2.2.6.1. Phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch
Theo phương pháp màng ngược của Iwasa môi trường A1 được để nguội tới 45o
C và thêm 2,5% (v/v) dịch huyền phù sợi nấm mốc R. solani
(được nhân giống trong môi trường Hansen trong 48 giờ, mật độ 109 CFU/ml). Sau khu pha trộn 5 mL môi trường được đổ vào đĩa Petri có đường kính 9 cm. Ủ đĩa này ở 27oC trong 48 giờ, tiếp đó phủ 15 ml môi trường thạch A2 lên trên bề mặt đĩa. Sau khi đông đặc tiến hành đục các lỗ thạch có đường kính 6,0 mm, nhỏ vào các lỗ dung dịch chất kháng sinh chuẩn và dịch kháng sinh thô. Đặt đĩa Petri trên ở 4- 5oC trong 4 giờ cho kháng sinh khuếch tán vào môi trường. Tiếp đó, ủ đĩa Petri ở 28oC trong 24 giờ và đo vòng ức chế hình thành trên đĩa Petri. HTKS được xác định dựa vào kích thước vòng vô khuẩn (D - d, mm), D là kích thước vòng vô khuẩn và d là đường kính thỏi thạch [26].
2.2.6.2. Phương pháp phân tích sắc ký lỏng cao áp (HPLC)
Dịch lên men được ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút. Dịch nổi được chiết với chloroform. Dịch chiết được chuyển trực tiếp lên cột Nucleosil C18 (250 x 4,6 mm, Sigma-Aldrich). Pha động (5 mM đệm sodium phosphate : acetone, 97:3) được bổ sung vào cột với tốc độ 1 ml/phút ở nhiệt độ phòng. Dịch ra được đo ở bước sóng 210 nm trên máy Waters 996 photodiode, số liệu được phân tích bằng Waters Millennium Chromatography Manager được
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn thực hiện tại Trung tâm kỹ thuật I, Tổng Cục tiêu chuẩn đo lường chất lượng, Bộ Khoa học và Công nghệ [43].
2.2.7. Lựa chọn môi trƣờng lên men thích hợp cho sinh tổng hợp validamycin A
Chủng xạ khuẩn được nuôi trên các môi trường FM1, FM2, FM3, FM4, FM5, FM6 là các môi trường đặc trưng cho lên men xạ khuẩn. Sau 72 giờ nuôi ở nhiệt độ 28-30°C, xác định hoạt tính kháng sinh và sinh khối. Trên môi trường nào xạ khuẩn sinh trưởng tốt, tích lũy nhiều sinh khối và chất kháng sinh cao nhất sẽ được lựa chọn làm môi trường lên men thích hợp.
2.2.8. Xác định điều kiện lên men sinh validamycin A của xạ khuẩn trong bình tam giác bình tam giác
Tiến hành lên men chủng xạ khuẩn trong bình tam giác dung tích 500 ml chứa 100 ml môi trường nuôi cấy trên máy lắc tốc độ 220 vòng/ phút, với thành phần môi trường lên men đã lựa chọn ở trên xác định. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh validamycin cần xác định nhiệt độ, pH, độ thông khí và tỷ lệ tiếp giống. Các yếu tố thay đổi như sau: nhiệt độ 25, 30, 37, 42°C; pH ban đầu 5, 6, 7, 8, 9 và 10; tỷ lệ tiếp giống vào môi trường theo tỷ lệ từ 3, 5, 7, 10, 15% (v/v).
2.2.9. Xác định ảnh hƣởng của thời gian lên men sinh tổng hợp validamycin A
Trên cơ sở các điều kiện lên men thích hợp và môi trường đã xác định được, nghiên cứu động thái quá trình lên men trong bình tam giác 500 ml. Trong 120 giờ lên men, cứ 12 giờ lấy mẫu 1 lần để kiểm tra, theo dõi sự biến động của sinh khối, và hoạt tính kháng sinh có trong dịch kháng sinh thô.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.2.10. Nghiên cứu đặc tính và độ bền của validamycin A
Dịch kháng sinh thô sau khi ly tâm được chỉnh pH về pH 3; 7 và 10, đun ở các nhiệt độ 40, 60, 80, 100oC trong thời gian 20- 80 phút. Sau đó dung dịch được làm nguội về nhiệt độ phòng để xác định hoạt tính kháng nấm.
2.2.11. Xác định khả năng kháng vi sinh vật kiểm định của dịch validamycin A thô validamycin A thô
Xạ khuẩn được cấy trên môi trường ISP2 trong đĩa Petri. Sau 7 ngày, khi xạ khuẩn mọc tốt, dùng ống đục lỗ thạch, lấy các thỏi thạch đặt lên đĩa petri đã cấy VSV kiểm định. Cất các đĩa cấy ở nhiệt độ 4oC trong khoảng 2-4 giờ để chất kháng sinh khuếch tán vào môi trường thạch, sau đó nuôi ở 37o
C và đọc kết quả sau 3 ngày [3].
Khả năng đối kháng được xác định theo kích thước vòng kháng khuẩn (VKK): VKK= D-d (mm).
Trong đó: D: Đường kính VKK và d: Đường kính thỏi thạch.
2.2.12. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Các số liệu nghiên cứu được lặp lại 3 lần. Kết quả nghiên cứu được xử lý là lấy số liệu trung bình theo lý thuyết thống kê sinh học trên phần mềm excel (Microsoft Office, Mỹ).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
CHƢƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Nghiên cứu lựa chọn chủng xạ khuẩn thích hợp cho sinh tổng hợp validamycin A hợp validamycin A
3.1.1. Đặc điểm sinh học sơ bộ của hai chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Khi nuôi cấy trên môi trường ISP2 trong vòng 7 ngày ở 28oC, khuẩn lạc của chủng S. hygroscopicus 11405 có kích thước từ 5-8mm, bề mặt khô, hơi xù xì, lồi và được che phủ bởi nhiều lớp mỏng, khuẩn ty khí sinh (KTKS) có màu trắng mờ, khuẩn ty cơ chất (KTCC) có màu hơi xám sau 7 ngày nuôi. Chủng S. hygroscopicus CNLM có KTKS màu trắng, KTCC màu vàng nhạt sau 7 ngày nuôi. Khuẩn lạc của chủng S. hygroscopicus CNLM lồi và xù xì hơn so với chủng S. hygroscopicus 11405. Khả năng phát triển và hình thái của chủng S. hygroscopicus 11405 là tương đối đồng đều và ổn định hơn so với chủng S. hygroscopicus CNLM (Bảng 3.1 và Hình 3.1).
Bảng 3.1. Đặc điểm nuôi cấy của hai chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên cứu
Chủng KTKS/ ngày KTCC/ngày Sắc tố tan 7 14 21 7 14 21 Streptomyces hygroscopicus 11405 Xám nhạt Trắng Trắng xám Vàng nhạt Vàng đậm Màu nâu Không Streptomyces hygroscopicus CNLM Màu trắng Xám nhạt Màu xám Màu vàng nâu Màu nâu Màu nâu Có (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chủng xạ khuẩn Mặt trước Mặt sau
Streptomyces hygroscopicus 11405
Streptomyces hygroscopicus
CNLM
Hình 3.1. Hình ảnh khuẩn lạc của hai chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus
11405 và S. hygroscopicus CNLM khi nuôi cấy trên môi trường thạch ISP2 Các kết quả nghiên cứu cho thấy hai chủng 11405 và CMLM có đặc điểm hình thái sơ bộ giống với loài Streptomyces hygroscopicus; trong đó chủng 11405 có đặc điểm giống với chủng Streptomyces hygroscopicus var.
limoneous T-7545 [24] và chủng CNLM có đặc điểm giống với chủng
Streptomyces hygroscopicus subsp. jinggangensis 5008 [39]. Theo các tài liệu công bố, hai loài xạ khuẩn S. hygroscopicus var. limoneous và S. hygroscopicus subsp. jinggangensis đều được nghiên cứu chủ yếu về khả năng sinh kháng sinh val-A ứng dụng trong phòng trừ nấm gây bệnh trên một số cây nông nghiệp [25], [26], [27], [39]. Hiện nay, chủng nấm S. hygroscopicus subsp. jinggangensis Yen có nguồn gốc từ Trung Quốc được nhiều nghiên cứu công bố về khả năng ứng dụng trong sản xuất val-A.
Trong nghiên cứu này, các đặc điểm hình thái trên chưa thể đưa ra đặc điểm phân loại của hai chủng xạ khuẩn đến dưới loài. Do vậy, hai chủng xạ
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn trong nghiên cứu được định danh sơ bộ là S. hygroscopicus 11405 và S. hygroscopicus CNLM. Ngoài ra, trong quá trình nuôi cấy, chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405 có khả năng phát triển nhanh hơn chủng S. hygroscopicus CNLM trong cùng điều kiện thí nghiệm.
3.1.2. Khả năng sinh enzyme protease, cellulase và amylase của hai chủng xạ khuẩn xạ khuẩn
Cả hai chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405 và S. hygroscopicus
CNLM đều có khả năng sinh ba loại enzyme ngoại bào protease, cellulase và amylase; đường kính vòng phân giải (D-d, mm) thể hiện hoạt tính của ba loại enzyme trên lần lượt là 18, 22 và 28 mm (đối với chủng S. hygroscopicus
11405) và 17, 18, 25 mm (đối với chủng S. hygroscopicus CNLM) (Hình 3.2). Các đặc điểm trên là một thuận lợi để có thể lựa chọn được các nguồn cơ chất thích hợp, dễ kiếm, có giá thành rẻ trong nước như các loại bột ngô, bột đậu tương, bột gạo…sử dụng trong môi trường nuôi cấy nuôi cấy xạ khuẩn nhằm sinh tổng hợp val-A sau này.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
Protease Cellulase Amylase
(A)
Protease Cellulase Amylase
(B)
Hình 3.2. Khả năng sinh tổng hợp ba loại enzyme ngoại bào của chủng S. hygroscopicus 11405 (A) và S. hygroscopicus CNLM (B)
3.1.3. Khả năng sinh tổng hợp validamycin A của hai chủng xạ khuẩn
3.1.3.1. Khả năng ức chế nấm R. solani của hai chủng xạ khuẩn
Khi nuôi cấy trên môi trường thạch A1, A2 cả hai chủng xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405 và S. hygroscopicus CNLM đều có khả năng sinh kháng sinh thể hiện bằng khả năng ức chế phát triển của nấm R. solani. Trong đó, chủng S. hygroscopicus 11405 (vòng kháng nấm là 20,1 mm) thể hiện hoạt tính kháng nấm cao hơn chủng S. hygroscopicus CNLM (vòng kháng nấm là 18,2 mm) (Bảng 3.2). Khi nuôi cấy trong môi trường lỏng FM3, cả hai chủng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn xạ khuẩn S. hygroscopicus 11405 và S. hygroscopicus CNLM đều có khả năng sinh kháng sinh kháng nấm, đường kính vòng kháng nấm lần lượt là 17,6 và 15,7 mm (Bảng 3.2).
Như vậy, trong cả hai điều kiện nuôi cấy trên đĩa Petri thạch và nuôi cấy chìm, chủng S. hygroscopicus 11405 đều có khả năng sinh kháng sinh kháng nấm cao hơn chủng S. hygroscopicus CNLM.
Bảng 3.2. Khả năng ức chế nấm R. solani của hai chủng S. hygroscopicus
11405 và S. hygroscopicus CNLM
Chủng xạ khuẩn Đường kính vòng kháng nấm (D-d) (mm)
Môi trường thạch Lên men chìm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
S. hygroscopicus 11405 20,1 17,6
S. hygroscopicus CNLM 18,2 15,7
Ghi chú:
D: Đường kính vòng kháng khuẩn d: Đường kính thỏi thạch.
3.1.3.2. Xác định khả năng sinh val-A của hai chủng xạ khuẩn bằng sắc ký lỏng cao áp
Khi phân tích khả năng sinh tổng hợp val-A trong dịch lên men của hai chủng S. hygroscopicus 11405 và S. hygroscopicus CNLM bằng phân tích HPLC cho thấy: cả hai chủng xạ khuẩn đều có khả năng sinh val-A do thời gian lưu (retention time) của sản phẩm trong dịch lên men với val-A chuẩn có độ tương đồng là 3,5 phút. Điều đó chứng tỏ cả hai chủng xạ khuẩn trên đều có khả năng sinh val-A (Hình 3.3).
Khi tính toán nồng độ val-A trong dịch lên men căn cứ vào độ rộng của đỉnh peak cho thấy, chủng S. hygroscopicus 11405 và S. hygroscopicus
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn CNLM sinh val-A trong dịch lên men lần lượt là 7,75 mg/ml và 5,75 mg/ml (Hình 3.3).
(A)
(B)
(C)
Hình 3.3. Phổ sắc ký lỏng cao áp (HPLC) của val-A chuẩn (A) và val-A có trong dịch lên men của chủng S. hygroscopicus 11405 (B) và chủng S.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
3.1.4. Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh của hai chủng xạ khuẩn
Một trong những tiêu chí chọn chủng sản xuất là khả năng biến động tự nhiên của khuẩn lạc trong các ống giống theo chiều hướng giảm khả năng sinh kháng sinh phải thấp [11]. Chủng S. hygroscopicus 11405 và S. hygroscopicus CNLM trong các ống giống khác nhau được nhân giống, pha loãng và cấy gạt trên môi trường ISP2, chọn ngẫu nhiên được các khuẩn lạc để xác định hoạt tính kháng nấm R. solani. Kết quả được thể hiện trên các hình 3.4, hình 3.5 và hình 3.6.
(A)
(B)
Hình 3.4. Hình ảnh minh họa kết quả sàng lọc tự nhiên về hoạt tính kháng nấm chủng S. hygroscopicus 11405 (A) và S. hygroscopicus CNLM (B)
Đối với chủng S. hygroscopicus 11405, chọn ngẫu nhiên 76 khuẩn lạc có kết quả sau:
Đường kính vòng ức chế trung bình: x = 18,8 mm
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn Các chủng có đường kính vòng ức chế (DVƯC):
DVƯC> X +2 = 26,0 mm có HTKS cao hơn chủng gốc S. hygroscopicus 11405
DVƯC < X - 2 = 11,6 mm là có HTKS thấp hơn chủng gốc S. hygroscopicus 11405
Hình 3.5.Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh kháng nấm R. solani
của chủng S. hygroscopicus 11405
Đối với chủng S. hygroscopicus CNLM, cũng chọn ngẫu nhiên 76 khuẩn lạc có kết quả sau:
Đường kính vòng ức chế trung bình: x = 16,2 mm
Độ lệch chuẩn: = 1,9
Các chủng có đường kính vòng ức chế :
DVƯC> X +2 = 20,0 mm có HTKS cao hơn chủng gốc S. hygroscopicus CNLM (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
DVƯC < X - 2 = 12,4 mm là có HTKS thấp hơn chủng gốc S. hygroscopicus CNLM
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn 0 10 20 30 40 50 60 (9-11) (12-14) (15-17) (18-20) (21-23) Đƣờng kính vòng ức chế (mm) T ỷ l ệ c h ủ n g ( %)
Hình 3.6. Biến động tự nhiên về hoạt tính kháng sinh kháng nấm R. solani
của chủng S. hygroscopicus CNLM
Hai chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên cứu có hoạt tính kháng nấm chưa cao nhưng khá ổn định. Chủng S. hygroscopicus 11405 trước khi được bảo quản có khả năng ức chế nấm mốc R. solani kiểm định với đường kính vòng ức chế dao động trong khoảng 18–21 mm. Sau thời gian 2–3 tháng, có 7,9% số khuẩn lạc tách ra giảm hoạt tính kháng nấm so với các khuẩn lạc ban đầu. Tuy nhiên, có 6,5% số khuẩn lạc có hoạt tính kháng nấm cao hơn các khuẩn lạc của chủng gốc (Hình 3.5).
Chủng S. hygroscopicus CNLM trước khi bảo quản có khả năng ức chế nấm mốc kiểm định với vòng ức chế trong khoảng là 15-17 mm. Sau thời gian 2-3 tháng có 13,2% số khuẩn lạc tách ra giảm khả năng kháng nấm so với khuẩn lạc ban đầu. Tuy nhiên, có 2,7% số khuẩn lạc có hoạt tính kháng nấm cao hơn khuẩn lạc gốc tại thời điểm giữ giống (Hình 3.6)
Trong tự nhiên có nhiều yếu tố tác động đến khả năng tổng hợp kháng sinh của chủng giống. Trong khi đó, kháng sinh chỉ là sản phẩm trao đổi chất thứ cấp, không cần thiết cho sự sinh trưởng của VSV nên chủng VSV luôn có xu thế bị giảm HTKS. Bên cạnh việc chú trọng khâu giữ giống và nhân giống, cần thiết thường xuyên chọn lọc lại chủng giống hoặc gây đột biến nhằm tạo được biến chủng mới có HTKS cao và ổn định. Do vậy việc chọn ra chủng có
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn khả năng biến động tự nhiên về hoạt tính sinh kháng sinh theo chiều hướng giảm thấp là yếu tố quan trọng trong việc lựa chọn chủng. Theo hình 3.4 và hình 3.5, sau thời gian bảo quản thì khả năng biến động tự nhiên theo chiều hướng giảm của cả hai chủng là tương đối thấp. Trong đó, chủng S. hygroscopicus 11405 thể hiện giảm hoạt tính kháng sinh theo chiều hướng biến động tự nhiên thấp hơn (7,9%) so với chủng S. hygroscopicus CNLM (13,2%).
Như vậy, qua các kết quả nghiên cứu trên cho thấy cả hai chủng xạ khuẩn sử dụng trong nghiên cứu đều có khả năng sinh ba loại enzyme ngoại bào protease, amylase và cellulase. Ngoài ra, chủng S. hygroscopicus 11405 có khả năng phát triển nhanh, ức chế sinh trưởng nấm R. solani và sinh val-A cao hơn chủng S. hygroscopicus CNLM. Do vậy chúng tôi chọn chủng S. hygroscopicus 11405 để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng S. hygroscopicus 11405
3.2.1. Đặc điểm nuôi cấy và hình thái của xạ khuẩn S. hygroscopicus
11405
3.2.1.1. Đặc điểm của khuẩn lạc
Chủng S. hygroscopicus 11405 sinh trưởng tốt trên các môi trường Gause 1, ISP-2, ISP-3, ISP-4 và ISP-7 sau 3 ngày. Khuẩn ty khí sinh có màu xám trên môi trường Gause-1 và ISP-7, màu trắng trên ISP-1 và ISP-2, màu vàng trên ISP-4 và ISP-5, khuẩn ty cơ chất màu vàng đến xám, không có khả năng sinh melanin và sắc tố trên các môi trường kiểm tra trên. Màu sắc và hình thái của chủng trên các môi trường được trình bày trong bảng 3.3 và hình 3.7.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn
Bảng 3.3. Bảng so màu khuẩn lạc của chủng S. hygroscopicus 11405 trên các môi trường nuôi cấy tại các thời điểm khác nhau
Môi trường KTKS KTCC Sắc tố tan Mela nin 7 ngày 14 ngày 21 ngày 7 ngày 14 ngày 21 ngày Gauze
I Y1½db GY2fe GY2fe Y1½fb
Y24½d c
Y24
½dc - -
ISP1 Wa Wa W13ba Y1db Y1db Y1db - -
ISP2 Wa Wb Wb Y2fb GY2ge GY4li - -
ISP4 Y1½fb Y½db Y1db Y1½fb Y1½fb Y1½fb - -
ISP7 GY3ge GY4ig R5ge GY3ig GY4li GY3li - -