Chọn mơi trường

78312 MAUREPAS CEDE

2.2.3.2. Chọn mơi trường

Xác định pH thích hợp

Tiến hành nuơi các chủng khảo sát trong mơi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24 giờ. Đối với mỗi chủng khảo sát huyền phù thật kỹ ống nghiệm chứa dịch nuơi cấy. Sau đĩ dùng pipetman hút chính xác 1 lượng dịch nuơi cấy (100l) phân vào các ống nghiệm chứa sẵn mơi trường khảo sát ở

các pH (MT8) tương ứng: 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 6,8. Nuơi các chủng cần khảo sát trong 4 ngày ở 300C, đo OD ở bước sĩng 660nm và ghi nhận kết quả.

Xác định nhiệt độ thích hợp

Tiến hành nuơi cấy các chủng khảo sát trên mơi trường tăng sinh khối (MT2) trong 24giờ. Đối với mỗi chủng khảo sát huyền phù thật kỹ ống nghiệm chứa dịch nuơi cấy. Sau đĩ dùng pipetman hút chính xác 1 lượng dịch nuơi cấy (100l) phân vào các ống nghiệm chứa sẵn mơi trường khảo sát nhiệt độ (MT 9 ) tương ứng là 150C, 180C, 250C , 300C ,350C, 370C, 400C, 450C. Đo OD ở bước sĩng 660nm và ghi nhận kết quả.

Mật độ giống ban đầu thích hợp cho quá trình lên men

Nuơi các chủng khảo sát trên mơi trường tăng sinh và nhân giống cấp I, II và chuyển vào mơi trường định lượng. Sau đĩ định hàm lượng acid tạo thành bằng phương pháp xác định acid tổng.

Xác định nồng độ ethanol thích hợp

-Nuơi cấy chủng vi khuẩn khảo sát ở mơi trường tăng sinh và nhân giống cấp I, II. Chuyển dịch nuơi cấy vào mơi trường định lượng cĩ nồng độ ethanol tương ứng là 3%, 4%, 5%, 8%, 10%, 12%.

-Tiến hành thí nghiệm 2 lơ: 1 lơ hấp khử trùng và 1 lơ khơng hấp khử

trùng. Mơi trường 1: hấp khử trùng; Mơi trường 2 : khơng hấp khử trùng. (Mục đích thực hiện mơi trường khơng hấp khử trùng để xem giống cĩ khả

-Xác định hàm lượng acid sinh ra bằng phương pháp xác định acid tổng và ghi nhận kết quả.

-Sau khi xác định được nồng độ ethanol ban đầu thích hợp cho quá trình lên men chúng tơi sẽ sử dụng nồng độ này cho các thí nghiệm tiếp theo.

Xác định thời gian nuơi cấy thích hợp

- Cấy chủng khảo sát vào các erlen chứa mơi trường tăng sinh khối (MT2) nuơi cấy lắc. Đo mật độ tế bào của mỗi chủng ở bước sĩng 660nm cứ

24 giờ thì đo cho đến khi giá trị OD giảm. Ghi nhận kết quả.

- Cho 25% dịch tăng sinh cĩ nuơi cấy chủng vi khuẩn khảo sát vào erlen chứa mơi trường nhân giống I (MT5), nuơi cấy lắc. Đo mật độ tế bào của mỗi chủng ở bước sĩng 660nm, cứ 24 giờ thì đo cho đến khi giá trị OD giảm. Ghi nhận kết quả.

Xác định mật độ vi khuẩn phát triển trong mơi trường nhân giống II để chuẩn bị lên men

- Cho 25% dịch nhân giống I cĩ nuơi cấy chủng vi khuẩn khảo sát vào erlen chứa mơi trường nhân giống II (MT6), nuơi cấy lắc trong khoảng thời gian thích hợp. Để tính số vi khuẩn trong thể tích khảo sát ta cần đếm số

khuẩn lạc trên đĩa petri.

Đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch Nguyên tắc:

Mỗi sinh vật đứng riêng rẽ sẽ phát triển thành một khuẩn lạc trên mơi trường thích hợp. Đếm số khuẩn lạc ta cĩ thể tính ra số vi sinh vật trong 1 thể

tích cần nghiên cứu.

Thực hiện:

Pha lỗng dịch cần đếm bằng cách dùng pipetman hút 1ml dịch vào 9ml nước cất vơ trùng. Tùy độ đục của dịch nuơi cấy mà pha lỗng ở nhiều nồng

mơi trường Ethanol-Cao nấm men . Ủ ở 300C sau 48 giờ đếm số khuẩn lạc trên các đĩa (hai đĩa trãi cùng nồng độ pha lỗng). Đếm số khuẩn lạc trên những đĩa cĩ từ 30-300 khuẩn lạc để tính kết quả.

Tổng vi khuẩn hiếu khí trong 1ml mẫu được tính theo cơng thức sau: A(CFU/ml) = Error!

Trong đĩ :

N: tổng số khuẩn lạc đếm được

ni : sốđĩa cĩ số khuẩn lạc được chọn tại mỗi nồng độ pha lỗng V: thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa

fi : độ pha lỗng cĩ số khuẩn lạc được chọn tại các đĩa đếm