78312 MAUREPAS CEDE
2.2.2.3. Phân lập và khảo sát một số đặc điểm phân loại.
2.2.2.3.1. Phân lập
Trong mơi trường cĩ sử dụng nguồn cacrbon là ethanol và cĩ sự hiện diện của CaCO3, (MT1) các khuẩn lạc tạo được vịng phân giải xung quanh (làm tan CaCO3) cĩ thểđược xem là dự tuyển của vi khuẩn sinh acid acetic.
Tiến hành pha lỗng mẫu giấm ở các độ pha lỗng khác nhau: 10-1, 10-2, 10-3 ,10-4,10-5 ,10-6. Ủ trong tủ ấm 300C trong 3 ngày. Chọn những khuẩn lạc riêng rẽ cĩ vịng làm tan CaCO3. Làm thuần bằng cách cấy ria nhiều lần cho
đến khi quan sát chỉ cịn 1 loại khuẩn lạc trên mơi trường. Kiểm tra độ thuần khiết bằng cách quan sát hình dạng khuẩn lạc, nhuộm Gram.
2.2.2.3.2..Khảo sát đặc điểm phân loại
Dạng khuẩn lạc
Tiến hành cấy vi khuẩn phân lập được trên bề mặt mơi trường ethanol- cao nấm men cĩ CaCO3 (MT1) sao cho cĩ được những khuẩn lạc tách rời.
Nuơi ở nhiệt độ phịng và theo dõi sự phát triển của khuẩn lạc. Sau 3 ngày quan sát và mơ tảđặc điểm của khuẩn lạc.
Hình thái vi khuẩn
Khả năng di động
Quan sát khả năng di động của vi khuẩn dưới dạng tiêu bản giọt treo. Tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường làm giàu sinh khối (MT2)
Nhuộm Gram
Tiến hành nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường cao thịt-pepton (MT7) trong 16-24 giờ. Hút 1ml dịch vi khuẩn pha lỗng trong nước cất vơ trùng để
mật độ tế bào trong thị trường kính hiển vi vừa phải và dễ quan sát. Làm vết bơi vi khuẩn với đối chứng là Bacillus Gram dương, E.coli Gram âm. Sau khi nhuộm, soi kính với vật kính dầu 100X.
Đặc điểm sinh lý, sinh hố
Khả năng oxy hố ethanol thành acid acetic
Định tính acid acetic tạo thành
Nuơi các chủng khảo sát trên mơi trường lên men định tính (MT3) ở
nhiệt độ phịng trong 4 ngày.
Cho vào ống nghiệm 3ml dịch lên men và 1ml dung dịch NaOH . Nhỏ
vào ống nghiệm vài giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc đều ống nghiệm và đun sơi trên ngọn đèn cồn. Nếu dung dịch cĩ acid acetic thì sẽ cĩ màu đỏ thẫm do sắt acetate tạo thành.
Đối chứng dương là ống đựng acid acetic chuẩn, đối chứng âm là mơi trường khơng nuơi cấy vi khuẩn.
Phản ứng diễn ra theo phương trình sau:
CH3COOH +NaOH CH3COONa +H2O
CH3COONa + FeCl3 Fe(CH3COO)3 +3NaCl Màu đỏ thẫm
Định lượng acid acetic tạo thành
Sau khi nuơi các chủng khảo sát trên mơi trường tăng sinh (MT2) rồi chuyển sang mơi trường nhân giống cấp 1 (MT5), mơi trường nhân giống cấp 2 (MT6). Sau 7 ngày định lượng acid acetic tạo ra theo phương pháp xác định acid tổng.
Khảo sát đặc tính sinh catalase Nguyên tắc
Catalase xúc tác sự phân giải H2O2 thành H2O và O2. Nếu vi khuẩn khảo sát cĩ khả năng tạo catalase thì khi nhỏ H2O2 vào dịch nuơi cấy vi khuẩn đĩ, H2O2 bị phân giải thành H2O và O2, gây hiện tượng sủi bọt.
O2
2H2O2 2 H2O Catalase
Thực hiện
Nuơi cấy các chủng khảo sát trong ống nghiệm chứa mơi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24 giờ ở nhiệt độ phịng. Nhỏ 1 giọt dịch nuơi cấy lên tấm lam và nhỏ từ từ H2O2 vào. Quan sát và ghi nhận hiện tượng.
Khả năng tạo H2S
Đây là đặc điểm của vi sinh vật cĩ khả năng sử dụng các amino acid trong mơi trường cĩ Thiosulfate Natri. Chúng tạo thành những đường cấy màu đen do tạo được sulfua chì theo phản ứng sau:
COOH.CH.NH2.CH2S.S.CH2.CH.NH2.COOH + H2 + 4H
2H2S + 2NH3 + 2CH3COOH+ 2HCOOH
H2S + Pb(CH3COO)2 PbS + 2CH3COOH Sulfua chì màu đen
Cấy chủng khảo sát lên ống thạch đứng chứa mơi trường thử khả năng tạo H2S (MT13) bằng những đường cấy thẳng, sâu, gần sát thành ống nghiệm.
Ủ ở nhiệt độ phịng, sau 2 ngày, quan sát những đường cấy, nếu vi khuẩn tạo H2S thì đường cấy sẽ cĩ màu đen do tạo sulfua chì.
Khả năng oxy hố acetate hoặclactate
Tiến hành theo phương pháp của Leifson. Đây là phương pháp nhanh và dễ dàng nhất để phân loại vi khuẩn Acetic đến cấp giống. Nếu chủng khảo sát cĩ khả năng oxy hố acetate hoặc lactate thì chủng đĩ thuộc giống
Acetobacter cịn ngược lại chủng đĩ thuộc giống Gluconobacter .
Nguyên tắc
Sử dụng mơi trường sodium acetate hoặc sodium lactate cĩ
bromothymol-blue làm chất chỉ thị màu. Chỉ thị màu này cĩ pH nhạy cảm trong khoảng pH 5,6-7,4 và biến đổi màu từ màu vàng sang xanh dương. Khi acetate hoặc lactate bị oxy hố thì mơi trường trở nên kiềm tính. Bằng cách quan sát sự chuyển màu của mơi trường (vàng chuyển sang xanh dương) cho phép đánh giá được khả năng oxy hố acetate hoặc lactate của chủng vi sinh vật khảo sát.
Thực hiện
Cấy chủng khảo sát vào ống nghiệm chứa 5ml mơi trường sodium acetate. Nuơi ở nhiệt độ 300C sau 7 ngày quan sát sự chuyển màu của mơi trường.