệu 1 số protein khác hay các chất phi protein

c Phương pháp cố định tế bào trong cấu trúc gel

Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc gel là phương pháp nhốt tế bào vi sinh vật trong khuôn gel của nhiều loại polymer khác nhau Việc cố định tế bào vi sinh vật trong khuôn gel tức là ngăn không cho tế bào khuếch tán vào môi trường xung quanh, nhưng đồng thời vẫn cho cơ chất

có phân tử lượng nho thích hợp và các sản phẩm trao đổi chất của tế bào ra khỏi mạng lưới gel đó

Các loại gel cơ bản

a Ion gel: Khuôn gel được tạo nên bằng cách liên kết ion giữa chất mang

đa điện tích và dung dịch đa điện tích trái dấu

b Covalent gel : là 1 loại gel mà cấu trúc mạng lưới của nó được hình thành từ những phân tử polymer gắn kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị

c Non-covalent gel: là loại gel mà mạng lưới được hình thành bằng những liên kế khác không phải là liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử polymer, thường là liên kết hydro

d Cryogel: là cấu trúc gel polimer mới, là loại gel được tạo nên bơi phương pháp làm lạnh đông các tiền polime có phân tử lượng thấp hoặc cao

Phương pháp tiến hành

a.Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc ion gel

Hỗn hợp huyền phù tế bào vi sinh vật và chất mang đa điện tích được nhỏ vào dung dịch đa điện tích trái dấu để thực hiện phản ứng tạo mạng lưới gel Qua đó, tế bào vi sinh vật sẽ được cố định trong hệ thống mạng lưới vừa được hình thành

b.Phương pháp cố định tế bào trong cấu trúc covalent gel

Cách 1: ta trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với dung dịch các monomer Sau đó, tạo điều kiện để các monomer liên kết và tạo phân tử polimer Các phân tử polimer liên kết với nhau bằng liên kết cộng hóa trị để tạo nên cấu trúc gel chứa tế bào vi sinh vật

Cách 2 :ta trộn huyền phù tế bào vi sinh vật với dung dịch chất mang polimer Hỗn hợp sẽ được tiến hành với những phản ứng thích hợp để tạo liên kết giữa các sợi polimer với nhau.Những liên kết mới được hình thành sẽ tạo

1 mạng lưới dày đặc chứa tế bào vi sinh vật.Sau đó khối gel này được đưa đến thiết bị tạo hạt và thu được các hạt gel polimer chứa tế bào vi sinh vật cố định

c.Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc non-covalent gel

Phương pháp này giống phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấu trúc covalent gel nhưng mạng lưới trong cấu trúc gel này được hình thành từ những liên kết khác liên kết khác liên kết cộng hóa trị, thường là liên kết hydro Chất mang thường được sử dụng là carregeenan

d Phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong cấutrúc cryogel

Cryogel được tạo thành bằng cách sử dụng phương pháp lạnh đông Ở điều kịen nhiệt độ thấp, mẫu nguyên liệu sẽ biến đổi cứng lại và hình thành cấu trúc mới Polyvinylalcohol là loại polimer được sử dụng trong tạo gel cryogel có khả năng cố định tế bào tốt, có cấu trúc lỗ xốp đặc trưng, bền chắc, lượng tế bào bị rửa trôi không nhiều sau chu kỳ lên men và giữ được hoạt tính trong thời gian dài do không tiếp xúc với dung môi hữu cơ

e.Các phương pháp khác

Phương pháp làm thay đổi nhiệt độ: huyền phù dung dịch chất mang

và tế bào gel khi hạ nhiệt độ Chất mang sử dụng: agar, gelatin Phương pháp này không thích hợp với những tế bào nhạy với nhiệt

Phương pháp đóng rắn polimer: tế bào hòa với polimer lỏng rồi được nhỏ vào bình chất đóng rắn tạo ra hạt xúc tác như cellulose triaxetat Phương pháp này không thích hợp với tế bào sống

1.3.3.5.4 Ưu nhược điểm chung của phương pháp cố định tế bào vi sinh vật trong lòng chất mang

a.Ưu điểm

-Có thể áp dụng cho nhiều loại tế bào vi sinh vật cố định trong cấu trúc gel polimer

-Mật độ tế bào cố định trong cấu trúc gel lớn

-Không có sự hình thành liên kết giữa tế bào vi sinh vật và chất mang mà

tế bào chỉ bị nhốt bên trong, vì vậy protein của màng tế bào vi sinh vật không

- Một số chất mang có thể ảnh hưởng không tốt đến họat tính của tế bào

vì có thể gây cản trở đến sự trao đổi chất của vi sinh vật

- Gel polimer cóthể bị phá hủy bởi tốc độ sinh trưởng của tế bào gây ảnh hưởng đến quá trình sản xúât

1.3.3.6 Cố định tế bào không chất mang

1.3.3.6.1.Phương pháp liên kết chéo giữa các tế bào

Đây là phương pháp liên kết các tế bào vi sinh vật riêng biệt thành 1 khối tế bào cố định nhờ các tác nhân lưỡng hoặc đa chức mà không sử dụng chất mang

Trong phương pháp này, thông qua 1 số hợp chất đặc biệt có khả năng hình thành các liên kết nối mạng, sẽ diễn ra phản ứng giữa tế bào hoặc các tthành phần của tế bào như enzyme với các họat chất này Nhờ vậy, các tế bào sẽ liên kết với nhau tạo thành cấu trúc dạng hình viên

Ứng dụng nổi bật nhất của phương pháp này trong công nghiệp là cố

định trực khuẩn Bacillus cogulans để sản xúât các dạng đồng phân của

- Đây là phương pháp có độ bền cơ học kém nhất

1.3.3.6.2 Cố định tế bào vi sinh vật bằng màng chắn membrane

Đây là phương pháp cố định trong các cơ chất có phân tử lượng lớn

có thể thẩm thấu vào trong tế bào, các chất mang có thể tái sử dụng.Ở dạng membrane tế bào được cố định thông qua quá trình siêu lọc và vi lọc bằng màng membrane Màng membrane được tạo ra là polimer có tính bán thấm với những kích thước lỗ đủ nhỏ chỉ cho cơ chất đi vào và sản phẩm đi ra mà

tế bào vẫn bị nhốt trong đó Trước khi tạo màng bao tế bào lại cần phải biết trọng lượng phân tử của tế bào để có thể tạo lỗ phù hợp trên màng

a.Ưu điểm

-Sự sinh trưởng của tế bào làm phá hủy màng chắn

1.3.3.7 Giá thể bacterial cellulose (BC)

a.Vi khuẩn sản xuất bacterial cellulose (BC)

BC được tổng hợp bởi 1 số vi khuẩn Cấu trúc BC ở mỗi loài tuy khác nhau nhưng con đường tổng hợp và cơ chế điều hòa tổng hợp BC ở mỗi loài

có lẽ giống nhau Các đặc điểm khác nhau thường là các đặc điểm vật lý của sản phẩm BC, như chiều dài chuỗi glucan, tính kết tinh và trạng thái kết tinh của nó Trạng thái kết tinh khác nhau xácđịnh các tính chất vật lý khác nhau như độ bền, độ hòa tan trong các dung môi, tính chịu ảnh hưởng của các tác

nhân gây đột biến Trong các lòai có thể dùng sản xúât BC thì Acetobacter

xylinum có khả năng tổng hợp BC hiệu quả nhất và được tập trung nghiên

cứu nhiều nhất

Acetobacter xylinum có dạng hình que, thẳng hoặc hơi cong, có thể di

động hoặc không, không sinh bào tử, Gram âm nhưng Gram của chúng có thể già đi hay do điều kiện môi trường

Acetobacter xylinum là vi khuẩn hiei khí bắt buộc, pH tối ưu 5,5,

nhiệt độ tối ưu để phát triển là 25-30oC

Nguồn hydrocacbon mà Acetobacter xylinum là gluccse, saccharose, maltose, manitol Môi trường thích hợp cho sự phát triển của Acetobacter

xylinum là nước dừa già

b Cấu trúc của BC

Ngày nay nhờ vào sự phát triển của công nghệ hiện đại người ta đã xác định được cấu trúc của BC.BC có cấu trúc gần giống như cấu trúc của cellulose thực vật, là chuỗi polymer của các nhóm glucose liên kết với nhau qua các nối -1,4-glucan

Các chuỗi đơn phân tử glucan liên kết với nhau bằng liên kết Vander Waals Qua liên kết hydro, các lớp đơn phân tử này sẽ kết hợp với nhau tạo nên cấu trúc tiền sợi với chiều rộng 1,5nm Các sợi kết hợp với nhau tạo thành các bó Các bó kết hợp với nhau tạo thành các dãy có kích thước từ 3-4nm và chiều rộng 70-80nm Theo Zaaz (1977) thì kích thước của dãy là 3.2x133nm, theo Brown và cộng sự (1976) là 4.1x177nm

So với PC thì BC có độ polimer hóa cao hơn và kích thước nhỏ hơn

BC có độ polymer hóa từ 2000-6000, có khi lên đến 16000 hay 20000.Còn ở

PC thì khả năng polymer hóa của nó chỉ từ 13000-14000

Trong tự nhiên, cellulose kết tinh ở hai dạng I vàII,đây là 2 dạng phổ biến nhất Tùy thuộc vào điều kiện môi trường nuôi cấy và giống vi khuẩn mà dạng nào sẽ chiếm ưu thế nhưng thường trong tự nhiên dạng cellulose I được tổng hợp phổ biến hơn Ngòai ra, cellulose I có thể chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II không thể chuyển ngược thành cellulose I được

Sợi cellulose được tổng hợp có trọng lượng nhẹ, kíchthước ổn định và sức căng cao, có độ bền sinh học cao đặc biệt là cellulose I Có khả năng giữ nước cao (99%) Trong điều kiện ngập nứơc, nước có thể vận chuyển xen vào các sợi cellulose

Lớp màng cellulose được tổng hợp trực tíêp Đặc biệt vi khuẩn có thể tổng hợp được các loại màng mỏng và các sợi cực nhỏ Trong cấu trúc BC

có các trục đơn giúp cho lớp màng tạo thành trở nên mạnh hơn

Trong suốt quá trình nuôi cấy chúng ta có thể kiểm sóat được đặc điểm

lý học của phân tử cellulose (trọng lượng phân tử và khả năng kết tinh) nhờ quan sát cấu trúc của chúng bằng cách cho thuớc nhuộm vào môi trường nuôi cấy

Có thể tác động lên các gel liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose

Từ đó có thể kiểm soát các dạng kết tinh và trọng lượng phân tử của cellulose

Chương 2: VẬT LIỆU - NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG

PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu

2.1.1 Mẫu giấm

Mẫu giấm thu thập từ ở Tp.HCM, Long An, Bạc Liêu

Số mẫu thu thập ở mỗi vùng

o Long An : 2 mẫu

o Bạc Liêu : 1 mẫu

o Tp HCM : 7 mẫu

2.1.2 Môi trường nuôi cấy [6], [7], [8], [45]

MT1 : Môi trường Ethanol-Cao nấm men

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(Ethanol cho vào sau khi hấp khử trùng)

MT2 : Môi trường làm giàu sinh khối

- Dịch chiết khoai tây 10% 100ml

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(Khoai tây gọt vỏ rửa sạch, cân 10g, cắt lát mỏng, thêm vào 100ml nước, đun sôi 5 phút, lọc  dịch chiết khoai tây 10%)

MT3: Môi trường lên men dùng định tính acid acetic

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

MT4 : Môi trường lên men dùng định lượng acid acetic

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

MT6 :Môi trường nhân giống cấp II

-Glucose 5g

-Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

MT7: Môi trường cao thịt- pepton dùng nuôi vi khuẩn Acetic để nhuộm Gram, quan sát hình dạng, kích thước tế bào

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

MT9: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn Acetic

MT10 : Môi trường glutamate xác định khả năng phát triển của vi

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

MT13: Môi trường thử khả năng phân giải dextrin

- Cao nấm men 10g

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

MT 14: Môi trường thử khả năng phân hủy canxi-lactate thành carbonate của vi khuẩn Acetic

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

(Hoà tan các muối vào 100ml nước cất Gelatin được hoà tan riêng trong 400ml nước cất, bổ sung đường, pepton, nước thịt Trộn 2 dung dịch trên với nhau rồi đun sôi vài phút Agar được hoà tan riêng trong 500ml nước cất khác

và trộn chung với các thành phần còn lại thành 1000ml môi trường)

MT 16: Môi trường thử khả năng tạo -pyrone

- Cao nấm men 10g

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml

MT 17: Môi trường thử khả năng oxy hoá acetate hoặc lactate

MT 18:Môi trường lên men sản xuất Bacterial cellulose

Môi trường nước dừa già

- pH=4,5 ( Được chỉnh bằng acid acetic đậm đặc )

2.1.3 Thiết bị máy móc dùng cho quá trình thí nghiệm