Khả năng đồng hóa nguồn carbon
Kết quả kiểm tra khả năng đồng hoá các nguồn đường của chủng S. hygroscopicus 11405 được trình bày trong bảng 3.4. Nhìn chung, chủng S. hygroscopicus 11405 có khả năng sử dụng tốt hầu hết các nguồn đường thông dụng như Glucose, mantose, D-xylose, manitol, fructose và L-rhamnose phát triển kém hơn khi sử dụng các đường: D-sorbitor, raffinose, inositol.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.4. Khả năng đồng hoá nguồn carbon của chủng S. hygroscopicus
11405
Ghi chú: -: Sinh trưởng kém hơn hay bằng đối chứng âm
±: Sinh trưởng kém hơn đối chứng dương nhưng mạnh hơn đối chứng âm
+: Sinh trưởng bằng hoặc mạnh hơn đối chứng dương.
Khả năng chịu muối, nhiệt độ và pH
Chủng S. hygroscopicus 11405 có thể chịu muối đến nồng độ 6% và sinh trưởng được trong dải nhiệt độ và pH rộng (15 – 45o
C, pH 3 – 13) (Bảng 3.5) Nguồn đƣờng Khả năng đồng hoá Nguồn đƣờng Khả năng đồng hoá Glucose (Đối chứng dương) + D-Arabinose + Maltose + Inositol ± Lactose + D-Xylose + Fructose + Xellobiose + D-Sorbitol ± L-Rhamnose + Raffinose ± Trehalose + Mannose + Không có đường (Đối chứng âm) -
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.5. Khả năng chịu muối, chịu nhiệt độ và khoảng pH thích hợp cho sinh trưởng của xạ khuẩn
Đặc điểm Khả năng sinh trưởng của chủng S.
hygroscopicus 11405 Nhiệt độ (o
C) 15 - 45
Nồng độ muối (%) 0 - 6
pH ban đầu 3 - 13
3.3. Nghiên cứu thành phần môi trƣờng và điều kiện lên men của
chủng S. hygroscopicus 11405
3.3.1 Lựa chọn môi trƣờng lên men
Việc lựa chọn môi trường lên men có ý nghĩa rất quan trọng trong công nghệ sản xuất và tinh chế kháng sinh. Môi trường thích hợp là môi trường giúp chủng vừa có khả năng sinh trưởng tốt vừa sinh ra các sản phẩm mong muốn với hiệu suất tối ưu và có giá thành rẻ.
Hình 3.9. Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh tổng hợp val-A
Chủng S. hygroscopicus 11405 sinh trưởng và sinh tổng hợp val-A kém
trên các môi trường FM1, FM2, FM5 và FM6. Chủng 11405 sinh trưởng tốt
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn 6,6 mg/ml). Tuy nhiên hoạt tính kháng sinh thu được cao nhất trên môi trường FM3 (môi trường có chứa bột ngô và bột đậu tương) đạt 6,2 mg val-A/ml (Hình 3.9). Do vậy, môi trường FM3 được lựa chọn làm môi trường lên men chính cho sinh tổng hợp val-A của chủng S. hygroscopicus 11405 trong các nghiên cứu tiếp theo.
3.3.2. Ảnh hƣởng của thời gian lên men đến khả năng sinh validamycin A của chủng S. hygroscopicus 11405
Kéo dài thời gian lên men không đồng nghĩa với tăng hoạt tính kháng sinh (HTKS), mà ngược lại, có thể dẫn đến hình thành các chất độc, gây ức chế quá trình sinh tổng hợp kháng sinh. Lựa chọn thời gian lên men thích hợp không những có thể rút ngắn thời gian lên men, giảm chi phí sản xuất mà còn
giúp thu hồ ất. Chủng S. hygroscopicus 11405
sinh trưởng cực đại sau 84 giờ lên men (đạt 7,4 mg sinh khối khô/ml) và sinh tổng hợp val-A cao nhất sau khi sinh trưởng đạt cực đại 12 giờ, đạt 8,4 mg/ml. Sau thời gian này, nếu kéo dài thời gian lên men, hoạt tính val-A giảm dần (Hình 3.10). Ở thời điểm 144 giờ, hoạt tính kháng sinh giảm 34,5%. Như vậy, thời điểm thích hợp nhất để thu hồi kháng sinh là sau 96 giờ lên men. Đây cũng là thời điểm được nhiều tác giả lựa chọn khi lên men sinh tổng hợp val- A [24], [33].
Hình 3.10. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến sinh trưởng và sinh tổng hợp val-A (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.3.3. Lựa chọn tỷ lệ tiếp giống cho lên men sinh tổng hợp validamycin A
Các tỷ lệ giống khác nhau 5, 7, 10 và 15% (v/v) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy thích hợp với các điều kiện công nghệ khác được giữ như trên. Kiểm tra HTKS sau 96 giờ lên men cho thấy hoạt tính val-A đạt được cao nhất 9,4 mg/ml với tỷ lệ tiếp giống là 10%. Với các mật độ giống bổ sung là là 3, 5, 7 và 15% (v/v), chủng S. hygroscopicus 11405 sinh trưởng và sinh tổng hợp kháng sinh giảm (Hình 3.11).
Hình 3.11. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống đến khả năng sinh val-A Đặc biệt với tỷ lệ giống tiếp 3%, HTKS giảm 45,7% so với 10%. Như vậy, tỷ lệ giống tiếp thích hợp nhất là 10% đảm bảo cung cấp đủ lượng giống cần thiết, với hoạt lực sinh tổng hợp val-A cao. Khi có quá nhiều giống được cấp vào môi trường lên men sẽ không đủ dinh dưỡng cho xạ khuẩn sinh trưởng và sinh tổng hợp kháng sinh ở mức cao. Nếu tỷ lệ tiếp giống thấp, lượng sinh khối thấp sẽ làm giảm lượng val-A sinh ra.
3.3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh tổng hợp validamycin A
Để xác định nhiệt độ tối thích cho lên men sinh tổng hợp val-A, tiến hành kiểm tra nhiệt độ trong dải từ 25o
C – 42oC với các điều kiện công nghệ khác được giữ nguyên. Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ thích hợp cho chủng S. hygroscopicus 11405 phát triển không đồng thời là nhiệt độ tối thích
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn cho lên men sinh tổng hợp val-A. Nhiệt độ phát triển thích hợp nhất của xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405 là 30oC. Tuy nhiên, nhiệt độ tối thích cho quá trình sinh tổng hợp val-A là ở 37oC (đạt 10,8 mg/ml) (Hình 3.12). Ở các nhiệt độ 25 và 42oC, lượng val-A sinh tổng hợp thấp hơn. Đặc biệt, ở nhiệt độ 25o
C hoạt tính val-A chỉ đạt 71,3% so với nhiệt độ tối ưu. Kết quả nghiên cứu này cũng được chỉ ra trong nghiên cứu của Liao đối với chủng S. hygroscopicus
subsp jinggangensis 5008 [33]. Do vậy, nhiệt độ 37oC được chọn sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh trưởng và sinh tổng hợp val-A
3.3.5. Ảnh hƣởng của pH ban đầu đến khả năng sinh tổng hợp validamycin A
pH ban đầu của môi trường là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng và sinh kháng sinh trong quá trình lên men chìm. Hàm lượng ion H+
hay OH- có thể tác động trực tiếp vào tế bào hay tác động gián tiếp bằng cách thay đổi mức độ phân ly của các chất trong môi trường [28]. pH thích hợp cho quá trình phát triển không phải lúc nào cũng đồng thời là pH tối thích cho sinh tổng hợp kháng sinh val-A của chủng nghiên cứu. Chủng S. hygroscopicus 11405 sinh trưởng tốt nhất tại pH 7,0 nhưng lại sinh tổng hợp kháng sinh cao nhất ở pH 6,0 (12,6 mg/ml) (Hình 3.13). Theo một
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn số tác giả, thông thường các chủng xạ khuẩn đều sinh tổng hợp val-A tối ưu trên môi trường có pH từ trung tính đến hơi kiềm. Các kết quả công bố cho thấy chủng S. hygroscopicus var. limoneus T-7545 và chủng S. hygroscopicus
subsp. jinggangensis 5008 lần lượt sinh tổng hợp val-A tối ưu ở pH 7,0 và 7,8 [27], [44].
Hình 3.13. Ảnh hưởng pH môi trường đến khả năng sinh tổng hợp val-A Như vậy, trên môi trường FM3 với điều kiện lên men thích hợp (nhiệt độ 37oC, pH ban đầu 6,0, tỷ lệ tiếp giống 10%) sau 96 giờ lên men hoạt tính val- A của S. hygroscopicus 11405tăng lên 2 lần so với ban đầu (từ 6,2 mg/ml lên 12,6 mg/ml).
3.4. Đặc điểm của dịch validamycin A thô
3.4.1. Khả năng kháng vi sinh vật gây bệnh
Ngoài nấm R. solani ra, chủng S. hygroscopicus 11405 còn có khả năng ức chế cả vi khuẩn Gram (+) và Gram (-) cũng như nấm men C. Albicans
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.6. Phổ kháng VSV của chủng S. hygroscopicus 11405
Chủng VSV kiểm định Đƣờng kính vòng vô khuẩn (mm)
B. subtilis ATCC 6633 10
B. cereus ATCC 21778 15
E. coli ATCC15224 11
Sarcina lutea M5 -
Enterococcus faecalis76 12
Salmonella typhi IFO14193 -
Pseudomonas aeruginosa - (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Candida albicans 15
Ghi chú: (-) là các vi sinh vật không bị ức chế phát triển bởi dịch val-A thô.
3.4.2. Độ bền nhiệt và bền pH của dịch validamycin A thô
Kháng sinh rất nhạy cảm với sự thay đổi của nhiệt độ và pH. Trong điều kiện nhiệt độ và pH không phù hợp, hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh bị suy giảm mạnh. Khả năng bền nhiệt và bền pH sẽ ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và bảo quản về sau [2]. Dịch sau lên men có pH 7,8, được điều chỉnh về các pH 3, 7, 10 và xác định hoạt tính val-A ban đầu (DVVK, mm). Dịch sau lên men có DVVK = 20,4 mm, ở pH 3, 7 và 10 có DVVK tương ứng là 15,3 mm, 18,4 mm và 16,3 mm. Val-A trong dịch lên men không bền nhiệt và chịu ảnh hưởng rất lớn bởi giá trị pH. Ở tất cả các pH, HTKS đều giảm dần khi nhiệt độ tăng. Ở pH 7,0, HTKS trong dịch lên men bền nhất và khả năng chịu nhiệt cao nhất. Tuy nhiên, khi giữ ở 80ºC trong 40 phút, dịch
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn val-A thô vẫn giữ được 62,5% hoạt tính so với dịch val-A thô ban đầu. Val-A trong dịch lên men không bền trong môi trường axít, hoạt tính bị mất hoàn toàn sau 40 phút ở 80ºC. Như vậy, trong quá trình tách chiết hay cô đặc dịch val-A thô sau này nên sử dụng pH 7,0 và nhiệt độ tối đa của quá trình là 80C ( Hình 3.14)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
I. Kết Luận
1. Trong số hai chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên cứu là S. hygroscopicus 11405 và S. hygroscopicus CNLM, đã lựa chọn được chủng S. hygroscopicus 11405 cho các nghiên cứu tiếp theo.
2. Chủng S. hygroscopicus 11405 thuộc nhóm xám, không có khả năng sinh melanin hay sắc tố tan trên các môi trường nuôi cấy, chuỗi bào tử dạng xoắn lò xo, bề mặt bào tử xù xì; có khả năng đồng hóa hầu hết các nguồn carbon thông dụng, chịu mặn đến nồng độ muối 6% (w/v) và có thể sinh trưởng trong dải nhiệt độ 15o
C – 45oC và dải pH 3,0 – pH 13,0.
3. Đã lựa chọn được điều kiện lên men thích hợp sinh tổng hợp val-A của chủng S. hygroscopicus 11405: môi trường FM3, tỷ lệ tiếp giống 10% (v/v), nhiệt độ lên men 37C, pH ban đầu 6,0. Trong điều kiện lên men đã lựa chọn, khả năng sinh val-A cao nhất của chủng S. hygroscopicus 11405 đạt 12,6 mg/ml sau 96 giờ lên men
4. Dịch val-A thô sinh tổng hợp bởi chủng S. hygroscopicus 11405 có khả năng ức chế một số vi khuẩn kiểm định Gram (+) như B. subtilis ATCC 6633,
B. cereus ATCC 21778, Gram (-) như E. coli ATCC15224, E. faecallis 76, và nấm men C. albicans. Dịch val-A thô giữ được hoạt tính kháng nấm R. solani
trên 60%sau 40 phút ủ ở nhiệt độ 80oC trong khoảng pH 7-10.
II. Kiến nghị
Tiếp tục nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men sinh tổng hợp val-A như nguồn carbon, nguồn nitơ, độ thông khí... và lên men thử nghiệm trong bình lên men có quy mô pilot.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CÓ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN VĂN
1. Nguyễn Thị Hồng Liên, Phan Thị Hồng Thảo, Nguyễn Thị Huyền, Nguyễn Phương Nhuệ, Lê Gia Hy, Hồ Tuyên, Phí Quyết Tiến (2013) “Nghiên cứu điều kiện lên men sinh tổng hợp validamycin A từ chủng
Streptomyces hygroscopicus var. limoneus 11405”, Hội nghị Công nghệ sinh học Toàn quốc2013
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
TÀI LIỆU THAM KHẢO
I. Tài liệu tham khảo tiếng Việt
1. Ngô Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp, Viện sinh thái và tài nguyên sinh vật, Trung tâm khoa học Tự nhiên và công nghệ Quốc gia, Hà Nội.
2. Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men các chất kháng sinh, Nxb khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
3. (1978),
, .
4. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2007), Vi sinh
vật học, Nxb Giáo dục, Hà Nội. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
5. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến (1977), Vi sinh
vật học, tập 2, Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội.
6. Nguyễn Thành Đạt (2000), Sinh học vi sinh vật, Nxb Giáo dục, Hà Nội. 7. Egorov NX (1976), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Mir, Maxcova và Đại học THCN, Hà Nội (người dịch Nguyễn Lân Dũng).
8. Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật ở Việt Nam, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội.
9. Đỗ Thu Hà (2004), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm phân lập từ đất Quảng Nam-Đà Nẵng, Luận án tiến sĩ sinh học, Hà Nội.
10. Nguyễn Như Hiền (2006), Giáo trình Sinh học tế bào, Nxb Giáo Dục, Hà Nội
11. Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn và thối cổ rễ phân lập ở Việt Nam, Luận án phó tiến sĩ sinh học, Hà Nội.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn 12. Nguyễn Phương Nhuệ (2010), Nghiên cứu quy trình lên men sản xuất kháng sinh vancomycin từ xạ khuẩn Streptomyces orientalis 4912, Luận án tiến sĩ Sinh học, viện CNSH, Hà Nội.
13. Lương Đức Phẩm (1998), Công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội.
14. Cao Xuân Thu (2000) Kháng Sinh và vitamin. Bộ môn Công nghiệp dược, Trường đại học Dược Hà Nội
15. II. Tài liệu thao khảo tiếng Anh
16. Bergey’s Mannual of Systematic bacteriology (1989), Williams & Wikins Baltimoe, Vol 4.
17. Bernan V. S., Greenstein M., Maiese W. M. (1997), “Marine microorganisms as a source of new natural products”, Advances in Applied Microbiology 43, pp. 57-90.
18. Chen L. L., Lu Y. X., (2003), “Screening of high yielding jinggangmycin strain by microwave mutation”, Biotechnology journal, pp. 05.
19. Demain, A. L. (1974), “How do antibiotic-producing microorganisms avoid suicide”, Annuals of the NewYork academy of Sciences 235, pp. 601- 612.
20. Furumai T. K., Saitoh, Kakushima M., Yamamuto S., Suzuki K., Ikeda S., Kobara S., Hatori H., Oki T. (1993), “A new pradimixin deverative”, Journal Antibiotic, 46 (2), pp. 265-274.
21. Guo W. C., Zhong S. H., Huang Y. J. (2006), “Optimization of production processes of agricultural antibiotics jinggangmeisu”, Fine Chemical Intermediates, pp. 02.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn 22. Haifeng Q., Baolan H., Zhiye W., Xi X., Tao H. (2007), “Effects of validamycin on some enzymatic activities in soil”, Environ Monit Assess 125, pp. 1–8.
23. Hopwood D. A., Merrick M. J. (1977), “Genetics of antibiotic production”, Bacteriol Rev 41, pp. 596-636.
24. Hu B., Cao D., Chen W., Yingchong., Xu X. (2007), “Bio-safety assessment of validamycin formulation on bacterial and fungal biomass in soil monitored by real-Time PCR”, Bulletin of Environmental Contam Toxicol 78, pp. 239–244.
25. Isoken N., Henrietta O. (2010), “Assessment of antibiotic production by some marine Streptomyces isolated from the Nahoon beach”, Department of biochemistry and microbiology faculty of science and agriculture, University of for Hare, Alice, South Africa.
26. Iwasa T., Higashide E., Yamamoto H., Shibata M. (1971). “Studies on validamycins, new antibiotics. II. Production and biological properties of validamycins A and B”, The journal of antibiot 24, pp. 107–113.
27. Iwasa T., Higashide E., Shibata M. (1971), “Studies on validamycins, new antibiotics. III. Bioassay methods for the determination of validamycin”, The journal of antibiot 24, pp. 114-118.
28. Iwasa T., Kameda Y., Asai M., Horii S., Mizuno K. (1970), “Studies on validamycins. IV Isolation and characterizatin of validamycin A and B”,
The journal of antibiotic 2, pp. 119-123.
29. Jain P., Pundir R. K. (2011) “Effect of fermentation medium, pH and temperature variation on antibacterial soil fungal metabolite production”.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
30. Kalakoutskiip L. V., Nina S., Agrey (1976), “Comparative aspects of development and differentiation in actinomycetes”, Bacteriological Reviews, pp. 469-524.