Năm 1966, một kháng sinh mới đã được chiết từ dịch lọc của S. hygroscopicus var. limoneus, chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất ở Nhật Bản. Nó có hiệu quả để trừ bệnh khô vằn ở cây lúa và có tên gọi là validamycin. Năm 1972, một kháng sinh có hoạt tính tương tự như validamycin của Nhật Bản, được thu từ dịch lên men của S. hygroscopicus
subsp. yingchengensis được phân lập từ ruộng lúa ở ĐH Nông nghiệp Huazhong, Yingcheng, tỉnh Hồ Bắc, Trung Quốc nhưng hoạt tính kháng sinh thấp. S. hygroscopicus subsp. jinggangensis Yen được Viện Nghiên cứu thuốc trừ sâu Thượng Hải phân lập từ đất ở núi Jinggang, tỉnh Jiangxi năm 1973, đây là loài có khả năng sinh tổng hợp validamycin cao. Sau đó được đột biến bằng UV, hóa chất N- metyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) và do đó, tạo các biến chủng S. hygroscopicus subsp. jinggangensis Yen sinh lượng lớn validamycin. Hiện nay, chủng S. hygroscopicus subsp. jinggangensis Yen là chủng sinh validamycin chủ yếu ở Trung Quốc, hoạt tính tăng từ 10.000 lên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn 30.000 mg/L. Năm 2006, nhóm gen sinh tổng hợp validamycin được tách dòng thành công đã tạo ra một validamycin thế hệ mới. Đây là sản phẩm hợp tác giữa Đại học Jiaotong Thượng Hải, Đại học Bang Oregon và Đại học Washington, có vai trò quan trọng nhằm giảm chi phí sản xuất, tăng khả năng sản xuất và hoạt tính kháng sinh, sàng lọc các chủng có hoạt tính cao và sản xuất ra các loại dẫn xuất validamycin mới [20], [21].
Trong suốt thập kỷ 70 và 80, nhiều nhà máy sản xuất validamycin ra đời nhưng còn ở quy mô nhỏ, chỉ đáp ứng cho nhu cầu của địa phương. Tuy nhiên, thời gian đó mỗi năm có 5 triệu tấn lúa được bảo vệ nhờ vào việc sử dụng validamycin. Trải qua hơn 30 năm, quy mô sản xuất validamycin đã tăng mạnh và 90% bệnh khô vằn ở cây lúa đã được kiểm soát. Validamycin được sử dụng rộng rãi trên 12.5 triệu ha trồng cây nông nghiệp ở Trung Quốc. Sản lượng validamycin xuất khẩu của Trung Quốc ổn định, khoảng 40000 tấn, lớn nhất thế giới và một số sản phẩm đã được xuất khẩu đến Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan và Singapore [22], [23]. Trong các dòng validamycin thì val-A được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất.
Validamycin A có thể được sử dụng mà không gây ảnh hưởng đến cây trồng và có độc tính rất thấp đối với động vật có vú, hầu như không gây độc đối với chim, cá và côn trùng, sử dụng với liều lượng thấp và hiệu quả kéo dài. Hiện nay, val-A vẫn được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp ở Trung Quốc và các nước châu Á khác [25].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Ở Việt Nam, sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức độ thâm canh cao, khai thác đất theo chiều sâu với việc sử dụng các kỹ thuật trồng trọt tiên tiến, giống mới có năng suất cao, sử dụng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học và hàng loạt các biện pháp như trồng lúa 3 vụ, phá rừng canh tác cà phê, hồ tiêu, điều… với mục đích khai thác, chạy theo năng suất và sản lượng của toàn xã hội. Chính vì vậy, với sự canh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn tác trên đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất, hệ VSV trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh một số dịch hại không được dự báo trước.
Việt Nam nằm trong nhóm các nước sử dụng thuốc bảo vệ thực vật cao trên thế giới. Thuốc bảo vệ thực vật ở Việt Nam chủ yếu được tổng hợp từ hai nguồn gốc, nguồn gốc hóa học và nguồn gốc sinh học. Thuốc có nguồn gốc hóa học rất đa dạng và phân ra nhiều nhóm chẳng hạn như pyrethroid, carbamate, phospho hữu cơ, azole, alanine…Thuốc có nguồn gốc sinh học (tự nhiên) chủ yếu gồm nhóm thảo mộc và nhóm vi sinh. Ưu điểm của thuốc bảo vệ thực vật sinh học là ít ảnh hưởng đến thiên địch, an toàn đối với môi trường, đáp ứng yêu cầu xây dựng nền nông nghiệp xanh, sạch, bền vững. Phương hướng phát triển của nền nông nghiệp Việt Nam trong thời gian tới là xây dựng nên nền nông nghiệp sinh thái bền vững, đa canh, đa dạng hóa sản phẩm. Để thực hiện định hướng trên, vấn đề giống cây trồng và công tác bảo vệ thực vật đóng vai trò quan trọng. Quản lý dịch hại tổng hợp Integrated Pest Management (IPM) trên cây trồng nông, lâm nghiệp, trên cơ sở tăng cường sử dụng các tác nhân và chế phẩm sinh học là hướng nghiên cứu mang lại hiệu quả kinh tế, góp phần xây dựng nền nông nghiệp sinh thái bền vững.
Các chế phẩm sinh học ứng dụng cho cây trồng hiện nay cơ bản được chia làm 3 nhóm sản phẩm với các tính năng khác nhau:
- Nhóm chế phẩm sinh học ứng dụng cho việc phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng.
- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, chất kích thích tăng trưởng bón cho cây trồng.
- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong danh mục các loại thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học, từ năm 2000 chỉ có 2 sản phẩm trừ sâu sinh học được công nhận cho đăng ký. Đến năm 2005 đã có 57 sản phẩm các loại, đến 6 tháng đầu năm 2007 có 193 sản phẩm được cấp giấy phép đăng ký, nâng tổng số có 479 sản phẩm sinh học được phép lưu hành, trong đó có 300 loại thuốc trừ sâu và 98 sản phẩm thuốc trừ bệnh. Các sản phẩm này đã góp phần không nhỏ vào công tác phòng trừ dịch hại, góp phần thay thế và hạn chế dần nguy cơ độc hại do sử dụng thuốc BVTV nguồn gốc hóa học ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gây ô nhiễm môi trường.
Một trong các loại thuốc sinh học phổ biến được sử dụng lâu đời tại Việt Nam để phòng trừ các loại nấm gây bệnh cho cây trồng là validamycin. Tại Việt Nam, nhà máy nông dược vi sinh chuyên sản xuất validamycin thuộc Công Ty liên doanh Viguato. Đây là Công ty liên doanh giữa Công ty cổ phần Thuốc sát trùng Việt Nam- Vipesco và Công ty Thuốc vi sinh Đồng Lô- Trung Quốc. Công ty liên doanh Viguato được xây dựng và hoạt động từ năm 1995, công suất ban đầu là 3.000 tấn hoạt chất validamycin/năm. Năng suất đã đạt được 5.000 tấn/năm 2007. Nhà máy có khả năng cung ứng đủ cho cả nước hoạt chất validamycin để sản xuất thương phẩm phòng trừ bệnh khô vằn hại lúa và một số cây trồng khác như khoai tây, gừng, rau…và mốc hồng trên cao su [51].
Chất kháng sinh sinh học sử dụng để phòng chống bệnh cho cây tỏ ra có nhiều ưu việt: có tác dụng nhanh, chọn lọc và dễ bị phân hủy. Trong bảo vệ thực vật, các chất kháng sinh được ứng dụng chậm hơn, với quy mô nhỏ hơn so với việc dùng trong y học và chăn nuôi thú y nhưng chúng có triển vọng to lớn trong thực tế sản xuất. Ngày nay, cùng với sự phát triển của các ngành công nghiệp, môi trường không khí, nước và đất đang bị ô nhiễm nghiêm trọng, tàn dư của các chất sát trùng và thuốc trừ sâu còn lại trong rau quả và các sản phẩm nông nghiệp ngày càng tăng nên việc áp dụng các biện
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn pháp sinh học để phòng trừ sâu bệnh là rất cần thiết. Tuy nhiên cần có sự phối hợp có kế hoạch trong việc sản xuất các chất kháng sinh phòng chống bệnh cho cây trồng, xây dựng biện pháp đấu tranh sinh học, khi cần có thể phối hợp với các biện pháp hóa học sẽ đem lại những hiệu quả lớn hơn trong lĩnh vực phòng chống bệnh và nâng cao năng suất cây trồng.
Tuy nhiên trong nước việc ứng dụng các chế phẩm sinh học phục vụ cây trồng trong nước còn gặp một số vấn đề như sau:
- Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm sinh học trong phòng trừ sâu hại ở Việt Nam chủ yếu ở trong phòng thí nghiệm và quy mô sản xuất thử, khả năng bảo quản các thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học còn tốn nhiều chi phí dẫn đến giá thành cao.
- Do điều kiện canh tác chưa tập trung, còn mang tính hộ nhỏ lẻ nên chưa có giá trị chuyển giao, khuyến cáo người sử dụng.
- Nhà sản xuất cần đầu tư quảng cáo sản phẩm.
Để đẩy mạnh sản xuất các loại thuốc kháng sinh kháng nấm nói chung và validamycin nói riêng, việc đẩy mạnh đầu tư nghiên cứu làm chủ nguồn giống và cải tạo nâng cao năng suất bằng công nghệ sản xuất là cần thiết. Điều này sẽ giúp làm chủ toàn bộ khâu giống, công nghệ và dẫn tới giảm giá thành sản xuất [49].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
Chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405, S. hygroscopicus CNLM,
chủng nấm kiểm định Rhizoctonia solani VP, và các VSV kiểm định: Bacillus subtilis ATCC 6633, Sarcina lutea M5, B. cereus ATCC 21778, Escherichia coli ATCC 15224, Enterococcus faecallis 76, Salmonella typhi IFO14193,
Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans nhận được từ Bộ sưu tập giống VSV của Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.1.2. Hóa chất sử dụng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hóa chất Nguồn gốc
Cao nấm men Himedia, Ấn Độ
Cao malt BHD, Anh
Cao thịt, trypton Merck, Đức
Pepton, tinh bột tan Trung Quốc
Sacarose, glucose Việt Nam
Bột ngô Việt Nam
Bột đậu tương Việt Nam
Nhộng xay Việt Nam
Bột gạo Việt Nam
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn - Cân phân tích ADNHR – 2000 (Nhật Bản)
- Nồi hấp thanh trùng (Nhật Bản) - Tủ cấy vô trùng (Singapore) - Máy ly tâm (Eppendoft, Đức) - Máy lắc (Việt Nam)
- Máy đo pH Mettler Toledo - 320 (Nhật Bản) - Tủ ấm (Trung Quốc)
- Tủ khử trùng khô dụng cụ (Trung Quốc)
2.1.4. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy (xem phụ lục 1)
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phƣơng pháp giữ giống
Các chủng xạ khuẩn được giữ trong môi trường thạch nghiêng ISP2 ở nhiệt độ 4oC và cấy truyền lại hàng tháng. Giống sử dụng trong các nghiên cứu được hoạt hóa bằng cách nuôi trên môi trường thạch nghiêng ISP2 ở nhiệt độ 37o
C trong 2-4 ngày trước khi lên men. Để bảo quản lâu, giống được giữ trong ống cất, trong parafin lỏng vô trùng, giữ lạnh sâu trong glycerin ở -70 đến -80o
C hoặc đông khô.
Giữ giống các VSV kiểm định: Các chủng vi khuẩn được nuôi cấy trên môi trường thạch MPA và nấm men trên môi trường Hansen [3].
2.2.2. Nhân giống xạ khuẩn
Chọn các khuẩn lạc đơn trong các ống giống thạch nghiêng hoạt hoá bằng cách cấy truyền sang ống nghiệm chứa môi trường thạch nghiêng và đĩa Petri ISP2, nuôi 4-5 ngày ở 37oC. Tiếp theo cắt cục thạch (1,0 x 1,0 cm) chứa khuẩn lạc đơn vào bình tam giác 250 ml chứa 50 ml môi trường ISP2, nuôi
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn trên máy lắc tốc độ 220 vòng/phút ở 37oC trong 48 giờ. Mật độ giống của xạ khuẩn đạt trung bình là 5x108
CFU/ml
2.2.3. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của xạ khuẩn
Để quan sát các đặc điểm hình thái như: hình dáng khuẩn lạc, màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất, sắc tố tan, sự hình thành melanin, cuống sinh bào tử, bề mặt bào tử... các chủng xạ khuẩn được nuôi cấy trên các môi trường Gauze 1, ISP1, ISP2, ISP3, ISP4, ISP5, ISP6, ISP7 ở nhiệt độ 28- 30oC. Sau 7, 14 và 21 ngày lấy ra quan sát màu sắc khuẩn ty khí sinh, khuẩn ty cơ chất và sắc tố tan trên môi trường theo phương pháp của Shirling và Gottlieb và so sánh với bảng màu của Tresner và Barkus [36], [42].
2.2.3.1. Đặc điểm hình thái
- Màu sắc khuẩn lạc (khuẩn ty khí sinh): màu sắc của khuẩn ty khí sinh được so với 7 nhóm màu của Tresner và Backus : xanh da trời, sẫm, xám, xanh lá, đỏ, tím, trắng, vàng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Màu sắc của khuẩn ty cơ chất: chia vào 5 nhóm vàng-nâu (gồm cả các loại không tiết sắc tố); xanh da trời, xanh lá, đỏ-da cam, tím.
- Khả năng sinh sắc tố tan: khả năng sinh sắc tố tan được xác định trên môi trường ISP2-5. Sắc tố tan được xếp vào 5 nhóm giống màu của khuẩn ty khí sinh và khuẩn ty cơ chất: vàng nâu, xanh da trời, xanh lá, đỏ- da cam, tím.
- Sự hình thành sắc tố melanin: để kiểm tra khả năng hình thành melanin, nuôi cấy xạ khuẩn trên môi trường ISP1, ISP6 và ISP7 ở nhiệt độ thích hợp. Quan sát trong 14 ngày, nếu chủng sinh ra melanin thì màu của môi trường sẽ chuyển từ vàng nhạt sang nâu, đen [42]
2.2.3.2. Đặc điểm cuống sinh bào tử và bề mặt bào tử
Xạ khuẩn được nuôi cấy trên môi trường ISP2 ở 37o
C. Sau 7, 14 và 21 ngày nuôi ở nhiệt độ 28 - 30oC xạ khuẩn được quan sát hình dạng chuỗi bào tử dưới kính hiển vi quang học và kính hiển vi quét [14].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn - Hình dạng chuỗi bào tử được ký hiệu:
- RF: thẳng hay hơi lượn sóng;
- RA: hình móc câu hay xoắn không hoàn toàn; - S: dạng xoắn lò xo hay xoắn hoàn toàn; - SRF: dạng xoắn lượn sóng;
- RFS: thẳng và xoắn ở đầu; - SRA: dạng xoắn có móc câu.
- Bề mặt bào tử: Bề mặt của khuẩn ty khí sinh có bào tử được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi quét (độ phóng đại 10.000 lần) để xác định đặc điểm bề mặt bào tử.
+ Bào tử hình tròn, ovan, hình trụ.
+ Bề mặt bào tử được ký hiệu: Trơn nhẵn: sm; Gai: sp; Xù xì: wa; Tóc: ha
2.2.4. Nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Đặc điểm sinh lý - sinh hóa của chủng được mô tả dựa vào khả năng đồng hóa các nguồn cacbon, khả năng ức chế các VSV và sự sinh trưởng của xạ khuẩn ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau (về pH, nhiệt độ, nồng độ NaCl).
2.2.4.1. Khả năng sử dụng nguồn carbon
Quan sát khả năng đồng hoá nguồn cacbon của các chủng xạ khuẩn trên môi trường ISP9 có bổ sung 1% các nguồn đường glucose, arabinose, raffinose, fructose, rhamnose, saccarose, xylose, myo-inositol và manitol. Các ống thạch đã cấy xạ khuẩn được ủ 5 - 7 ngày ở nhiệt độ 28oC, so sánh với đối chứng dương là môi trường ISP9 bổ sung glucose, còn đối chứng âm là môi trường ISP9 cơ sở (môi trường khoáng).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.4.2. Khả năng sinh enzyme ngoại bào
Chủng xạ khuẩn được nuôi trên môi trường ISP2 có bổ sung 0,2% (w/v) một trong các nguồn cơ chất sau:
- Tinh bột tan (xác định hoạt tính amylase) - Cazein (xác định hoạt tính protease) - CMC (xác định hoạt tính endoglucanase).
Sau 2-3 ngày xác định hoạt tính enzyme bằng đường kính vòng phân giải thể hiện bằng giá trị D - d (mm); trong đó D là đường kính vòng kháng khuẩn và d là đường kính thỏi thạch. Sau khi nhuộm màu đỏ Công gô (cơ chất CMC), axit tricloaxetic (cơ chất casein) và thuốc thử Lugol (cơ chất tinh bột). Vùng cơ chất là vùng bị phân giải không bắt màu ở xung quanh lỗ thạch (đối với cơ chất CMC và tinh bột) và vùng không màu xung quanh lỗ thạch (đối với cơ chất là casein).
2.2.4.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh trưởng của xạ khuẩn
- Ảnh hưởng của nhiệt độ: Các chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus được nuôi cấy trên môi trường ISP2 rắn ở 10, 15, 22, 28, 30, 35, 37, 40, 45, 55, 60oC; quan sát sự sinh trưởng của xạ khuẩn sau 7 ngày và 14 ngày.
- Ảnh hưởng của pH: Xạ khuẩn S. hygroscopicus được nuôi cấy trên