Cũng như đa số các vi sinh vật khác, trong môi trường dịch thể quá trình sinh trưởng phát triển của xạ khuẩn chia làm 4 pha:
- Pha lag: sinh khối tăng không đáng kể.
- Pha log: lượng sinh khối tăng theo hàm log, ở cuối pha này có sự tổng hợp nên các sản phẩm bậc hai như chất kháng sinh.
- Pha cân bằng: ở pha này sinh khối không tăng, hầu hết các chất dinh dưỡng còn lại trong môi trường đều được sử dụng để tổng hợp kháng sinh.
- Pha suy tàn: sinh khối giảm nhanh, lượng chất kháng sinh cũng giảm. Chất kháng sinh là sản phẩm trao đổi chất bậc hai, thông thường được hình thành ở cuối pha sinh trưởng (pha log), trong pha cân bằng. Ở xạ khuẩn,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn sinh tổng hợp chất kháng sinh có quan hệ nghịch với sự hình thành bào tử. Đây là điểm cần lưu ý trong khi nghiên cứu sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn [11], [12].
1.2.3. Một số đặc trƣng cơ bản của xạ khuẩn có khả năng sinh validamycin A
Cho đến thời điểm hiện nay đã có rất nhiều xạ khuẩn thuộc các chi khác nhau có khả năng sinh kháng sinh cao đã tìm thấy như Streptomyces, Micromonospora…nhưng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh kháng sinh phổ biến nhất…Trong khoảng hai thập kỉ qua, số lượng các hợp chất kháng VSV được công bố từ xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces mỗi năm tăng lên gần như theo cấp số nhân...Cho đến nay, những kết quả công bố của các nhà khoa học cho thấy đã tìm ra khoảng 4000 chất kháng sinh từ vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm; rất nhiều những kháng sinh được ứng dụng trong y học nhưng phần lớn trong số đó được sinh tổng hợp bởi Streptomyces, điển hình như: aminoglycoside, anthracycline, glycopeptit, β-lactam, macrolid, nucleoside, peptide, polyen, polyether và tetracyclin.
Theo các nghiên cứu công bố, xạ khuẩn có khả năng sinh val-A chủ yếu ở hai loài chính là S. hygroscopicus var. limoneus và S. hygroscopicus
subsp. jinggangensis. Các chủng S.hygroscopicus có một số đặc trưng về đặc điểm sinh học như sau:
+ Đặc điểm hình thái: S. hygroscopicus có KTKS phân nhánh và mỗi nhánh thường cuộn xoắn từ 3-5 vòng. Các bào tử có dạng hình ovan hoặc hình trụ, kích thước 1,0-1,3x1-1,5 µm. Bề mặt khuẩn lạc nhẵn.
+ Đặc điểm nuôi cấy: KTKS có màu từ xám đến vàng xám, sợi nấm có màu đen trên một số môi trường như môi trường có bổ sung asparagine và môi trường thạch chứa tinh bột. Màu của khuẩn ty cơ chất là vàng tươi đến vàng đất, trong một số trường hợp là màu xanh rêu; có khả năng sinh sắc tố
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn tan kém trên một số môi trường. Tuy nhiên sắc tố tan màu nâu sẫm trên môi trường có chứa protein nên không quan sát được.[24,39]
+ Đặc điểm sinh lý sinh hóa: Chủng S. hygroscopicus var. limoneus có khả năng sinh trưởng trong phổ nhiệt rộng 25-45oC. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của chủng này cũng khá cao 25-37oC. Chủng có khả năng đồng hóa tốt hầu hết các nguồn đường như D-xylose, L-arabinose, manose [24].
1.3. Các yếu tố ảnh hƣởng tới khả năng lên men sinh validamycin A của xạ khuẩn
Các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh val-A cũng khá tương đồng với các yếu tố ảnh hưởng tới khả năng sinh kháng sinh khác của xạ khuẩn nói chung.
1.3.1. Ảnh hƣởng của thành phần môi trƣờng lên men
Quá trình sinh tổng hợp kháng sinh từ xạ khuẩn phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố như pH, nhiệt độ…và thành phần của môi trường lên men. Để đảm bảo cho xạ khuẩn có thể phát triển tốt cần đảm bảo trong môi trường có đầy đủ nguồn cacbon, nguồn nitơ và các nguyên tố vi lượng. Mỗi một chủng xạ khuẩn khác nhau cần một nguồn cơ chất khác nhau, tuy nhiên tỉ lệ C/N đóng vai trò quyết định đến sự tổng hợp kháng sinh [28].
1.3.1.1. Nguồn cacbon
Nguồn cacbon là nguyên liệu không thể thiếu đối với đời sống VSV, ảnh hưởng tới sinh tổng hợp chất kháng sinh do nguồn cacbon tham gia vào cấu tạo tế bào và tham gia vào quá trình hình thành lên cấu trúc của sản phẩm.
Nguồn cacbon thường sử dụng là các nguồn đường đơn như glucose, fructose…, các loại đường đôi như maltose, lactose, saccharose…, ngoài ra có thể sử dụng tinh bột, rỉ đường. Trong đó nguồn đường glucose là nguồn cacbon dễ sử dụng nhất, tuy nhiên nếu sử dụng nhiều nguồn đường này thì hiệu suất của quá trình lên men sẽ giảm đi. Nguyên nhân là do glucose làm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn tăng lượng axit hữu cơ trong môi trường, đồng thời làm tăng các chất hữu cơ và axit nucleic trong khuẩn ty dẫn đến thay đổi hoạt tính các enzyme phân giải glucose…Tuy nhiên, có thể khắc phục được hiện tượng này bằng cách chia nhỏ tổng lượng glucose và bổ sung định kì vào môi trường lên men để không xảy ra sự tích luỹ các chất ức chế trung gian[8], [11].
1.3.1.2. Nguồn nitơ
Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn đòi hỏi cung cấp đầy đủ nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ. Trong đó nguồn nitơ vô cơ cho khả năng sinh chất kháng sinh không cao, còn nguồn nitơ hữu cơ lại có tác động khá tốt đến khả năng này do cung cấp các nguồn acid amin quan trọng, dễ dàng đi vào chu trình tổng hợp để tạo thành sản phẩm. Nguồn nitơ hữu cơ thích hợp thường sử dụng là cao nấm men, cao thịt, pepton, bột đậu tương…, còn nguồn nitơ vô cơ thường sử dụng là các muối amon, muối nitrat như (NH4)2SO4, NaNO3, KNO3 [12], [28].
1.3.1.3. Khoáng chất và vi lượng
VSV nói chung và xạ khuẩn nói riêng rất cần chất khoáng trong quá trình trao đổi chất của chúng. Một lượng nhỏ các nguyên tố vi lượng cũng có ảnh hưởng nhất định đến sự hình thành CKS của xạ khuẩn. Sự có mặt của một số muối khoáng như Na+
, Fe3+, Al3+, Bo2+, K+, Cr+, Cu2+, Mn2+, Zn2+...trong môi trường lên men sẽ tác dụng khác nhau đến khả năng sinh kháng sinh của VSV. Sự có mặt của nguyên tố này sẽ làm giảm tác dụng kìm hãm hoặc làm tăng tác dụng kích thích của nguyên tố kia. Một số muối khoáng như Ca2+
, Cu2+…được cho là có ảnh hưởng tới khả sinh ra một vài loại kháng sinh trong đó có val-A. Các khoáng chất này có tác động lên hoạt động của các enzyme trong quá trình sinh tổng hợp kháng sinh [11], [12].
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
1.3.1.4. Nguồn photpho
Nguồn photpho vô cơ là yếu tố điều chỉnh quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn. Nồng độ photphat thích hợp cho sinh tổng hợp phần lớn chất kháng sinh không quá 10 µg/ml [9]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nồng độ photphat ban đầu cao sẽ làm tăng lượng acid nucleic trong khuẩn ty xạ khuẩn, làm kéo dài pha sinh trưởng, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến làm giảm hoặc ngừng sinh tổng hợp chất kháng sinh [8], [9].
1.3.2. Ảnh hƣởng của điều kiện lên men
Điều kiện lên men như nhiệt độ, pH, độ thông khí, hàm lượng oxy hòa tan trong môi trường…cũng là yếu tố ảnh hưởng rất lớn tới khả năng sinh kháng sinh của xạ khuẩn [8].
1.3.2.1. Nhiệt độ
Phần lớn xạ khuẩn sinh trưởng tốt trong dải nhiệt độ từ 28-30oC. Mỗi loại xạ khuẩn có một khoảng nhiệt độ thích hợp nhất cho quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh. Có chủng sinh kháng sinh cao ở nhiệt độ 18oC, có chủng lại sinh kháng sinh tốt ở 28o
C [9].
1.3.2.2. pH
pH thích hợp cho quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh thường là trung tính. Đối với các chủng Streptomyces sp. thì pH thích hợp là 6,5 -8,0. Môi trường kiềm hay axit đều ảnh hưởng đến quá trình này, tuy nhiên, pH cho phép sinh trưởng thường lớn hơn so với pH tối ưu cho sự tổng hợp chất kháng sinh [8], [9].
1.3.2.3. Độ thông khí
Là yếu tố ảnh hưởng tới sự sinh trưởng và sinh kháng sinh của xạ khuẩn. Nếu độ thông khí bị hạn chế sẽ ức chế quá trình sinh trưởng và khả
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn năng tích lũy chất dinh dưỡng, làm thay đổi hình thái của khuẩn ty và giảm khả năng sinh tổng hợp kháng sinh [8], [9].
1.3.2.4. Giống và tỉ lệ tiếp giống
Sinh tổng hợp kháng sinh phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của bào tử và tuổi giống, khả năng đồng đều về mặt di truyền. Môi trường nhân giống và lượng giống bổ sung cũng ảnh hưởng không nhỏ đến lượng kháng sinh được tổng hợp ra. Môi trường nhân giống giàu chất dinh dưỡng hơn môi trường lên men sẽ cho hiệu suất sinh tổng hợp chất kháng sinh cao. Thông thường, lượng giống cấy truyền vào môi trường lên men để hiệu quả nhất là từ 2-10% (v/v), tuổi giống thường là 24 giờ [3].
1.4. Tình hình nghiên cứu sinh tổng hợp validamycin A trong và ngoài nƣớc ngoài nƣớc
1.4.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Năm 1966, một kháng sinh mới đã được chiết từ dịch lọc của S. hygroscopicus var. limoneus, chủng xạ khuẩn được phân lập từ đất ở Nhật Bản. Nó có hiệu quả để trừ bệnh khô vằn ở cây lúa và có tên gọi là validamycin. Năm 1972, một kháng sinh có hoạt tính tương tự như validamycin của Nhật Bản, được thu từ dịch lên men của S. hygroscopicus
subsp. yingchengensis được phân lập từ ruộng lúa ở ĐH Nông nghiệp Huazhong, Yingcheng, tỉnh Hồ Bắc, Trung Quốc nhưng hoạt tính kháng sinh thấp. S. hygroscopicus subsp. jinggangensis Yen được Viện Nghiên cứu thuốc trừ sâu Thượng Hải phân lập từ đất ở núi Jinggang, tỉnh Jiangxi năm 1973, đây là loài có khả năng sinh tổng hợp validamycin cao. Sau đó được đột biến bằng UV, hóa chất N- metyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) và do đó, tạo các biến chủng S. hygroscopicus subsp. jinggangensis Yen sinh lượng lớn validamycin. Hiện nay, chủng S. hygroscopicus subsp. jinggangensis Yen là chủng sinh validamycin chủ yếu ở Trung Quốc, hoạt tính tăng từ 10.000 lên
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn 30.000 mg/L. Năm 2006, nhóm gen sinh tổng hợp validamycin được tách dòng thành công đã tạo ra một validamycin thế hệ mới. Đây là sản phẩm hợp tác giữa Đại học Jiaotong Thượng Hải, Đại học Bang Oregon và Đại học Washington, có vai trò quan trọng nhằm giảm chi phí sản xuất, tăng khả năng sản xuất và hoạt tính kháng sinh, sàng lọc các chủng có hoạt tính cao và sản xuất ra các loại dẫn xuất validamycin mới [20], [21].
Trong suốt thập kỷ 70 và 80, nhiều nhà máy sản xuất validamycin ra đời nhưng còn ở quy mô nhỏ, chỉ đáp ứng cho nhu cầu của địa phương. Tuy nhiên, thời gian đó mỗi năm có 5 triệu tấn lúa được bảo vệ nhờ vào việc sử dụng validamycin. Trải qua hơn 30 năm, quy mô sản xuất validamycin đã tăng mạnh và 90% bệnh khô vằn ở cây lúa đã được kiểm soát. Validamycin được sử dụng rộng rãi trên 12.5 triệu ha trồng cây nông nghiệp ở Trung Quốc. Sản lượng validamycin xuất khẩu của Trung Quốc ổn định, khoảng 40000 tấn, lớn nhất thế giới và một số sản phẩm đã được xuất khẩu đến Nhật Bản, Hàn Quốc, Thái Lan và Singapore [22], [23]. Trong các dòng validamycin thì val-A được nghiên cứu và sử dụng nhiều nhất.
Validamycin A có thể được sử dụng mà không gây ảnh hưởng đến cây trồng và có độc tính rất thấp đối với động vật có vú, hầu như không gây độc đối với chim, cá và côn trùng, sử dụng với liều lượng thấp và hiệu quả kéo dài. Hiện nay, val-A vẫn được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp ở Trung Quốc và các nước châu Á khác [25].
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nƣớc
Ở Việt Nam, sự phát triển của nền nông nghiệp nước ta đang đi vào mức độ thâm canh cao, khai thác đất theo chiều sâu với việc sử dụng các kỹ thuật trồng trọt tiên tiến, giống mới có năng suất cao, sử dụng nhiều phân bón hóa học, thuốc bảo vệ thực vật hóa học và hàng loạt các biện pháp như trồng lúa 3 vụ, phá rừng canh tác cà phê, hồ tiêu, điều… với mục đích khai thác, chạy theo năng suất và sản lượng của toàn xã hội. Chính vì vậy, với sự canh
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn tác trên đã làm cho đất đai ngày càng thoái hóa, dinh dưỡng bị mất cân đối, mất cân bằng hệ sinh thái trong đất, hệ VSV trong đất bị phá hủy, tồn dư các chất độc hại trong đất ngày càng cao, nguồn bệnh tích lũy trong đất càng nhiều dẫn đến phát sinh một số dịch hại không được dự báo trước.
Việt Nam nằm trong nhóm các nước sử dụng thuốc bảo vệ thực vật cao trên thế giới. Thuốc bảo vệ thực vật ở Việt Nam chủ yếu được tổng hợp từ hai nguồn gốc, nguồn gốc hóa học và nguồn gốc sinh học. Thuốc có nguồn gốc hóa học rất đa dạng và phân ra nhiều nhóm chẳng hạn như pyrethroid, carbamate, phospho hữu cơ, azole, alanine…Thuốc có nguồn gốc sinh học (tự nhiên) chủ yếu gồm nhóm thảo mộc và nhóm vi sinh. Ưu điểm của thuốc bảo vệ thực vật sinh học là ít ảnh hưởng đến thiên địch, an toàn đối với môi trường, đáp ứng yêu cầu xây dựng nền nông nghiệp xanh, sạch, bền vững. Phương hướng phát triển của nền nông nghiệp Việt Nam trong thời gian tới là xây dựng nên nền nông nghiệp sinh thái bền vững, đa canh, đa dạng hóa sản phẩm. Để thực hiện định hướng trên, vấn đề giống cây trồng và công tác bảo vệ thực vật đóng vai trò quan trọng. Quản lý dịch hại tổng hợp Integrated Pest Management (IPM) trên cây trồng nông, lâm nghiệp, trên cơ sở tăng cường sử dụng các tác nhân và chế phẩm sinh học là hướng nghiên cứu mang lại hiệu quả kinh tế, góp phần xây dựng nền nông nghiệp sinh thái bền vững.
Các chế phẩm sinh học ứng dụng cho cây trồng hiện nay cơ bản được chia làm 3 nhóm sản phẩm với các tính năng khác nhau:
- Nhóm chế phẩm sinh học ứng dụng cho việc phòng trừ sâu bệnh hại cây trồng.
- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho sản xuất phân bón hữu cơ sinh học, phân hữu cơ vi sinh, chất kích thích tăng trưởng bón cho cây trồng.
- Nhóm chế phẩm sinh học dùng cho cải tạo đất, xử lý phế thải nông nghiệp.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, trong danh mục các loại thuốc BVTV có nguồn gốc sinh học, từ năm 2000 chỉ có 2 sản phẩm trừ sâu sinh học được công nhận cho đăng ký. Đến năm 2005 đã có 57 sản phẩm các loại, đến 6 tháng đầu năm 2007 có 193 sản phẩm được cấp giấy phép đăng ký, nâng tổng số có 479 sản phẩm sinh học được phép lưu hành, trong đó có 300 loại thuốc trừ sâu và 98 sản phẩm thuốc trừ bệnh. Các sản phẩm này đã góp phần không nhỏ vào công tác phòng trừ dịch hại, góp phần thay thế và hạn chế dần nguy cơ độc hại do sử dụng thuốc BVTV nguồn gốc hóa học ảnh hưởng đến sức khỏe con người và gây ô nhiễm môi trường.
Một trong các loại thuốc sinh học phổ biến được sử dụng lâu đời tại Việt Nam để phòng trừ các loại nấm gây bệnh cho cây trồng là validamycin. Tại Việt Nam, nhà máy nông dược vi sinh chuyên sản xuất validamycin thuộc Công Ty liên doanh Viguato. Đây là Công ty liên doanh giữa Công ty cổ phần Thuốc sát trùng Việt Nam- Vipesco và Công ty Thuốc vi sinh Đồng Lô- Trung Quốc. Công ty liên doanh Viguato được xây dựng và hoạt động từ năm 1995, công suất ban đầu là 3.000 tấn hoạt chất validamycin/năm. Năng suất đã đạt được 5.000 tấn/năm 2007. Nhà máy có khả năng cung ứng đủ cho cả nước hoạt chất validamycin để sản xuất thương phẩm phòng trừ bệnh khô vằn hại lúa và một số cây trồng khác như khoai tây, gừng, rau…và mốc hồng trên cao su [51]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Chất kháng sinh sinh học sử dụng để phòng chống bệnh cho cây tỏ ra