Nghiên cứu đặc điểm sinh học và một số điều kiện lên men sinh tổng hợp Validamycin A của xạ khuẩn Streptomyces hygroscopicus 11405

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HUYỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VALIDAMYCIN A

CỦA XẠ KHUẨN Streptomyces hygroscopicus 11405

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Thái Nguyên - 2013

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

NGUYỄN THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN LÊN MEN SINH TỔNG HỢP VALIDAMYCIN A

CỦA XẠ KHUẨN Streptomyces hygroscopicus 11405

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học

Mã Số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

TS PHÍ QUYẾT TIẾN

Thái Nguyên - 2013

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan: Luận văn này là công trình nghiên cứu thực sự của

cá nhân, được thực hiện dưới sự hướng dẫn khoa học của TS Phí Quyết Tiến Các số liệu, những kết luận nghiên cứu được trình bày trong luận văn này là trung thực

Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình

Thái Nguyên, tháng 8 năm 2013 Học viên

Nguyễn Thị Huyền

LỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này, tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường Đại học Khoa học- Đại học Thái Nguyên đã truyền đạt cho tôi những kiến thức quý giá trong quá trình học tập và nghiên cứu

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phí Quyết Tiến đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, dìu dắt tận tình, động viên, chỉ bảo trong suốt quá trình tôi học tập, nghiên cứu và hoàn thành Luận văn tại Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Đồng thời tôi cũng cảm ơn TS Phan Thị Hồng Thảo, ThS Nguyễn Thị Hồng Liên cùng các cán bộ phòng công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, những người đã động viên, giúp đỡ, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài

Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình, bạn bè, đồng nghiệp những người đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi cả về vật chất lẫn tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản Luận văn này

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn tất cả sự giúp đỡ quí báu đó!

Thái Nguyên, tháng 08 năm 2013

Học viên

Nguyễn Thị Huyền

MỤC LỤC

LỜI CAM ĐOAN i

LỜI CẢM ƠN ii

MỤC LỤC iii

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi

DANH MỤC CÁC BẢNG vii

DANH MỤC CÁC HÌNH viii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về chất kháng sinh và validamycin A 3

1.1.1 Khái niệm chất kháng sinh 3

1.1.2 Một số cơ chế tác động của chất kháng sinh đối với vi sinh vật 5

1.1.3 Kháng sinh bảo vệ thực vật 8

1.1.4 Validamycin A 9

1.2 Xạ khuẩn sinh validamycin A 13

1.2.1 Đặc điểm của xạ khuẩn 13

1.2.2 Thời điểm sinh kháng sinh của xạ khuẩn 19

1.2.3 Một số đặc trưng cơ bản của xạ khuẩn có khả năng sinh validamycin A 20

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng lên men sinh validamycin A của xạ khuẩn 21

1.3.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men 21

1.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện lên men 23

1.4 Tình hình nghiên cứu sinh tổng hợp validamycin A trong và ngoài nước……….24

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 24

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước 25

CHƯƠNG II VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29

2.1 Vật liệu 29

29

2.1.2 Hóa chất sử dụng 29

29

2.1.4 Thành phần môi trường nuôi cấy 30

2.2 Phương pháp nghiên cứu 30

2.2.1 Phương pháp giữ giống 30

2.2.2 Nhân giống xạ khuẩn 30

2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn 31

2.2.4 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa 32

2.2.5 Phương pháp thu hồi dịch validamycin A thô 34

2.2.6 Xác định hoạt tính validamycin A 34

2.2.7 Lựa chọn môi trường lên men thích hợp cho sinh tổng hợp validamycin A 35

2.2.8 Xác định điều kiện lên men sinh validamycin A của xạ khuẩn trong bình tam giác 35

2.2.9 Xác định ảnh hưởng của thời gian lên men sinh tổng hợp validamycin A 35

2.2.10 Nghiên cứu đặc tính và độ bền của validamycin A 36

2.2.11 Xác định khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch validamycin A thô 36

2.2.12 Phương pháp xử lý số liệu 36

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

3.1 Nghiên cứu lựa chọn chủng xạ khuẩn thích hợp cho sinh tổng hợp val-A37 3.1.1 Đặc điểm sinh học sơ bộ của hai chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên cứu 37

3.1.2 Khả năng sinh enzyme protease, cellulase và amylase của hai chủng xạ khuẩn 39

3.1.3 Khả năng sinh tổng hợp validamycin A của hai chủng xạ khuẩn 40

3.1.4 Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn 43

3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng S hygroscopicus 11405 46

3.2.1 Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của xạ khuẩn S hygroscopicus 11405 46

3.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của xạ khuẩn S hygroscopicus 11405 48

3.3 Nghiên cứu thành phần môi trường và điều kiện lên men của chủng S hygroscopicus 11405 50

3.3.1 Lựa chọn môi trường lên men 50

3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng sinh validamycin A của chủng S hygroscopicus 11405 51

3.3.3 Lựa chọn tỷ lệ tiếp giống cho lên men sinh tổng hợp validamycin A 52

3.3.4 Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp validamycin A 52

3.3.5 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp validamycin A…… 53

3.4 Đặc điểm của dịch validamycin A thô 54

3.4.1 Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh 54

3.4.2 Độ bền nhiệt và bền pH của dịch validamycin A thô 55

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57

DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN 58 TÀI LIỆU THAM KHẢO 59

PHỤ LỤC 65

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

Tên viết tắt Tên đầy đủ

môi trường nuôi cấy tại các thời điểm khác nhau 47

Bảng 3.4 Khả năng đồng hoá nguồn carbon của chủng S hygroscopicus

11405 49Bảng 3.5 Khả năng chịu muối, chịu nhiệt độ và khoảng pH thích hợp cho sinh trưởng của xạ khuẩn 50

Bảng 3.6 Phổ kháng VSV của chủng S hygroscopicus 11405 55

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của val-A 9Hình 1.2 Cơ chế tác động của val-A đến quá trình chuyển hóa năng lượng ở

vi nấm 11Hình 1.3 Hình ảnh minh họa sự nảy mầm và phát triển của xạ khuẩn 17Hình 1.4 Mối quan hệ giữa các pha sinh trưởng của xạ khuẩn 18

Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc của hai chủng xạ khuẩn S hygroscopicus 11405

và S hygroscopicus CNLM khi nuôi cấy trên môi trường thạch ISP2 38 Hình 3.2 Khả năng sinh tổng hợp ba loại enzyme ngoại bào của chủng S hygroscopicus 11405 (A) và S hygroscopicus CNLM (B) 40

Hình 3.3 Phổ sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của val-A chuẩn (A) và val-A có

trong dịch lên men của chủng S hygroscopicus 11405 (B) và chủng S hygroscopicus CNLM (C) 42 Hình 3.4 Hình ảnh minh họa kết quả sàng lọc tự nhiên về hoạt tính kháng nấm chủng S hygroscopicus 11405 (A) và S hygroscopicus CNLM (B) 43 Hình 3.5 Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh kháng nấm R solani của chủng S hygroscopicus 11405 44 Hình 3.6 Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh kháng nấm R solani của chủng S hygroscopicus CNLM 45 Hình 3.7 Hình ảnh minh họa hình dạng khuẩn lạc chủng S hygroscopicus

11405 trên các môi trường nuôi cấy khác nhau 47

Hình 3.8 Cuống sinh bào tử của chủng S hygroscopicus 11405 chụp bằng

kính hiển vi điện tử quét (độ phóng đại 10.000 lần) 48Hình 3.9 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh tổng hợp val-A 50Hình 3.10 Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh tổng hợp val-A 51Hình 3.11 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh val-A 52

Hình 3.12 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp val-A 53Hình 3.13 Ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp val-A 54Hình 3.14 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ đến hoạt tính của dịch val-A thô 56

MỞ ĐẦU

Theo thống kê hàng năm trên thế giới, các vi nấm gây các bệnh trên thực vật như đạo ôn, khô vằn, thối cổ rễ, mốc sương, vàng lụa ở lúa… chiếm 83% trong số các bệnh ở cây trồng [8], [9] Ở nước ta, diện tích đất canh tác

là 10,13 triệu ha và điều kiện địa lý nằm trong khu vực nhiệt đới nóng ẩm nên tạo điều kiện thuận lợi cho nhiều vi sinh vật (VSV) phát triển, đặc biệt là các VSV gây bệnh thực vật Vì vậy, việc sử dụng phân bón, thuốc trừ sâu hóa học nhằm tăng năng suất, sản lượng đã dẫn tới thoái hóa đất, tồn dư hóa chất bảo

vệ thực vật, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất…

Năm 2003, Việt Nam phải nhập tới 166 triệu USD thuốc bảo vệ thực vật, trong đó các chất chống nấm chiếm tỷ lệ 28,0% và chủ yếu là thuốc hóa học Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, trong danh mục các loại thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) có nguồn gốc sinh học, đến 6 tháng đầu năm

2007 có 193 sản phẩm được cấp giấy phép đăng ký, nâng tổng số có 479 sản phẩm sinh học được phép lưu hành, trong đó có 300 loại thuốc trừ sâu và 98 sản phẩm thuốc trừ bệnh Các sản phẩm này đã góp phần không nhỏ vào công tác phòng trừ dịch hại, góp phần thay thế và hạn chế dần nguy cơ độc hại do

sử dụng thuốc BVTV nguồn gốc hóa học ảnh hưởng đến sức khỏe con người

và gây ô nhiễm môi trường

Tại Việt Nam, một trong các loại thuốc bảo vệ thực vật an toàn, có nguồn gốc sinh học được sử dụng hiệu quả để phòng trừ các loại nấm gây bệnh cho cây trồng là validamycin, trong đó hiệu quả nhất là validamycin dạng đồng phân A Validamycin A (val-A) là một kháng sinh nhóm aminoglycoside có hoạt tính kháng nấm được sinh tổng hợp chủ yếu bởi

Streptomyces hygroscopicus var limoneus [25] và S hygroscopicus subsp jinggangensis 5008 [39] Nhờ hiệu quả phòng trừ nấm cao cũng như an toàn

cho con người và động vật, val-A trở thành một trong những kháng sinh quan trọng nhất và được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp để trừ bệnh đốm vằn

hại lúa, bệnh thối nụ, thối rễ ở cây khoai tây, bông, cà chua, nấm hồng trên

cây cao su,… do nấm Rhizoctonia solani, R oryzae và Sclerotium sativa gây nên Val-A đang sử dụng ở nước ta chủ yếu được nhập khẩu từ

oryzae-Trung Quốc dưới các tên thương mại Anlicin, Damycine, Duo xiao meisu, Haifangmeisu, Iing gang meisu, Romycin, Vacinmeisu, Vacocin, Validacin, Valitigi, Varison, Vida, Vigangmycin Trong khi việc nghiên cứu và sản xuất validamycin đã diễn ra ở rất nhiều nước trên thế giới như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc… thì ở Việt Nam vấn đề này mới chỉ được quan tâm nghiên cứu ở khả năng ứng dụng của validamycin

Xuất phát từ tính cấp thiết và nhu cầu thực tiễn của việc sử dụng val-A,

chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học và một số điều

kiện lên men sinh tổng hợp validamycin A của xạ khuẩn Streptomyces

hygroscopicus 11045“

Mục tiêu nghiên cứu: Lựa chọn một chủng xạ khuẩn có khả năng sinh

tổng hợp val-A và nghiên cứu đặc điểm sinh học, một số điều kiện lên men sinh kháng sinh val-A của xạ khuẩn được lựa chọn

Nội dung chính của đề tài bao gồm 4 phần:

- Nghiên cứu lựa chọn chủng xạ khuẩn có khả năng sinh tổng hợp

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Tổng quan về chất kháng sinh và validamycin A

1.1.1 Khái niệm chất kháng sinh

Kháng sinh đầu tiên được nhà bác học người Anh A Fleming phát hiện

ra vào năm 1929 từ một loài nấm mốc (thuộc chi Penicillium) có khả năng ức chế sự phát triển tụ cầu khuẩn vàng (Staphylococcus aureus) Loại kháng sinh

này được Fleming gọi là penicillin Đến năm 1938, H Florey và E B Chain

đã tinh sạch thành công dạng bền vững của penicillin Cho đến năm 1943, penicillin được sử dụng trong chiến tranh thế giới thứ hai và đã cứu sống được rất nhiều người [1], [14] Tiếp theo penicillin, hàng loạt các chất kháng sinh khác đã được phát hiện như gramicidin, tyrocidine, streptomycin, cloramphenicol, cephalosporin, chlortetracyline

Thuật ngữ “antibiotic” được A Waskman đưa ra năm 1940 (anti- theo

tiếng Hi lạp là kháng lại, bios là sự sống) [42] Antibiotic (chất kháng CKS) là sản phẩm trao đổi chất bậc hai của một loại VSV hoặc một cơ thể bậc cao có tác dụng ức chế hoặc tiêu diệt tế bào sinh vật khác (vi khuẩn, protozoa,

sinh-tế bào ung thư ) một cách chọn lọc, ngay cả ở nồng độ thấp Một chất được xem là CKS nếu:

- Là sản phẩm của quá trình trao đổi chất

- Là các sản phẩm có cấu trúc tương tự như các CKS tự nhiên

- Ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một hoặc vài VSV

- Có hiệu lực ở nồng độ thấp

Ngày nay, thuật ngữ kháng sinh được hiểu theo nghĩa rộng hơn:

“Kháng sinh là các hợp chất có nguồn gốc tự nhiên hoặc tổng hợp có tác dụng

ức chế hoặc tiêu diệt chọn lọc đối với các VSV gây bệnh, đồng thời không có tác dụng hoặc tác dụng yếu lên người, động vật hoặc thực vật [2]

Trong nghiên cứu, kiểm nghiệm và thu hồi kháng sinh người ta thường dùng đơn vị kháng sinh (IU, International Unit) để biểu thị hoạt lực tác dụng của kháng sinh Một đơn vị kháng sinh là lượng kháng sinh tối thiểu (chế phẩm tinh khiết ở dạng axit, kiềm hoặc muối tương ứng) có khả năng ức chế

sự phát triển hoặc kìm hãm sự sinh trưởng của một chủng VSV kiểm định chuẩn trong môi trường lỏng Ví dụ 1 đơn vị kháng sinh penicilin bằng 0,6

mg benzyl penicillin tinh khiết là lượng kháng sinh tối thiểu kìm hãm sự phát

triển của chủng Staphylococcus aureus 209 trong 50 ml môi trường nước thịt

Đa số các kháng sinh có 1,0 đơn vị tác dụng bằng 1 mg chế phẩm tinh khiết ở dạng axit, kiềm hoặc muối tương ứng

CKS được tạo thành không có một chức năng rõ ràng trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật vì tế bào vẫn có thể tồn tại và phát triển bình thường khi không có những hợp chất này Tuy vậy, trong điều kiện tự nhiên, sự tạo thành các CKS hoàn toàn có ý nghĩa đối với sự sống còn và sự phát triển của các VSV Có quan niệm cho rằng CKS giúp cho bản thân vi sinh vật loại trừ một số sản phẩm trao đổi trung gian dư thừa [3], [4]

CKS được sinh ra và tiết vào môi trường xung quanh, nhưng cũng có khi CKS đó lại liên kết chặt chẽ với bào tương của VSV và chỉ được tiết ra khi tế bào bị phá vỡ hoặc tế bào tự tan (gramicidin, prodigiosin, piocianase, urocidin

và một số kháng sinh từ Aspergillus) Hoạt động sinh tổng hợp CKS bị hạn

chế bởi cơ chế điều hòa ngược Ngoài ra khả năng sinh kháng sinh của các chủng VSV khác nhau phụ thuộc vào mức độ bền vững của chủng với CKS

đó [14], [13]

Hiện nay, kháng sinh không chỉ dùng trong y học (chữa bệnh nhiễm trùng, ung thư, ức chế các loại virut gây bệnh…) mà còn được sử dụng trong nông nghiệp (phòng chống bệnh, kích thích tăng trưởng cho cây trồng và

động vật nuôi), trong công nghiệp chế biến và bảo quản lương thực, thực phẩm Chính vì những tác dụng to lớn ấy mà từ năm 1928, khi CKS đầu tiên được tìm ra đến nay, số lượng các CKS mới phát hiện tăng lên trên 8.000 loại [6], [13]

Cho đến nay, các nhà khoa học công bố đã phát hiện được hơn 10.000 CKS tự nhiên, trong số này khoảng 100 chất do thực vật tạo ra, còn khoảng hơn 7000 chất do các loài VSV tổng hợp, trong số này khoảng 100 chất đã được ứng dụng trong y học và một số lĩnh vực khác Mặt khác, từ những kháng sinh đã biết các nhà nghiên cứu đã điều chế được hàng ngàn dẫn chất mới là các kháng sinh bán tổng hợp và trong số này khoảng 50 chất cũng đã được đưa vào sử dụng Đồng thời có hai kháng sinh được sản xuất hoàn toàn bằng tổng hợp hóa học là cloramphenicol và pyrrolnitrin [10], [13], [41]

1.1.2 Một số cơ chế tác động của chất kháng sinh đối với vi sinh vật

Cơ chế tác dụng của CKS là những cách thức mà CKS tác động lên những vị trí đích khác nhau trong tế bào, qua đó ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của VSV Cơ chế này phụ thuộc vào bản chất hoá học, nồng độ chất kháng sinh và cấu trúc của tế bào Các CKS có bản chất hóa học khác nhau thì thường có cơ chế tác dụng khác nhau, còn các chất có bản chất hoá học gần giống nhau thì có phổ kháng VSV tương tự như nhau

1.1.2.1 Ức chế quá trình tổng hợp thành tế bào của vi sinh vật

Các nhóm CKS có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp thành tế bào của VSV gồm có: penicillin, bacitracin, vancomycin

Quá trình tổng hợp thành tế bào của VSV là một chuỗi các phản ứng sinh hóa trải qua khá nhiều giai đoạn với sự tham gia của nhiều loại enzyme khác nhau Các enzyme này chính là mục tiêu tấn công của các nhóm CKS trên Ví dụ: CKS penicillin và cephalosporin tác động đồng thời cả hai loại enzyme transpeptidase và cacboxipeptidase Do cấu hình không gian của CKS

và một tiền chất cần thiết cho tổng hợp thành tế bào rất giống nhau nên CKS

ức chế cạnh tranh đối với enzyme xúc tác chuyển hóa tiền chất; kết quả là các enzyme bị mất hoạt tính, các tiền chất tích lũy ngày càng nhiều ở bào tương tạo ra áp suất thẩm thấu lớn làm vỡ tế bào vi khuẩn

1.1.2.2 Ức chế các chức năng của màng tế bào vi sinh vật

Các nhóm CKS có tác dụng ức chế các chức năng của thành tế bào VSV gồm có: colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin

Cơ chế tác dụng: Các CKS bám vào và phá vỡ các tổ chức thành tế bào khiến cho các phân tử có khối lượng lớn và các ion thoát ra ngoài, dẫn đến VSV không thể thực hiện được quá trình trao đổi chất với môi trường Các CKS nhóm polypeptide (gramicidin, colistin, polymixin…) có thể phá hủy phospholipid của thành tế bào, làm cho các chất rò rỉ ra khỏi tế bào dẫn đến tế bào bị chết Các CKS nhóm polyene (nystain, amphotericin, philipin…) tác dụng lên thành phần sterol của màng nguyên sinh chất của tế bào nấm và tế bào động vật; màng nguyên sinh chất của tế bào vi khuẩn không chứa steroid nên không bị KS nhóm này tác động [7]

1.1.2.3 Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein

Nhóm aminoglycosid gắn với thụ thể (receptor) trên tiểu phần 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã không chính xác, kết quả là sẽ tổng hợp nên những protein không đúng chức năng Nhóm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome, ức chế enzyme peptidyltranferase, ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide Ngoài ra nó còn có một tác dụng nữa là làm tích lũy ARN trong tế bào

Nhóm macrolides và lincosamides gắn với tiểu phần 50S của ribosome, chống lại tác dụng của enzyme đảm nhiệm chức năng giúp mạch polypeptide chuyển vị nhằm ngăn cản quá trình dịch mã của các acid amin đầu tiên của

chuỗi polypeptide, khiến cho quá trình dịch mã có thể bị dừng lại ở ngay những acid amin đầu tiên

Nhóm tetracilin: ngăn cản quá trình kéo dài của chuỗi polypeptide bằng cách ngăn cản sự xâm nhập của aminoaxyl- tARN vào vị trí A của ribosome; ngăn cản quá trình oxy hóa và cung cấp năng lượng, bằng cách tạo phức với các ion Mg2+ cần cho sự hoạt động của các enzyme [38]

1.1.2.4 Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic

Một số CKS cản trở quá trình sao chép và phiên mã ở VSV Các CKS này có thể ảnh hưởng đến quá trình sao chép của acid nucleic bằng cách ức chế tổng hợp các nucleotide, ức chế sao chép hoặc làm ngừng phiên mã Do không tổng hợp được vật chất di truyền nên kết quả là các VSV gây bệnh không thể sinh sản và duy trì nòi giống được Hiện nay người ta đã biết rõ khoảng 20 chất ức chế trao đổi hoặc tổng hợp ADN:

- Nhóm refampin gắn với ARN polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành ARN thông tin (mARN)

- Nhóm quinolone ức chế tác dụng của DNA gyrase làm cho hai mạch đơn của ADN không thể duỗi xoắn, ngăn cản quá trình tự sao chép của ADN

- Nhóm sulfamide có cấu trúc giống p-aminobenzonic acid (PABA) có tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp nucleotide

- Nhóm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic

1.1.2.5 Ức chế cạnh tranh

Một số CKS có cấu trúc khá giống với cơ chất của các loại enzyme và

do đó chúng sẽ tranh chấp trung tâm hoạt động của enzyme với các chất trao đổi bình thường Điều này khiến cho sinh trưởng và phát triển của VSV bị ức chế hoặc hạn chế hoàn toàn

Ngoài các cơ chế chủ yếu trên thì CKS còn có thể tác động đến tế bào VSV qua một số cơ chế khác như: tác động lên tính thấm của tế bào, tác động gây ức chế enzyme… CKS validamycin A (val-A) thuộc nhóm này với cơ chế tác động lên enzyme trehalase có vai trò trong việc điều hòa và cung cấp năng lượng Ngoài ra val-A còn ức chế quá trình tổng hợp myo- inositol và làm giảm độc tính của nấm mốc

1.1.3 Kháng sinh bảo vệ thực vật

Hiện nay việc dùng thuốc hóa học trong bảo vệ thực vật vẫn là phổ biến nhất Tuy nhiên, việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học lâu dài lại gây ra những tác hại không nhỏ đến môi trường và sức khỏe con người Để khắc phục những nhược điểm trên thì việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật vừa

có tác dụng nhanh, dễ phân hủy, có tính đặc hiệu cao, chỉ tiêu diệt một hoặc một số sâu bệnh nhất định mà không ảnh hưởng đến những loài có ích khác

và đặc biệt CKS còn có khả năng ức chế cả các VSV đã kháng thuốc hóa học Các kháng sinh được ứng dụng để tiêu diệt các nấm và vi khuẩn gây bệnh cho cây trồng như các bệnh khô vằn, vàng lụa ở lúa (validamycin, blasticidin S, kasugamycin), bệnh thối cổ rễ ở các cây có củ Ngoài ra CKS còn được sử dụng làm chất kích thích tăng trưởng ở những nồng độ nhất định như kích thích nảy mầm ở hạt Việc sử dụng các CKS trong bảo vệ thực vật ngày càng được phổ biến rộng rãi trên thế giới nhất là ở các nước Nga, Nhật Bản, Trung Quốc, Ấn Độ Năm 1950, Trung Quốc đã tuyển chọn được chủng

Streptomyces sp 5406 có khả năng ức chế Rhizoctonia solani và Verticillium albo – atrum gây thối rễ ở bông non Năm 2002, ở Ấn Độ đã phân lập được chủng Streptomyces sp 201 có khả năng sinh chất kháng sinh mới là z-

methylheptyl iso-nicotinate, chất kháng sinh này có khả năng kháng lại nhiều

loại nấm gây bệnh như Fusarium oxysporum, F solani, F semitectum, F moniliforme Năm 2002, Trung tâm công nghệ sinh học – Đại học Quốc gia

Hà Nội đã phân lập được chủng xạ khuẩn Streptomyces sp LD30 có khả năng

ức chế được vi khuẩn Pseudomonas solanacearum gây bệnh héo lá ở cây

trồng [8]

Việt Nam cũng sử dụng nhiều chế phẩm kháng sinh trong bảo vệ thực nhập khẩu từ Trung Quốc hay Nhật Bản và đã phân lập được một số chủng xạ

khuẩn có khả năng chống Pyricularia oryae gây bệnh đạo ôn và F oxysporum

gây bệnh thối rễ ở thực vật Tuy nhiên việc sử dụng CKS trong lĩnh vực bảo

vệ thực vật ở nước ta còn ở mức độ thấp bởi tập quán canh tác chỉ quen dùng một số hóa chất bảo vệ thực vật nhất định

Ngoài ra, các chế phẩm sinh học chưa phù hợp với điều kiện sản xuất các chế phẩm sinh học của người nông dân Do đó, cần có sự phối hợp thống nhất trong việc nghiên cứu, sản xuất các chế phẩm phòng trị sinh học với việc truyền thông, xây dựng phương pháp canh tác mới nhằm thu được hiệu quả cao trong phòng chống dịch bệnh, nâng cao năng suất cây trồng và hiệu quả kinh tế đồng thời bảo vệ môi trường, sức khỏe con người

1.1.4 Validamycin A

1.1.4.1 Cấu trúc hóa học của validamycin A

Cấu trúc hóa học của val-A được Horii và Kameda và cộng sự xác định: 1L-(1,3,4/2,6)-2,3-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(1S,4R,5S,6S)-

-D-glucopyranoside Hình ảnh val-A [32]

Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của val-A

Công thức phân tử: C20H35NO13; trọng lượng phân tử : 497.5

Validamycin A có thể được chia thành hai nhánh hydroxyl methyl cyclitol trong phân tử và các phân tử cyclitol này khác các aminocyclitol đã biết khác như streptamine, 2-deoxystreptamine, actinamine Do đó, val-A là kháng sinh aminoglycoside duy nhất và là một ví dụ điển hình về hợp chất có cấu trúc pseudosugar [32]

Các validamycin A, C, D, E và F đều có phân tử validoxylamine A trong phân tử nhưng chúng khác nhau ở ít nhất một trong các đặc tính sau: cấu hình của phân tử có liên kết glucoside trong tâm anomeric; vị trí của liên kết glucosid và số lượng phân tử D-glucose Validamycin B có chứa validoxylamine trong phân tử, khi thủy phân bằng acid tạo ra hdroxylvalidamine giống như val-A thủy phân thành validamine [18], [19]

Kameda đã nghiên cứu sự chuyển hóa của validamycin nhờ VSV và nhận thấy liên kết glucoside của validamycin bị cắt có chọn lọc khi VSV

thủy phân, đặc biệt validamycin C chuyển hóa thành val-A nhờ Endomycosis spp hay Candida spp có ý nghĩa quan trọng vì validamycin C có hoạt tính kháng Pellicularia sasakii thấp hơn 1000 lần so với val-A [30], [31], [32]

1.1.4.2 Đặc tính hóa lý của validamycin A

Validamycin A tan nhanh trong nước, methanol, dimethylsulfoxide và dimethylformamide; tan kém trong acetone và ethanol và không tan trong ethylacetate và ethyleter Val-A tan nóng chảy ở 100°C và bị phân hủy ở 135°C Khả năng quay cực của val-A: [α]D

validoxylamine tiếp tục bị phân hủy để tạo ra valienamine, validamine và các hợp chất khác [25], [26]

1.1.4.3 Hoạt tính sinh học của val-A

Theo Nioh và Mizushima, val-A không gây ức chế sự sinh trưởng của nấm và không làm thay đổi hàm lượng protein, nucleic acid và thành phần của

thành tế bào nhưng gây thay đổi hình thái của nấm R solani bằng cách ức chế

quá trình sinh tổng hợp myo-inositol và làm giảm độc tính của nấm [32]

Validamycin A cũng ức chế trehalase của R solani cũng như ở nhiều

loài sinh vật khác như chuột, thỏ, lợn, nấm men và côn trùng với IC50 = 10-8

-10-6 M Trehalase được phân bố rộng rãi ở nhiều loài sinh vật, đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa, cung cấp năng lượng (D-glucose) cho hệ cơ ở cánh của côn trùng, cho quá trình nảy mầm của bào tử…Trong tế bào nấm bệnh, trehalase xúc tác chuyển hóa trehalose thành đường glucose - nguồn năng lượng cho nấm phát triển Do đó, dưới tác động của val-A, tế bào nấm

sẽ tạo nhánh bất thường, bị khô dần và chết do không có khả năng tổng hợp glucose để sinh trưởng [16], [34], [35]

Hình 1.2 Cơ chế tác động của val-A đến quá trình chuyển hóa năng lượng ở

vi nấm

Val-A là chất kìm hãm yếu (IC50 = 10-3 M) các enzyme thủy phân

đường khác như maltase, isomaltase và sucrase trong ruột lợn Trong R solani, kháng sinh được vận chuyển nhanh đến sợi nấm và được glycosidase

thủy phân thành validoxylamine A, đây là chất kìm hãm trehalase của nấm

mạnh hơn ở in vitro và in vivo [33], [47]

Validamycin có độc tính rất thấp đối với động vật có vú Các liều LD50khi uống và tiêm dưới da đối với loài gặm nhấm nói chung và chuột nói riêng

là 20000 và 15000 mg/kg thể trọng Val-A không gây kích ứng dưới da thỏ ở nồng độ 10 mg/cm2

và giác mạc là 10 mg/1 mắt Bổ sung val-A với nồng độ 10.000 ppm vào khẩu phần dinh dưỡng của chuột không gây ảnh hưởng gì trong vòng 23 ngày Val-A ở 40 và 10.000 ppm không gây ảnh hưởng đối với

cá chép và cá ăn thịt trong 72 giờ [32]

1.1.4.4 Ứng dụng của validamycin A

Val-A được sử dụng để trừ bệnh đốm vằn hại lúa, bắp, bệnh đốm lá và

thân lúa, bắp do R solani, R oryzae và Sclerotium oryzae-sativa gây nên

Ngoài ra val-A còn trừ bệnh thối củ, thối rễ khoai tây, bông, cà chua và nhiều

loại rau do nấm R solani gây nên [20], [43], [44] Có thể phun dung dịch

val-A lên cây hay nhúng rễ cây, xử lý cây con và củ (khoai tây, cây giống rau) Đối với lúa, phun khi lúa có đòng vào lúc 5-10 ngày trước khi trổ bông để trừ bệnh khô vằn cổ bông, hoặc phun thuốc sau khi lúa trổ bông 5-7 ngày Val-A cũng có ảnh hưởng tới một số hoạt tính enzyme trong đất, ví dụ với hàm lượng 240 mg/ml validamycin sẽ làm giảm 14% hoạt tính của catalase, gây ức chế 67,3 % hoạt tính của urease và làm tăng hoạt tính của enzym axit phosphatase 29,7% Tuy nhiên, validamycin dễ dàng được các VSV đất sử dụng làm nguồn carbon và năng lượng cho sinh trưởng Vì vậy, sử dụng validamycin sẽ không gây ảnh hưởng đến môi trường đất [46] Voglibose, một dẫn xuất valiolamine từ validamycin cũng được sử dụng rộng rãi để điều trị bệnh tiểu đường [17], [48]

Trên thế giới, một số nước như Nhật, Hàn Quốc, Trung Quốc đã sản xuất validamycin ở qui mô công nghiệp bằng con đường sinh tổng hợp từ VSV Ngày nay, để sản xuất validamycin công nghiệp, người ta vẫn sử dụng

quá trình lên men bằng các chủng S hygroscopicus subsp jinggangensis [40],

[43] Ngoài việc lựa chọn môi trường và điều kiện lên men thích hợp, người

ta còn sử dụng các phương pháp gây đột biến nhằm tạo chủng có hoạt tính cao [16], [45], [46] Hầu hết các chủng được tuyển chọn bằng đột biến có định hướng có thể làm tăng lượng validamycin thu được lên 54,4% so với

chủng gốc [45]; xử lý đột biến chủng xạ khuẩn S hygroscopicus subsp jinggangensis Yen KN-16 bằng UV có thể làm tăng 33,5% hiệu suất thu hồi

val-A so với chủng gốc [46] Bên cạnh đó, bằng công nghệ đột biến bằng sóng viba, sóng siêu âm, bức xạ ion tế bào, hoặc công nghệ đột biến tế bào trần có thể cải thiện khả năng sinh tổng hợp của các kháng sinh trong công nghiệp và giảm giá thành sản xuất [46] Đột biến bằng sóng viba có thể tăng đến trên 21% hiệu suất thu validamycin và sản xuất ổn định trong bốn lần lên men liên tục sau thời gian bảo quản 10 tháng [16] Như vậy, việc cải tạo chủng giống VSV và nghiên cứu tối ưu quá trình lên men là một trong những hướng đi đầy triển vọng trong công nghiệp sản xuất validamycin, đặc biệt là làm giảm giá thành trong sản xuất công nghiệp

1.2 Xạ khuẩn sinh validamycin A

1.2.1 Đặc điểm của xạ khuẩn

1.2.1.1 Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn

Hình thái của khuẩn lạc xạ khuẩn rất khác nhau, kích thước và hình dạng của chúng thay đổi phụ thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, độ ẩm…) Trên môi trường đặc, xạ khuẩn phát triển thành những khuẩn lạc khô, kích thước thay đổi Mặt khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù

xì, có dạng đá vôi, dạng nhung tơ hay dạng màng dẻo, có các nếp tỏa ra theo hình phóng xạ và bám sâu vào thạch với nhiều màu sắc: đỏ, da cam, vàng,

trắng, xanh tùy thuộc vào điều kiện dinh dưỡng môi trường [1], [11] Xạ khuẩn thuộc loài dị dưỡng, chúng sử dụng nguồn cacbon là tinh bột, các loại đường (glucose, maltose, saccarose ) và các hợp chất polysacaride Nguồn nitơ vô cơ thường là: nitrate, muối amon , nitơ hữu cơ thường là: pepton, cao ngô, cao nấm men Khả năng đồng hóa các chất này ở các chủng xạ khuẩn khác nhau là không giống nhau Phần lớn chúng là các VSV hiếu khí và ưa ấm; xạ khuẩn ưa nhiệt thường ít gặp Phần lớn xạ khuẩn phát triển tốt ở môi trường có pH trung tính và hơi kiềm; ở môi trường pH thấp hoặc quá kiềm xạ khuẩn không phát triển hoặc phát triển kém Các chủng xạ khuẩn phát triển được ở nồng độ muối 3-5% (w/v), còn ở nồng độ cao hơn có thể bị ức chế hoặc bị tiêu diệt [8], [9], [11] Xạ khuẩn (actinomycet) là nhóm VSV đơn bào hay vi khuẩn thật, phân bố rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nước ao

hồ, nước biển, một phần trong bùn, lớp trầm tích và trong các chất hữu cơ khác [25] Một vài loài có thể gây bệnh cho động thực vật Phần lớn xạ khuẩn

là các tế bào Gram (+), hoại sinh, có cấu tạo sợi phân nhánh Xạ khuẩn được nghiên cứu sâu vì chúng có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên: tích cực tham gia vào các quá trình chuyển hóa nhiều hợp chất trong đất, trong nước, xạ khuẩn có vai trò quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất của tự nhiên Chúng sản sinh ra nhiều sản phẩm trao đổi chất quan trọng khác nên đã được dùng để sản xuất nhiều loại enzyme như: protease, amylase, cellulase, glucoizomerase, vitamin và các axit hữu cơ Tuy nhiên đặc điểm quan trọng nhất của xạ khuẩn là khả năng sinh chất kháng sinh, trong đó 60 - 70% xạ khuẩn phân lập được từ đất có khả năng này [29] Trong khoảng 8000 chất kháng sinh hiện đã được biết đến trên thế giới thì trên 80% là do xạ khuẩn sinh tổng hợp Đây là kết quả của quá trình đối kháng giữa các VSV và thúc đẩy quá trình tiến hóa của xạ khuẩn

Xạ khuẩn giống nấm mốc ở chỗ có thể tạo thành hệ sợi, nhưng lại là cơ thể đơn bào, không có nhân thực và có kích thước giống vi khuẩn Khuẩn lạc

xạ khuẩn thường có 3 lớp: lớp vỏ ngoài có các sợi bện chặt, lớp trong tương

đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong Khuẩn lạc xạ khuẩn thường có màu sắc khác nhau: đỏ, da cam, vàng, tím, nâu tùy thuộc vào từng loài và điều kiện ngoại cảnh như: pH, nhiệt độ, thành phần môi trường nuôi cấy [10], [11], [29]

Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn được phân biệt ở hướng sinh trưởng trong

và ngoài môi trường tạo thành khuẩn ty cơ chất (KTCC) và khuẩn ty khí sinh (KTKS) KTCC cắm sâu vào môi trường để lấy chất dinh dưỡng, còn KTKS thì phát triển ra ngoài không khí, phần cuối của khuẩn ty này thường biến thành cuống sinh bào tử Khuẩn ty xạ khuẩn mảnh hơn khuẩn ty của nấm mốc

và có đường kính thay đổi trong khoảng từ 0,2 - 1,0 µm đến 2 - 3 µm Đa số

xạ khuẩn có khuẩn ty không có vách ngăn và không tự đứt đoạn [9], [11], [12]

* Màng tế bào xạ khuẩn: gồm có thành tế bào và màng nguyên sinh chất:

- Thành tế bào có dạng kết cấu lưới, dày khoảng 10-20 nm có tác dụng duy trì hình dáng của khuẩn ty và bảo vệ tế bào Thành tế bào chia thành 3 lớp: lớp ngoài dày khoảng 60 - 120 Å khi già có thể lên đến 150 Å, lớp giữa rắn chắc dày khoảng 50 Å và lớp trong cùng dày khoảng 50 Å Thành tế bào

xạ khuẩn được cấu tạo chủ yếu từ các lớp glycopeptide gồm các gốc axetylglucosamine liên kết với axit N-axetylmuzamic bởi các liên kết 1,4 glycoside Khi xử lý bằng lyzozym, các liên kết này bị phá vỡ, thành tế bào bị phá hủy và màng sinh chất bao bọc phần còn lại của tế bào tạo thành tế bào trần Cấu trúc sợi cũng mất đi khi xử lý bằng hỗn hợp este, cloroform và các dung môi hòa tan lipid Điều đó chứng tỏ lớp ngoài thành tế bào xạ khuẩn có cấu tạo bằng lipid Thành tế bào xạ khuẩn không chứa cellulase hay chitin [10]

N Màng nguyên sinh chất nằm phía trong thành tế bào, dày khoảng 7,5N 10

nm Chúng có cấu trúc và chức năng tương tự như màng tế bào chất của vi khuẩn: chủ yếu gồm 2 thành phần protein và photpholipid, màng chứa nhiều

enzyme có vai trò đặc biệt quan trọng trong quá trình vận chuyển và trao đổi chất qua màng [4], [5], [10]

* Thể trung gian hay mezosom: nằm ở phía trong của màng tế bào chất

và có hình phiến, hình bọng hay hình ống Công dụng của thể trung gian là làm tăng diện tích tiếp xúc của màng tế bào chất và do đó tăng cường hoạt tính của enzym, tăng sự chuyển điện tử [10]

* Các vật thể ẩn nhập: nằm trong tế bào chất của xạ khuẩn gồm các hạt

polyphotphat (hình cầu, bắt màu với thuốc nhuộm Soudan III), các hạt polysaccharide (bắt màu với dung dịch Lugol) [4], [9] Xạ khuẩn là nhóm vi khuẩn Gram (+), “nhân” của xạ khuẩn cùng loại với nhân của vi khuẩn nhưng khác với các VSV không có nhân thực khác là tỉ lệ G + C cao (>70%) trong khi đó ở vi khuẩn là 25-40% [4]

Một trong những đặc điểm đáng chú ý của xạ khuẩn là chúng không bền vững về mặt di truyền và thường xảy ra sự sắp xếp lại trong phân tử ADN Điều này gây ra một số hiện tượng lạ như: tạo ra tính đa dạng của hình thái, tính kháng thuốc do sự xuất hiện của các dị vòng [10]

1.2.1.2 Sự sinh trưởng và phát triển của xạ khuẩn

Trong số khoảng 1000 chi và hơn 5000 loài sinh vật nhân sơ đã công bố

có khoảng 100 chi và hơn 1000 loài xạ khuẩn Mặc dù xạ khuẩn thuộc nhóm sinh vật nhân sơ nhưng chúng thường sinh trưởng dưới dạng sợi và tạo nhiều bào tử

Một bào tử xạ khuẩn khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ trương lên, sau 1-2 giờ xuất hiện quá trình tổng hợp ARN, nhân các gen cần thiết từ hệ gen và tiến hành tổng hợp protein hình thành KTKS Đầu KTKS kéo dài và phát triển hệ sợi theo phương pháp mọc chồi phân nhánh (khoảng 30 µm phân 1 nhánh) Độ dài khuẩn ty xạ khuẩn trong giai đoạn phát triển khoảng 11 μm/1

giờ và nhân của xạ khuẩn sắp xếp đều đặn theo chiều dài của khuẩn ty [3],

[4]

Hình 1.3 Hình ảnh minh họa sự nảy mầm và phát triển của xạ khuẩn

1.2.1.3 Sự hình thành bào tử của xạ khuẩn

Khuẩn ty khí sinh phát triển ra ngoài không khí và thường phần cuối các khuẩn ty này biến thành cuống sinh bào tử Hai dạng cuống sinh bào tử và cuống sinh nang bào tử có thể riêng rẽ, có thể phân nhánh Cuống sinh bào tử hình thành bào tử trần, các chuỗi bào tử trần có thể chỉ là một bào tử, có thể là hai bào tử, có thể là chuỗi ngắn hoặc dài, có thể các bào tử trần nằm trên bó sợi, tương tự bó sợi của nấm [4], [9] Cuống sinh nang bào tử mang bào tử kín nằm trong túi (nang) bào và bào tử di động [8]

Hình thái, kích thước của cuống sinh bào tử và bào tử là đặc điểm quan trọng nhất trong phân loại xạ khuẩn Cuống sinh bào tử thường có dạng thẳng (R), thẳng hơi lượn sóng (RF), dạng xoắn lò xo (SR), xoắn đơn giản hình móc câu (SRA), xoắn lượn sóng (SRF) [11] Cuống sinh bào tử dạng xoắn có chiều dài và số vòng khác nhau Cuống sinh bào tử dạng thẳng có thể là dài hoặc ngắn với các dạng lông cứng hoặc có thể thon lại, uốn cong hay kéo dài Những đặc điểm này rất quan trọng khi định tên xạ khuẩn [4] Cuống sinh bào

tử xạ khuẩn hình thành bào tử theo 3 phương thức sau:

- Phương thức phát triển toàn bộ: toàn bộ hay một bộ phận của khuẩn ty hình thành ra các thành của bào tử

Bào tử Bào tử nảy mầm Hệ sợi

- Phương thức phát triển trong thành: thành bào tử sinh ra từ tầng nằm giữa màng nguyên sinh chất và thành khuẩn ty Trường hợp này gặp ở xạ

khuẩn thuộc chi Planomonospora

- Phương thức phát triển thành bào tử nội sinh thật: thành khuẩn ty

không tham gia vào quá trình hình thành ra bào tử Thermoactynomyces [11]

1.2.1.4 Các con đường trao đổi chất ở xạ khuẩn

Xạ khuẩn là một trong những nhóm VSV tạo ra các sản phẩm bậc hai lớn nhất trong nhóm sinh vật nhân thật Trái ngược với các sản phẩm trao đổi chất bậc một, những sản phẩm trao đổi chất bậc hai không cần thiết cho sự phát triển của VSV và được tổng hợp từ những sản phẩm trung gian hay sản phẩm cuối cùng của quá trình trao đổi chất bậc một qua con đường tổng hợp sinh học Nhiều công bố từ 1988 đến nay đã chỉ ra rằng, có hơn 100 nghìn trao đổi chất bậc hai mới được tìm thấy ở xạ khuẩn Hầu hết các sản phẩm

trao đổi bậc hai đã biết đến đều được tạo ra bởi Streptomyces sp [11], [29]

Những sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được tổng hợp dưới những điều kiện phát triển thích hợp cuối pha log hoặc ở pha cân bằng Sự hình thành các sản phẩm này được định hướng bởi tập hợp tổ chức các gen liên quan đến những

cơ chế điều hòa nhằm kiểm soát được cả thời điểm và mức độ biểu hiện [3], [4], [37]

Hình 1.4 Mối quan hệ giữa các pha sinh trưởng của xạ khuẩn

Việc các gen điều khiển tăng cường sự trao đổi chất để giải phóng ra một lượng lớn các chất trung gian thừa do sự trao đổi chất bậc một tạo ra, nồng độ các chất trung gian này trong tế bào cao có thể gây độc cho tế bào, nếu sự giải phóng của các chất này không xảy ra, sự trao đổi chất không thể thực hiện, sự chuyển đổi của chúng tạo thành sản phẩm ít độc hơn, hoặc giải phóng những chất trao đổi dễ dàng hơn, có thể là biện pháp để ngăn ngừa việc tạo nên độc tố trung gian [11] Một vài enzym trong sự trao đổi chất bậc hai cũng được điều chỉnh qua sự ức chế ngược tạo nên vai trò trong sự trao đổi chất quá mức kém hợp lý [8]

Việc phân lập các chủng xạ khuẩn sinh ra các sản phẩm trao đổi chất bậc hai có hoạt tính kháng vi khuẩn, kháng nấm, kháng sự phát triển khối u,

có khả năng phân hủy những thuốc diệt cỏ, thuốc trừ sâu, ngày càng được quan tâm nghiên cứu thông qua việc tìm hiểu các con đường tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa bậc hai Bước đầu tiên trong quá trình sinh tổng hợp các sản phẩm chuyển hóa thứ cấp thông thường bao gồm một loạt các enzyme đặc hiệu để tổng hợp nên một khối vật chất chung [50]

1.2.2 Thời điểm sinh kháng sinh của xạ khuẩn

Cũng như đa số các vi sinh vật khác, trong môi trường dịch thể quá trình sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn chia làm 4 pha:

- Pha lag: sinh khối tăng không đáng kể

- Pha log: lượng sinh khối tăng theo hàm log, ở cuối pha này có sự tổng hợp nên các sản phẩm bậc hai như chất kháng sinh

- Pha cân bằng: ở pha này sinh khối không tăng, hầu hết các chất dinh dưỡng còn lại trong môi trường đều được sử dụng để tổng hợp kháng sinh

- Pha suy tàn: sinh khối giảm nhanh, lượng chất kháng sinh cũng giảm Chất kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất bậc hai, thông thường được hình thành ở cuối pha sinh trưởng (pha log), trong pha cân bằng Ở xạ khuẩn,

sinh tổng hợp chất kháng sinh có quan hệ nghịch với sự hình thành bào tử Đây là điểm cần lưu ý trong khi nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh từ

xạ khuẩn [11], [12]

1.2.3 Một số đặc trƣng cơ bản của xạ khuẩn có khả năng sinh validamycin A

Cho đến thời điểm hiện nay đã có rất nhiều xạ khuẩn thuộc các chi

khác nhau có khả năng sinh kháng sinh cao đã tìm thấy như Streptomyces, Micromonospora…nhưng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh kháng sinh

phổ biến nhất…Trong khoảng hai thập kỉ qua, số lượng các hợp chất kháng

VSV được công bố từ xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces mỗi năm tăng lên gần

như theo cấp số nhân Cho đến nay, những kết quả công bố của các nhà khoa học cho thấy đã tìm ra khoảng 4000 chất kháng sinh từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm; rất nhiều những kháng sinh được ứng dụng trong y học nhưng phần lớn

trong số đó được sinh tổng hợp bởi Streptomyces, điển hình như:

aminoglycoside, anthracycline, glycopeptit, β-lactam, macrolid, nucleoside, peptide, polyen, polyether và tetracyclin

Theo các nghiên cứu công bố, xạ khuẩn có khả năng sinh val-A chủ

yếu ở hai loài chính là S hygroscopicus var limoneus và S hygroscopicus subsp jinggangensis Các chủng S hygroscopicus có một số đặc trưng về đặc

điểm sinh học như sau:

+ Đặc điểm hình thái: S hygroscopicus có KTKS phân nhánh và mỗi

nhánh thường cuộn xoắn từ 3-5 vòng Các bào tử có dạng hình ovan hoặc hình trụ, kích thước 1,0-1,3x1-1,5 µm Bề mặt khuẩn lạc nhẵn

+ Đặc điểm nuôi cấy: KTKS có màu từ xám đến vàng xám, sợi nấm có màu đen trên một số môi trường như môi trường có bổ sung asparagine và môi trường thạch chứa tinh bột Màu của khuẩn ty cơ chất là vàng tươi đến vàng đất, trong một số trường hợp là màu xanh rêu; có khả năng sinh sắc tố

tan kém trên một số môi trường Tuy nhiên sắc tố tan màu nâu sẫm trên môi trường có chứa protein nên không quan sát được.[24,39]

+ Đặc điểm sinh lý sinh hóa: Chủng S hygroscopicus var limoneus có

khả năng sinh trưởng trong phổ nhiệt rộng 25-45oC Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của chủng này cũng khá cao 25-37oC Chủng có khả năng đồng hóa tốt hầu hết các nguồn đường như D-xylose, L-arabinose, manose [24]

1.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng lên men sinh validamycin A của xạ khuẩn

Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh val-A cũng khá tương đồng với các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh kháng sinh khác của xạ khuẩn nói chung

1.3.1 Ảnh hưởng của thành phần môi trường lên men

Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố như pH, nhiệt độ…và thành phần của môi trường lên men Để đảm bảo cho xạ khuẩn có thể phát triển tốt cần đảm bảo trong môi trường có đầy

đủ nguồn cacbon, nguồn nitơ và các nguyên tố vi lượng Mỗi một chủng xạ khuẩn khác nhau cần một nguồn cơ chất khác nhau, tuy nhiên tỉ lệ C/N đóng vai trò quyết định đến sự tổng hợp kháng sinh [28]

1.3.1.1 Nguồn cacbon

Nguồn cacbon là nguyên liệu không thể thiếu đối với đời sống VSV, ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chất kháng sinh do nguồn cacbon tham gia vào cấu tạo tế bào và tham gia vào quá trình hình thành lên cấu trúc của sản phẩm

Nguồn cacbon thường sử dụng là các nguồn đường đơn như glucose, fructose…, các loại đường đôi như maltose, lactose, saccharose…, ngoài ra có thể sử dụng tinh bột, rỉ đường Trong đó nguồn đường glucose là nguồn cacbon dễ sử dụng nhất, tuy nhiên nếu sử dụng nhiều nguồn đường này thì hiệu suất của quá trình lên men sẽ giảm đi Nguyên nhân là do glucose làm

tăng lượng axit hữu cơ trong môi trường, đồng thời làm tăng các chất hữu cơ

và axit nucleic trong khuẩn ty dẫn đến thay đổi hoạt tính các enzyme phân giải glucose…Tuy nhiên, có thể khắc phục được hiện tượng này bằng cách chia nhỏ tổng lượng glucose và bổ sung định kì vào môi trường lên men để không xảy ra sự tích luỹ các chất ức chế trung gian[8], [11]

1.3.1.2 Nguồn nitơ

Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn đòi hỏi cung cấp đầy đủ nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ Trong đó nguồn nitơ vô cơ cho khả năng sinh chất kháng sinh không cao, còn nguồn nitơ hữu cơ lại có tác động khá tốt đến khả năng này do cung cấp các nguồn acid amin quan trọng, dễ dàng đi vào chu trình tổng hợp để tạo thành sản phẩm Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp thường sử dụng là cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương…, còn nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là các muối amon, muối nitrat như (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3 [12], [28]

1.3.1.3 Khoáng chất và vi lượng

VSV nói chung và xạ khuẩn nói riêng rất cần chất khoáng trong quá trình trao đổi chất của chúng Một lượng nhỏ các nguyên tố vi lượng cũng có ảnh hưởng nhất định đến sự hình thành CKS của xạ khuẩn Sự có mặt của một

số muối khoáng như Na+

, Fe3+, Al3+, Bo2+, K+, Cr+, Cu2+, Mn2+, Zn2+ trong môi trường lên men sẽ tác dụng khác nhau đến khả năng sinh kháng sinh của VSV Sự có mặt của nguyên tố này sẽ làm giảm tác dụng kìm hãm hoặc làm tăng tác dụng kích thích của nguyên tố kia Một số muối khoáng như Ca2+

,

Cu2+…được cho là có ảnh hưởng tới khả sinh ra một vài loại kháng sinh trong

đó có val-A Các khoáng chất này có tác động lên hoạt động của các enzyme trong quá trình sinh tổng hợp kháng sinh [11], [12]

1.3.1.4 Nguồn photpho

Nguồn photpho vô cơ là yếu tố điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp phần lớn chất kháng sinh không quá 10 µg/ml [9]

Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng acid nucleic trong khuẩn ty xạ khuẩn, làm kéo dài pha sinh trưởng, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến làm giảm hoặc ngừng sinh tổng hợp chất kháng sinh [8], [9]

1.3.2 Ảnh hưởng của điều kiện lên men

Điều kiện lên men như nhiệt độ, pH, độ thông khí, hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường…cũng là yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn [8]

1.3.2.1 Nhiệt độ

Phần lớn xạ khuẩn sinh trưởng tốt trong dải nhiệt độ từ 28-30oC Mỗi loại xạ khuẩn có một khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh Có chủng sinh kháng sinh cao ở nhiệt độ 18oC, có chủng lại sinh kháng sinh tốt ở 28o

C [9]

1.3.2.2 pH

pH thích hợp cho quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng

sinh thường là trung tính Đối với các chủng Streptomyces sp thì pH thích

hợp là 6,5 -8,0 Môi trường kiềm hay axit đều ảnh hưởng đến quá trình này, tuy nhiên, pH cho phép sinh trưởng thường lớn hơn so với pH tối ưu cho sự tổng hợp chất kháng sinh [8], [9]

1.3.2.3 Độ thông khí

Là yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và sinh kháng sinh của xạ khuẩn Nếu độ thông khí bị hạn chế sẽ ức chế quá trình sinh trưởng và khả

năng tích lũy chất dinh dưỡng, làm thay đổi hình thái của khuẩn ty và giảm khả năng sinh tổng hợp kháng sinh [8], [9]

1.3.2.4 Giống và tỉ lệ tiếp giống

Sinh tổng hợp kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của bào

tử và tuổi giống, khả năng đồng đều về mặt di truyền Môi trường nhân giống

và lượng giống bổ sung cũng ảnh hưởng không nhỏ đến lượng kháng sinh được tổng hợp ra Môi trường nhân giống giàu chất dinh dưỡng hơn môi trường lên men sẽ cho hiệu suất sinh tổng hợp chất kháng sinh cao Thông thường, lượng giống cấy truyền vào môi trường lên men để hiệu quả nhất là

từ 2-10% (v/v), tuổi giống thường là 24 giờ [3]

1.4 Tình hình nghiên cứu sinh tổng hợp validamycin A trong và

ngoài nước

1.4.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới

Năm 1966, một kháng sinh mới đã được chiết từ dịch lọc của S hygroscopicus var limoneus, chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất ở Nhật

Bản Nó có hiệu quả để trừ bệnh khô vằn ở cây lúa và có tên gọi là validamycin Năm 1972, một kháng sinh có hoạt tính tương tự như

validamycin của Nhật Bản, được thu từ dịch lên men của S hygroscopicus subsp yingchengensis được phân lập từ ruộng lúa ở ĐH Nông nghiệp

Huazhong, Yingcheng, tỉnh Hồ Bắc, Trung Quốc nhưng hoạt tính kháng sinh

thấp S hygroscopicus subsp jinggangensis Yen được Viện Nghiên cứu thuốc

trừ sâu Thượng Hải phân lập từ đất ở núi Jinggang, tỉnh Jiangxi năm 1973, đây là loài có khả năng sinh tổng hợp validamycin cao Sau đó được đột biến bằng UV, hóa chất N- metyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) và do đó, tạo

các biến chủng S hygroscopicus subsp jinggangensis Yen sinh lượng lớn validamycin Hiện nay, chủng S hygroscopicus subsp jinggangensis Yen là

chủng sinh validamycin chủ yếu ở Trung Quốc, hoạt tính tăng từ 10.000 lên

30.000 mg/L Năm 2006, nhóm gen sinh tổng hợp validamycin được tách dòng thành công đã tạo ra một validamycin thế hệ mới Đây là sản phẩm hợp tác giữa Đại học Jiaotong Thượng Hải, Đại học Bang Oregon và Đại học Washington, có vai trò quan trọng nhằm giảm chi phí sản xuất, tăng khả năng sản xuất và hoạt tính kháng sinh, sàng lọc các chủng có hoạt tính cao và sản xuất ra các loại dẫn xuất validamycin mới [20], [21]

Trong suốt thập kỷ 70 và 80, nhiều nhà máy sản xuất validamycin ra đời nhưng còn ở quy mô nhỏ, chỉ đáp ứng cho nhu cầu của địa phương Tuy nhiên, thời gian đó mỗi năm có 5 triệu tấn lúa được bảo vệ nhờ vào việc sử dụng validamycin Trải qua hơn 30 năm, quy mô sản xuất validamycin đã tăng mạnh và 90% bệnh khô vằn ở cây lúa đã được kiểm soát Validamycin được sử dụng rộng rãi trên 12.5 triệu ha trồng cây nông nghiệp ở Trung Quốc Sản lượng validamycin xuất khẩu của Trung Quốc ổn định, khoảng 40000 tấn, lớn nhất thế giới và một số sản phẩm đã được xuất khẩu đến Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan và Singapore [22], [23] Trong các dòng validamycin thì val-A được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất

Validamycin A có thể được sử dụng mà không gây ảnh hưởng đến cây trồng và có độc tính rất thấp đối với động vật có vú, hầu như không gây độc đối với chim, cá và côn trùng, sử dụng với liều lượng thấp và hiệu quả kéo dài Hiện nay, val-A vẫn được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp ở Trung Quốc và các nước châu Á khác [25]

1.4.2 Tình hình nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức độ thâm canh cao, khai thác đất theo chiều sâu với việc sử dụng các kỹ thuật trồng trọt tiên tiến, giống mới có năng suất cao, sử dụng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học và hàng loạt các biện pháp như trồng lúa 3 vụ, phá rừng canh tác cà phê, hồ tiêu, điều… với mục đích khai thác, chạy theo năng suất và sản lượng của toàn xã hội Chính vì vậy, với sự canh

tác trên đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất, hệ VSV trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh một số dịch hại không được dự báo trước

Việt Nam nằm trong nhóm các nước sử dụng thuốc bảo vệ thực vật cao trên thế giới Thuốc bảo vệ thực vật ở Việt Nam chủ yếu được tổng hợp từ hai nguồn gốc, nguồn gốc hóa học và nguồn gốc sinh học Thuốc có nguồn gốc hóa học rất đa dạng và phân ra nhiều nhóm chẳng hạn như pyrethroid, carbamate, phospho hữu cơ, azole, alanine…Thuốc có nguồn gốc sinh học (tự nhiên) chủ yếu gồm nhóm thảo mộc và nhóm vi sinh Ưu điểm của thuốc bảo

vệ thực vật sinh học là ít ảnh hưởng đến thiên địch, an toàn đối với môi trường, đáp ứng yêu cầu xây dựng nền nông nghiệp xanh, sạch, bền vững Phương hướng phát triển của nền nông nghiệp Việt Nam trong thời gian tới là xây dựng nên nền nông nghiệp sinh thái bền vững, đa canh, đa dạng hóa sản phẩm Để thực hiện định hướng trên, vấn đề giống cây trồng và công tác bảo vệ thực vật đóng vai trò quan trọng Quản lý dịch hại tổng hợp Integrated Pest Management (IPM) trên cây trồng nông, lâm nghiệp, trên cơ sở tăng cường sử dụng các tác nhân và chế phẩm sinh học là hướng nghiên cứu mang lại hiệu quả kinh tế, góp phần xây dựng nền nông nghiệp sinh thái bền vững

Các chế phẩm sinh học ứng dụng cho cây trồng hiện nay cơ bản được chia làm 3 nhóm sản phẩm với các tính năng khác nhau:

- Nhóm chế phẩm sinh học ứng dụng cho việc phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng

- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, chất kích thích tăng trưởng bón cho cây trồng

- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp

Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong danh mục các loại thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học, từ năm 2000 chỉ có 2 sản phẩm trừ sâu sinh học được công nhận cho đăng ký Đến năm 2005 đã có 57 sản phẩm các loại, đến 6 tháng đầu năm 2007 có 193 sản phẩm được cấp giấy phép đăng ký, nâng tổng số có 479 sản phẩm sinh học được phép lưu hành, trong

đó có 300 loại thuốc trừ sâu và 98 sản phẩm thuốc trừ bệnh Các sản phẩm này đã góp phần không nhỏ vào công tác phòng trừ dịch hại, góp phần thay thế và hạn chế dần nguy cơ độc hại do sử dụng thuốc BVTV nguồn gốc hóa học ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gây ô nhiễm môi trường

Một trong các loại thuốc sinh học phổ biến được sử dụng lâu đời tại Việt Nam để phòng trừ các loại nấm gây bệnh cho cây trồng là validamycin Tại Việt Nam, nhà máy nông dược vi sinh chuyên sản xuất validamycin thuộc Công Ty liên doanh Viguato Đây là Công ty liên doanh giữa Công ty cổ phần Thuốc sát trùng Việt Nam- Vipesco và Công ty Thuốc vi sinh Đồng Lô- Trung Quốc Công ty liên doanh Viguato được xây dựng và hoạt động từ năm

1995, công suất ban đầu là 3.000 tấn hoạt chất validamycin/năm Năng suất đã đạt được 5.000 tấn/năm 2007 Nhà máy có khả năng cung ứng đủ cho

cả nước hoạt chất validamycin để sản xuất thương phẩm phòng trừ bệnh khô vằn hại lúa và một số cây trồng khác như khoai tây, gừng, rau…và mốc hồng trên cao su [51]

Chất kháng sinh sinh học sử dụng để phòng chống bệnh cho cây tỏ ra

có nhiều ưu việt: có tác dụng nhanh, chọn lọc và dễ bị phân hủy Trong bảo

vệ thực vật, các chất kháng sinh được ứng dụng chậm hơn, với quy mô nhỏ hơn so với việc dùng trong y học và chăn nuôi thú y nhưng chúng có triển vọng to lớn trong thực tế sản xuất Ngày nay, cùng với sự phát triển của các ngành công nghiệp, môi trường không khí, nước và đất đang bị ô nhiễm nghiêm trọng, tàn dư của các chất sát trùng và thuốc trừ sâu còn lại trong rau quả và các sản phẩm nông nghiệp ngày càng tăng nên việc áp dụng các biện

pháp sinh học để phòng trừ sâu bệnh là rất cần thiết Tuy nhiên cần có sự phối hợp có kế hoạch trong việc sản xuất các chất kháng sinh phòng chống bệnh cho cây trồng, xây dựng biện pháp đấu tranh sinh học, khi cần có thể phối hợp với các biện pháp hóa học sẽ đem lại những hiệu quả lớn hơn trong lĩnh vực phòng chống bệnh và nâng cao năng suất cây trồng

Tuy nhiên trong nước việc ứng dụng các chế phẩm sinh học phục vụ cây trồng trong nước còn gặp một số vấn đề như sau:

- Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học trong phòng trừ sâu hại ở Việt Nam chủ yếu ở trong phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất thử, khả năng bảo quản các thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học còn tốn nhiều chi phí dẫn đến giá thành cao

- Do điều kiện canh tác chưa tập trung, còn mang tính hộ nhỏ lẻ nên chưa

có giá trị chuyển giao, khuyến cáo người sử dụng

- Nhà sản xuất cần đầu tư quảng cáo sản phẩm

Để đẩy mạnh sản xuất các loại thuốc kháng sinh kháng nấm nói chung

và validamycin nói riêng, việc đẩy mạnh đầu tư nghiên cứu làm chủ nguồn giống và cải tạo nâng cao năng suất bằng công nghệ sản xuất là cần thiết Điều này sẽ giúp làm chủ toàn bộ khâu giống, công nghệ và dẫn tới giảm giá thành sản xuất [49]