Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT --- NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨ

Trang 1

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

-

NGUYỄN THỊ HIỀN

NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ

CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN

TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Chuyên ngành: Vi sinh vật

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH

Hà Nội, 2012

Trang 2

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của tôi Các số liệu và kết quả trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong các công trình nghiên cứu khác

Tác giả luận văn

Nguyễn Thị Hiền

Trang 3

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ phòng Di truyền Vi sinh vật, đã tận tình chỉ bảo và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình và bạn bè, những người đã luôn bên cạnh động viên, ủng hộ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi học tập và hoàn thành luận văn của mình

Hà Nội, ngày …tháng…năm 2012

Học viên

Nguyễn Thị Hiền

Trang 4

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Đại cương về Bacillus thuringiensis 3

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B thuringiensis 3

1.1.2 Đặc điểm hình thái của Bt 6

1.1.3 Đặc điểm sinh hoá 8

1.1.4 Đặc điểm phân loại 8

1.1.5 Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis 9

1.1.6 Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis 11

1.1.7 Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể 13

1.1.8 Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng 14

1.1.9 Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam 15

1.1.10 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc 16

1.1.11.Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai 18

1.2 Đại cương về côn trùng bộ cánh vảy 19

1.2.1 Côn trùng bộ cánh vảy 19

1.2.2 Côn trùng thử nghiệm 19

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1 Vật liệu 24

2.1.1 Sinh phẩm 24

2.1.2 Hóa chất và thiết bị 24

2.2 Phương pháp nghiên cứu 26

2.2.1 Phân loại các chủng Bt bằng phản ứng huyết thanh 26

2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt 27

2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm 27

2.2.4 Tách chiết DNA plasmid 28

2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C bằng PCR 29

Trang 5

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C 30

2.2.7 Xác định trình tự nucleotide 32

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33

3.1 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai mang gene cry1C có hoạt tính diệt sâu xanh da láng và sâu tơ 33

3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể của các chủng Bt nghiên cứu 33

3.1.2 Phân loại Bt bằng huyết thanh 35

3.1.3 Hoạt tính diệt của các chủng Bta trên sâu xanh da láng và sâu 36

Nồng độ bào tử 36

Hoạt tính của các chủng Bta diệt sâu xanh da láng và sâu tơ 37

3.2 Tách dòng và đọc trình tự đoạn gene cry1C 39

3.2.1 Khuếch đại gene cry1C của các chủng Bta bằng PCR 39

3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C 40

3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C 44

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

Trang 6

6 DNA Deoxyribonucleotide acid

7 E coli Escherichia coli

8 EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid

10 PCR Polymerase chain reaction

11 SDS Sodium dodecyl sulphate

14 X-gal 5- Bromo- 4 Chloro- 3 indolyl β- D- galactoside

Trang 7

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân loại gene cry của Bt……… 10

Bảng 3.1 Sự đa dạng hình thái tinh thể của các chủng Bt… 34

Bảng 3.2 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta sau 3 ngày thử nghiệm 37 Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bt sau 3 ngày thử nghiệm 38

DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bào tử và tinh thể của B thuringiensis ……… … 7

Hình 1.2 Tinh thể của vi khuẩn B thuringiensis 8

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac 14

Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn B thuringiensis …… ………… 15

Hình 1.5 Vòng đời sâu tơ ……… ……….…… 21

Hình 1.6 Rau bắp cải bị sâu hại ……… ……… 21

Hình 1.7 Vòng đời của sâu xanh da láng ……… ……… ……… 23

Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc Bt trên môi trường MPA sau 72h nuôi ở 28ºC 33

Hình 3.2 Hình dạng bào tử và tinh thể của Bt phóng đại 1000 lần 34

Hình 3.3 Ngưng kết của chủng TN 6.12 phân lập với type huyết thanh dưới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần……… 36

Hình 3.4 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng của các chủng Bta nghiên cứu 37

Hình 3.5 Hoạt tính diệt sâu tơ của các chủng Bta nghiên cứu……… 38

Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR của các chủng Bta nghiên cứu………… 39

Hình 3.7 Khuẩn lạc xanh, trắng xuất hiện trên môi trường LBA sau khi nuôi cấy qua đêm……… 41

Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13……… 42

Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc trên agarose 1% 43

Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ các DNA plasmid tái tổ hợp….…44

Trang 8

Để bảo vệ năng suất cây trồng, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa học với nồng độ cao để phun ngay sau khi dịch sâu hại bùng phát Trung bình mỗi hectar cây trồng phải phun từ 5–7 kg thuốc Tuy nhiên, việc sử dụng tràn lan các loại hóa chất diệt côn trùng đã để lại dư lượng thuốc trong nông phẩm, gây độc hại đối với sức khỏe người sử dụng và gây ô nhiễm môi trường Thay vào các biện pháp hóa học thì các biện pháp sinh học được khuyến khích sử

dụng Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus thurinngiensis (Bt) chiếm hơn

90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học trên thế giới và hoàn toàn không độc với con người, động vật và môi trường [24]

Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai (Bta) được nghiên cứu nhiều nhất trong 82 dưới loài của Bacillus thuringiensis Bacillus thurigiensis subsp aizawai có khả năng sinh tổng hợp protein tinh thể gây độc với côn trùng

bộ cánh vảy (Lepidoptera), trong đó có loài sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh (Helicoverpa armigera Hibber), sâu khoang (Spodoptera litura) và một số côn trùng bộ 2 cánh (Diptera) Cry1C là một loại protein thể độc do Bta sinh ra trong

quá trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng bộ cánh vảy rất mạnh

Vì vậy, để có thể sản xuất được thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng

cánh vảy hoặc chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng bộ cánh vảy vào cây trồng, chúng tôi đã tiến hành đề tài:

“Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy’’

Trang 9

2 Mục tiêu và nội dung nghiên cứu

1.1 Mục tiêu

- Sàng lọc được các chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai (Bta) có hoạt

tính diệt côn trùng bộ cánh vảy

- Tách dòng và đọc trình tự được gene cry1C của các chủng Bta đã sàng lọc

có hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy

- Thử hoạt tính diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng Bta thu nhận được

- Phát hiện các chủng Bta mang gene cry1C từ các chủng có hoạt tính diệt côn

trùng cánh vảy bằng phương pháp PCR

- Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng bộ cánh vảy

- Xác định trình tự đoạn gene cry1C đã được tách dòng và so sánh với trình

tự gene trên Gene Bank

Trang 10

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Đại cương về Bacillus thuringiensis

1.1.1 Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng B thuringiensis

 Trên thế giới

B thuringiensis là vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng do nhà khoa học

Nhật Bản Ishitawa phát hiện năm 1901 khi ông nghiên cứu về bệnh ở tằm dâu,

đã phát hiện ra nguyên nhân gây bệnh cho tằm là do một loại vi khuẩn thuộc chi

Bacillus Ông đặt tên vi khuẩn này là Bacillus sotto [8]

Năm 1911, Berliner (người Đức) đã phân lập được một loại vi khuẩn gây bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải ở vùng Thuringien và ông đã

đặt tên là Bacillus thuringiensis năm 1915 [8]

Năm 1930, Bacillus thuringiensis đã được thử nghiệm chống sâu đục

thân ở Châu Âu

Năm 1938, chế phẩm Bt đã được sản xuất lần đầu tiên để diệt sâu hại lúa

mì tại Pháp

Năm 1953, Hannay và Fitzjame đã phát hiện ra thể vùi và công bố tinh thể

có bản chất là protein [8]

Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) đã sản xuất thuốc “Thuricide” với

khối lượng lớn từ chủng B thuringiensis subsp kurstaki. Năm 1956, Angus đã chứng minh hoạt tính diệt sâu là do tinh thể tách ra từ tế bào và bào tử [33]

Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại

mới cho các chủng Bt và Bacilus sphaericus (Bs) bằng phương pháp huyết

thanh

Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh khi phát hiện ra chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao

Trang 11

Năm 1977, Goldberg và Margarit đã phát hiện dưới loài Bt var

israelensis diệt ấu trùng muỗi và ruồi thuộc bộ hai cánh Phát hiện này đã chứng

tỏ phổ hoạt tính của Bt không chỉ bó hẹp trong bộ cánh vảy (Lepidoptera) mà còn với cả bộ hai cánh (Diptera) [14]

Năm 1981, Schnepf và Whiteley lần đầu tiên đã phân lập và tách dòng

gene độc tố mã hóa diệt sâu của chủng Bt subsp kurstaki HD-1 gọi là gene cry1

và cho biểu hiện gene này ở E coli Từ đó một số lượng lớn các gene đã được

tách dòng và nghiên cứu đặc tính

Năm 1983, phổ hoạt tính của Bt lại được nâng lên khi Krieg và cộng sự phát hiện ra dưới loài Bt subsp tenebrionis diệt bộ cánh cứng (Coleoptera) Chủng này được phân lập từ bọ cánh cứng Tenebrio molitar Sau đó, công ty Mycogen phát hiện ra một chủng tương tự Bt subsp morrisoni đặt tên là Bt subsp Sandiego và đã tổng hợp được chuỗi gene độc tố của chúng [14]

Năm 1985, gene cry Bt được chuyển vào cây trồng để diệt sâu và đến năm

1995 các cây chuyển gene đầu tiên đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng

Từ năm 1987 -1992, người ta cũng đã phát hiện thấy Bt có khả năng diệt

giun tròn thực vật, diệt ve bét, mạt thuộc bộ Trematoda và diệt kiến thuộc bộ

Hymenoptera Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu về các

đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa và được sử dụng để sản xuất có tính thương mại cao [10, 13, 25]

Năm 1995, cây chuyển gene thương phẩm đầu tiên được đưa vào sản

xuất, từ đó một chương mới về ứng dụng của Bt vào cây trồng nông nghiệp –

cây trồng công nghệ sinh học và thực phẩm chuyển gene [2]

Năm 2003, Sakai và cs đã công bố thông tin protein tinh thể của Bt có khả

năng diệt tế bào ung thư

Năm 2005, Ohba và N.D Binh đã phát hiện protein của 4 dưới loài Bt

phân lập ở Việt Nam có thể hạn chế sự phát triển của tế bào ung thư cổ tử cung

ở người [10,13]

Trang 12

Đến nay rất nhiều chủng Bt được phát hiện, nghiên cứu và được sử dụng

để sản xuất có tính thương mại cao

 Ở Việt Nam

Lịch sử nghiên cứu và ứng dụng về Bacillus thuringiensis ở Việt Nam

được khoảng 40 năm chia làm 3 thời kỳ chính với nhiều công trình của các tác giả như Nguyễn Công Bình , Phạm Bá Nhạ, Ngô Đình Bính, những người đầu

tiên mở đường nghiên cứu về B thuringiensis tại Việt Nam [10]

Thời kỳ mở đầu nghiên cứu

Các công bố khoa học về nghiên cứu B thuringiensis ở thời kỳ này còn rất

ít Vào thời kỳ này một số viện nghiên cứu đã tiến hành sản xuất B thuringiensis

bằng phương pháp thủ công và bán công nghiệp trong phòng thí nghiệm sử dụng

các chủng Bacillus thuringiensis thuộc loài phụ Bacillus thuringiensis var

thuringiensis, B thuringiensis var kurstaki Các chế phẩm B thuringiensis này đã

được sử dụng cho vùng rau ngoại thành Hà Nội và đã thu được các kết quả

tốt Tuy nhiên từ 1984 đến 1993, việc sản xuất chế phẩm B thuringiensis đã

bị giảm sút vì các chế phẩm B thuringiensis sản xuất ra có chất lượng

không cao nên tốc độ tiêu thụ giảm [8,10]

Thời kỳ sản xuất và ứng dụng (1984-1994)

Ở thời kỳ này, các chế phẩm B thuringiensis sản xuất theo phương pháp

dịch thể được áp dụng rộng rãi, có hiệu quả phòng trừ rất rõ rệt, hơn nữa có giá thành hợp lý nên được nông dân ưa chuộng Sau đó, một số đơn vị thuộc các

trường đại học đề xuất phương án sản xuất chế phẩm B thuringiensis theo phương

pháp lên men hở không cần vô trùng nhưng đã không thu được kết quả tốt [10]

Thời kỳ nghiên cứu cơ bản, ứng dụng và phát triển (từ năm 1994 đến nay)

Cuối thời kỳ sản xuất và ứng dụng, chế phẩm B thuringiensis kém chất lượng không tiêu thụ được Sản xuất và ứng dụng B thuringiensis bước vào thời

kỳ thoái trào, các nhà nghiên cứu buộc phải quay lại nghiên cứu cơ bản để phục

vụ cho xây dựng công nghệ sản xuất và cơ sở ứng dụng Do vậy các nhà khoa

Trang 13

học đã chuyển việc nghiên cứu B thuringiensis sang hướng mới như tìm kiếm các chủng B thuringiensis có phổ diệt sâu rộng, hoạt tính diệt sâu cao để phục hồi lại việc sản xuất thuốc trừ sâu B thuringiensis và ứng dụng công nghệ chuyển gene B thuringiensis phục vụ sản xuất [10]

Các nghiên cứu của Ngô Đình Bính và cs cho thấy các chủng B

thuringiensis phân lập tại Việt Nam rất đa dạng về thành phần loài [6] Năm

2005, Lê Thị Minh Thành và cs khi nghiên cứu sự phân bố và đa dạng gene

của Bt phân lập ở một số tỉnh thuộc vùng Đông Bắc Bộ đã phân loại được 22

dưới loài trên tổng số 82 dưới loài đã được phát hiện trên thế giới [7, 11]

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gene có trong các chủng B

thuringiensis phân lập tại Việt Nam, Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng và biểu

hiện gene mã hóa tổng hợp protein Cry1C và Cry1D diệt sâu khoang trong E coli

thu được các protein tái tổ hợp có hiệu quả diệt sâu cao hơn so với đối chứng [5,12]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gene kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra các cây có khả năng kháng các sâu bệnh mới đã được bắt

đầu từ cuối thế kỷ 20 Có rất nhiều nghiên cứu chuyển gene cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các

giống cây trồng có khả năng kháng sâu như: cây đậu xanh, cây cải bông [9,13]

Năm 2003, Phan Đình Pháp và cs đã chuyển gene cry1B vào cây lúa thông qua

phương pháp sử dụng súng bắn gen Năm 2005, gene kháng sâu trên được

chuyển vào cây cà tím thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens [14]

1.1.2 Đặc điểm hình thái của Bt

Bt là đối tượng được nghiên cứu nhiều nhất trong số các tác nhân vi sinh vật gây bệnh cho côn trùng Bt có đặc điểm là vi khuẩn đất, tế bào có dạng que,

kích thước 3-6m, có thể đứng riêng rẽ hoặc tạo thành chuỗi Bt hô hấp hiếu khí

không bắt buộc, bắt màu Gram dương, có khả năng di động nhờ tiêm mao mọc trên bề mặt tế bào [26,27,28]

Trang 14

Khuẩn lạc của Bt có màu trắng sữa, hình tròn, bề mặt xù xì, viền khuẩn

lạc nhăn, đường kính có thể đạt tới 8-10m Một số chủng Bt xuất hiện khuẩn

lạc dạng trơn nhẵn

Mỗi tế bào Bt khi trưởng thành có khả năng sinh bào tử và tinh thể độc

bản chất làprotein, có khả năng diệt côn trùng Bào tử Bt có dạng hình trụ hoặc

hình trứng, kích thước 1,6-2m Bào tử được hình thành trong điều kiện môi trường bất lợi như nhiệt độ cao, môi trường nghèo chất dinh dưỡng Khi gặp điều kiện thuận lợi, bào tử có thể nảy mầm thành tế bào sinh dưỡng [21,27]

Hình 1.1 Bào tử và tinh thể của Bacillus thuringiensis [21]

Cùng với quá trình tạo bào tử, các tinh thể protein độc tố cũng được tổng hợp Tinh thể có kích thước 0,6-2m, có hình dạng không cố định (có thể là hình lập phương, hình lưỡng tháp hoặc hình cầu) Tinh thể có thể chiếm tới 30%

trọng lượng khô của tế bào Khi nhuộm tế bào Bt bằng thuốc nhuộm fushin và

quan sát dưới kính hiển vi có thể nhận thấy tinh thể Bt bắt màu hồng sẫm còn

bào tử thì bắt màu hồng nhạt [27]

Trang 15

Hình 1.2 Tinh thể của vi khuẩn Bacillus thuringiensis [21]

1.1.3 Đặc điểm sinh hoá

Bt không lên men sinh axid trong môi trường chứa arrabinorase, xylose,

manitol, nhưng tạo axit ở môi trường chứa glucose Có khả năng thủy phân tinh bột, khử nitrate thành nitrite, phát triển được ở môi trường chứa 0,001%

lysozyme, 7% NaCl với pH 5,7, có phản ứng với lòng đỏ trứng gà Bt không có

khả năng khử amine ủa phenilalanin, không sử dụng axid citric, không khử muối

sulfate (www.phenyl alanine tailieu.vn)

Bt có khả năng sinh trưởng phát triển ở nhiệt độ dao động từ 15-450C Nhiệt độ tối ưu là 28- 32οC

Bt không mẫn cảm với pH, pH tối ưu cho sự phát triển của Bt là pH= 7 Bt

có khả năng oxy hóa hydrocarbon đến axid hữu cơ và dioxide carbon theo chu

trình Embden- Meyerhoff- Panas [6, 7, 8]

1.1.4 Đặc điểm phân loại

Có rất nhiều phương pháp phân loại B thuringiensis khác nhau: Phân loại

Bt dựa trên đặc điểm hình thái và đặc điểm sinh hoá (Heimpel và Angus,

1958).Phân loại theo typ huyết thanh kháng nguyên - H Phân loại bằng thực khuẩn thể dựa trên tính mẫn cảm khác nhau với các thực khuẩn thể khác nhau.Phân loại theo typ huyết thanh kháng protein tinh thể.Phân loại theo loại hình enzym lipase.Phân loại theo nguồn bệnh

Trang 16

Tuy nhiên, các phương pháp phân loại này vẫn còn tồn tại những mặt hạn chế

Năm 1962, de Barjac và Bonnefoi đã đưa ra một phương pháp phân loại

mới cho Bt bằng phản ứng huyết thanh và đã mô tả 27 type huyết thanh chính có

hoạt tính diệt côn trùng thuộc bộ cánh vảy, hai cánh, cánh cứng, nguyên sinh động vật, động vật chân khớp Phương pháp phân loại theo type huyết thanh H được sử dụng chủ yếu do đơn giản và có tính đặc hiệu cao Phương pháp phân loại này, dựa trên phản ứng ngưng kết giữa kháng nguyên tiêm mao H của vi khuẩn với kháng huyết thanh tương ứng Số lượng các type huyết thanh và các chủng phân loại theo huyết thanh tăng cùng với tổng số các chủng phân lập được Cho đến năm 2003, người ta đã phát hiện được 69 typ huyết thanh bao

gồm 82 thứ huyết thanh khác nhau của B thuringiensis Theo hệ thống phân loại thì B thuringiensis subsp aizawai thuộc type huyết thanh số 7 (Theo Bonnefoi

& de Barjac 1963) [5]

Bảng phân loại theo type huyết thanh H được trung tâm quốc tế B

thuringiensis đặt tại Viện Pasteur, Paris khuyến cáo sử dụng cho tất cả các

phòng thí nghiệm Bt trên thế giới từ năm 1982 và có 69 type huyết thanh H

1.1.5 Phân loại gene độc tố của vi khuẩn Bacillus thuringiensis

Kích thước hệ gene của B thuringiensis vào khoảng 2,4- 5,7 triệu bp Thể

nhân ở vi khuẩn là dạng nhân nguyên thủy chưa có màng nhân nên chưa có hình dạng nhất định và được gọi là vùng nhân Khi nhuộm màu tế bào bằng Feulgen

có thể thấy nhân hiện màu tím Trong vùng nhân có một NST duy nhất dạng

vòng chứa 1 sợi DNA xoắn kép Thể nhân chứa đựng thông tin di truyền của Bt Hầu hết các chủng B thuringiensis phân lập mang các nhân tố di truyền ngoài

nhiễm sắc thể (NST), các nhân tố di truyền này có thể đóng vòng hoặc không đóng vòng Trên thế giới người ta đã mô tả được bản đồ cấu trúc gene tự nhiên

cho một số chủng B thuringiensis

Năm 1982, Held và cộng sự đã sử dụng chữ viết tắt "cry" (bắt nguồn từ

chữ crystal - tinh thể) để biểu diễn gene tổng hợp protein tinh thể diệt sâu Các

Trang 17

chủng Bt sinh tổng hợp 3 dạng độc tố chính là Cry, Cyt, Vip do các gene cry,

cyt, vip mã hóa [21,25]

plasmid dao động từ 2- 12 trong các chủng nghiên cứu [11,20]

Theo công bố mới nhất trên website

http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/toxins2.html: đã

phát hiện tới hơn 600 gene thuộc 70 họ gene cry của Bt

Sau đây là cáchọ gene mã hóa cho protein tinh thể độc diệt một số bộ côn trùng gây hại phổ biến ở Việt Nam:

Bảng 1.1 Phân loại gene cry của Bt

thể

Khối lƣợng phân tử protein (kDa)

Hoạt tính diệt côn trùng

Các gene cry còn lại Đa dạng 35 – 129 Đa dạng

Gene cyt

Gene cyt mã hóa cho các độc tố Cyt cũng có bản chất protein và hình

thành thể vùi như độc tố Cry, nhưng tính tương đồng amino acid giữa 2 độc tố là

không đáng kể [34]

Trang 18

Gene cyt bao gồm 45 gene thuộc 3 lớp cyt1, cyt2 và cyt3 mã hóa protein gây độc với côn trùng và động vật không xương sống Nhóm gene cyt mã hóa

protein 27 kDa và chiếm khoảng 40-50% tinh thể, protein này có tác dụng gây độc với côn trùng bộ hai cánh và giun tròn

Gene vip

Gene vip mã hóa cho các độc tố Vip (vegetative insecticidal protein) Độc

tố Vip được Estruch và cộng sự phát hiện đầu tiên vào năm 1996, bao gồm Vip3A và Vip3B [8]

Độc tố Vip đã thu hút được sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học do khả năng diệt côn trùng phổ rộng, hoạt tính diệt sâu cao mà đặc biệt chưa phát hiện được côn trùng kháng độc tố này Các nhà khoa học đã phát hiện được 85

gene vip thuộc 4 nhóm khác nhau, trong đó đáng chú ý là gene vip3A mã hóa protein 88 kDa có hoạt tính với nhiều côn trùng cánh vảy: Agortis ispilon,

Spodoptera fugipera, Spodoptera exigua Khi côn trùng ăn phải độc tố, Vip3A

là nguyên nhân gây phân giải tế bào biểu mô ruột giữa

1.1.6 Các loại độc tố của Bacillus thuringiensis

Bacillus thuringiensis có 4 loại độc tố: 3 ngoại độc tố và một nội độc tố:

Ngoại độc tố  ( - exotoxin), ngoại độc tố  (-exotoxin), ngoại độc tố  ( - exotoxin), nội độc tố  (-endotoxin) Trong đó nội độc tố  có tác dụng diệt côn

trùng mạnh nhất

Ngoại độc tố 

Có khối lượng phân tử thấp, không bền nhiệt, có khả năng tan trong nước, tích tụ trong pha logarit của một vài loài phụ và được giải phóng ra môi trường khi tế bào tan rã Ngoại độc tố  có bản chất là một enzyme gọi là phospholipase hoặc leucithinase, có hoạt tính với một vài loài ong cắn lá đặc biệt là ong

Tenthre dineda Tác dụng độc của ngoại độc tố  có liên quan tới sự phân huỷ phospholipid ở mô của côn trùng (nghiên cứu này được phát hiện bởi Toumanoff - năm 1953) [8, 11]

Trang 19

Ngoại độc tố α có tác dụng tiêu diệt Galleria mellonella Ngoài ra còn có

hiệu lực với các loài sâu thuộc bộ cánh vảy, cánh cứng

Ngoại độc tố 

Độc tố này được Halt và Arkawwa (1959) tìm ra khi nuôi ấu trùng ruồi

nhà bằng thức ăn có chứa B thuringiensis Độc tố  có khối lượng phân tử cao 707- 850 kDa, bền nhiệt, tan trong nước Ngoại độc tố  có tác dụng kìm hãm nuclease và RNA-polymease dẫn tới cản trở việc tổng hợp tRNA Ngoại độc tố

 có phổ hoạt tính rộng, kháng côn trùng thuộc bộ cánh vảy, côn trùng thuộc bộ cánh cứng và côn trùng thuộc bộ hai cánh [8,12]

Ngoại độc tố β rất có hiệu quả trong việc chống sâu non của côn trùng mẫn cảm, gây trì trệ trong việc chuyển hóa lột xác và có tác động đối với sâu trưởng thành phát triển từ các ấu trùng đã ăn phải độc tố dưới ngưỡng gây chết

Qua nghiên cứu Federici và Wu cho thấy rằng chế phẩm Bt nếu chỉ sử

dụng ngoại độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng chỉ đạt 20% trong khi đó nếu bổ sung thêm nội độc tố  thì hiệu quả diệt côn trùng sẽ tăng lên tới 75%

Ngoại độc tố 

Có khối lượng phân tử thấp, mẫn cảm với nhiệt độ, ánh sáng và không khí, có khả năng tan trong nước Độc tố này thuộc nhóm phospholipase, có tác dụng lên phospholipid và giải phóng ra acid béo, rất mẫn cảm với nhiệt độ, ở nhiệt độ từ 600C trở lên trong vòng từ 10- 15 phút đã bị vô hoạt

Trang 20

Ngoài protein tinh thể còn chứa các thành phần khác như: carbohydrate, tuy nhiên cũng có thể carbohydrate chỉ là thành phần phụ được pha tạp trong quá trình hình thành bào tử Xét về thành phần hóa học thì nội độc tố  chứa chủ yếu các nguyên tố C, H, O, N, S Ngoài ra còn có Ca, Mg, Si, Fe và một lượng nhỏ Ni, Ti, Zn, Al, Cu, Mn Nguyên tố P hầu như không có

Nội độc tố : có đặc điểm không hòa tan trong các dung môi hữu cơ, chỉ

tan trong môi trường có pH kiềm, không tan trong nước, rất bền nhiệt Khi đun ở

650C trong một giờ không bị mất hoạt tính, chỉ khi đun ở 1000

C trong 30-40

phút thì tinh thể bị mất tính độc Mặc dù tinh thể độc có thể tan ở pH kiềm,

nhưng không phải pH kiềm nào cũng thích hợp Qua nghiên cứu các nhà khoa học nhận thấy rằng, pH quá cao hay quá thấp cũng đều ảnh hưởng tới độc tính của tinh thể Tuy nhiên lúc mới tách ra khỏi bào tử, nó có thể hòa tan trong pH rất kiềm Sự tổng hợp tinh thể độc và bào tử xảy ra gần như đồng thời trong

khoảng 3 giờ sau pha cân bằng [8, 11, 16]

1.1.7 Cấu trúc của các nhóm độc tố tinh thể

Năm 1991, Li và cs đã công bố cấu trúc của nội độc tố  của protein tinh thể diệt sâu Cry3A, từ đó đã mở rộng ra cho các độc tố khác Các protein tinh thể có cấu trúc chung gồm 3 vùng riêng biệt:

Vùng 1: là một chuỗi polypeptide gồm 290 amino acid, đây là vùng đầu

N Vùng này gồm 7 chuỗi xoắn , 6 trong 7 chuỗi này được sắp xếp thành hình

6 cạnh bao bọc xung quanh chuỗi xoắn thứ 5 kị nước Mặt bên của chuỗi xoắn thứ nhất và thứ 7 là các amino acid kị nước và nó nằm liền kề với vùng 2

Vùng 2: bắt đầu từ amino acid 291 đến amino acid 500 Vùng này gồm 3

tấm  có cấu trúc tương đồng, song song và xếp ngược chiều nhau, trong đó tấm

1 và tấm 2 có tính tương đồng cao hơn Mỗi tấm bao gồm 4 mảnh  không song song, có cấu trúc chung Hai mảnh  ở phía trong tạo thành một dải  kéo dài ra

tận phía 2 mảnh  ở phía ngoài Tấm 3 có 3 mảnh  và 1 chuỗi xoắn  có chức

Trang 21

năng duy trì cấu trúc cơ bản của tấm 1 và 2 Vùng 2 là vùng không bền vững của độc tố [20]

Vùng 3: chứa những tấm  dạng bánh kẹp Sandwich Vùng này chứa đầu nhóm carboxyl và có cấu trúc bền vững [8]

Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không gian 3 chiều của protein độc tố Cry1Ac

1.1.8 Cơ chế tác động của protein tinh thể lên côn trùng

Cơ chế hoạt động của protein tinh thể của B thuringiensis liên quan tới

sự hòa tan tinh thể trong ruột giữa của côn trùng Khi sâu ăn phải protein tinh

thể của Bacillus thurigiensis, dưới tác động của men protease có tính kiềm

(pH>10) trong ruột sâu, tinh thể độc tố bị hòa tan, và một nhân độc tố có khối lượng phân tử 60–65 kDa được hình thành và hoạt hóa Độc tố đã hoạt hóa bám vào các phân tử cảm thụ đặc biệt nằm trên màng vi thể của tế bào thành ruột sâu

Sự gắn kết này ở ruột sâu làm thay đổi gradient điện hóa tạo thành các lỗ rò (kênh ion) Do đó phá hủy cân bằng áp suất thẩm thấu của màng tế bào, làm cho

tế bào phồng lên, bị phân hủy dẫn đến sâu chết [8, 26]

Trang 22

Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu của vi khuẩn Bacillus thuringiensis [21]

1.1.9 Nghiên cứu và ứng dụng Bt ở Việt Nam

Ở Việt Nam thuốc trừ sâu sinh học Bt được ứng dụng đầu tiên tại Viện Bảo vệ Thực vật năm 1971 Nguyễn Văn Cảm và CS đã khảo nghiệm 5 loại thuốc trừ sâu sinh học Bt nhập nội từ Liên Xô vàTrung Quốc đã cho kết quả rất khả quan Tuy nhiên, những nghiên cứu, sản xuất và ứng dụng Bt đầu tiên được Nguyễn Công Bình và CS thực hiện lần đầu tiên vào năm 1973 tại Viện Sinh vật nay là Viện Công nghệ sinh học Cho đến nay Bt đã được nghiên cứu rộng rãi ở nhiều cơ sở tại Việt Nam như Viện Công nghiệp Thực phẩm, Viện Bảo vệ Thực vật, Viện Công nghệ sinh học [13]

Trên cơ sở phát hiện, tách dòng và đọc trình tự gene có trong các chủng

Bt phân lập tại Việt Nam Ngô Đình Bính và cs đã tách dòng gene và biểu hiện

gene mã hóa tổng hợp protein Cry1C, Cry1D diệt sâu khoang từ các chủng Bt subsp aizaiwai phân lập từ các mẫu đất của Hà Nội và Hà Tĩnh Protein tái tổ

hợp có hoạt tính diệt sâu cao hơn so với các chủng đối chứng [12]

Ở Việt Nam, những nghiên cứu về lĩnh vực chuyển gene kháng côn trùng vào cây trồng để tạo ra cây có khả năng kháng sâu bệnh mới đã được bắt đầu từ

thế kỷ 20 Trong đó, đã có rất nhiều nghiên cứu chuyển gene cry1A kháng sâu vào cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens để tạo ra các

Trang 23

giống cây trồng mới có khả năng kháng sâu như cây đậu xanh, cây bông Năm

2003, Phan Đình Pháp và CS đã chuyển gene cry1B vào cây lúa thông qua phương pháp sử dụng súng bắn gene, đến năm 2005, gene kháng sâu trên được

chuyển vào cây cà tím thông qua Agrobacterium [12]

Những nghiên cứu trên đã tạo tiền đề cho các nghiên cứu tiếp theo trong

việc ứng dụng các gene quý của Bt để tạo ra các cây trồng mới kháng được sâu bệnh cũng như sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt

1.1.10 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình hình thành bào tử và tinh thể độc

Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tới sự hình thành bào tử và tinh thể độc, đóng một vai trò vô cùng quan trọng và có tác động mạnh tới hiệu quả của quá

trình lên men sản xuất chế phẩm Bt Nhiều nhà nghiên cứu đã nhận thấy rằng các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng phát triển của Bt đều ảnh hưởng

tới quá trình sinh tổng hợp độc tố

Nhiệt độ: Bt có khả năng sinh trưởng, phát triển trong khoảng nhiệt độ 20-

400C Tuy nhiên nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng Bt là 28- 320C Nếu nhiệt độ dưới 200

C và trên 320C đều có ảnh hưởng lên quá trình hình thành bào tử Nếu nuôi cấy ở 200C thì chu kì phát triển cần 64 giờ, trong khi đó nuôi cấy ở 350

C thì thời gian cần cho chu kì phát triển giảm xuống còn 27 giờ và số bào tử tăng lên

Khi nuôi cấy Bt trên môi trường thạch ở nhiệt độ trên 400

pH: pH là một trong số các yếu tố có ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng

Bt, ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym, ảnh hưởng đến điện tích màng tế bào

và sự hấp thu chất dinh dưỡng, ảnh hưởng tới khả năng cho nhận chất dinh dưỡng trong môi trường và tính độc của các vật chất có hại Do đó pH quá cao

hoặc quá thấp đều có hại tới Bt Với pH dao động trong khoảng 5,8- 8,5 không

Trang 24

gây ảnh hưởng tới sự hình thành tinh thể độc Tuy nhiên sự thay đổi lớn yếu tố

pH lại làm thay đổi số lượng bào tử Thường thì Bt phát triển tối ưu ở pH=7 [9]

Oxy: Bt là vi khuẩn hô hấp hiếu khí cho nên oxy là yếu tố không thể thiếu

trong quá trình sinh trưởng Bt Tùy từng giai đoạn sinh trưởng mà hàm lượng oxy cần cung cấp khác nhau Ở các giai đoạn đầu của quá trình sinh trưởng, Bt

cần nhiều không khí, do vậy không khí được cấp càng nhiều thì lượng sinh khối càng tăng và số lượng bào tử sẽ tăng Tuy nhiên, ở các giai đoạn sau (giai đoạn logarit cho đến trở về sau) nếu cứ tiếp tục tăng hàm lượng không khí thì nó sẽ tác động lên quá trình sống của tế bào làm tế bào sớm tự phân giải, dẫn tới số lượng tinh thể độc giảm [8]

Các nguồn dinh dưỡng: Bulla và Arcas và cộng sự đã nghiên cứu và

nhận thấy rằng các hợp chất amonium vô cơ như (NH4)2SO4 không có hiệu quả

trong việc thúc đẩy quá trình sinh trưởng của Bt Trong khi đó các nguồn nitơ

hữu cơ như cao thịt, bột cá, bột đâụ tương, là yếu tố thúc đẩy quá trình sinh

trưởng Các chủng Bt khác nhau cần các amino acid khác nhau Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng nguồn nitơ có ảnh hưởng rất lớn tới sinh khối Bt và các protein tinh thể độc Ngoài ra các ion khoáng như Ca, Mg, K, cũng được coi là nguồn dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng Bt

Amino acid: một số amino acid như leucine, isoleucine có tác dụng ức

chế sự sinh trưởng của Bt cũng như sự hình thành tinh thể độc, nhưng khi cho

thêm axit amin valine vào thì sự ức chế bị mất đi Ngoài ra, nếu bổ sung riêng rẽ

threonine hoặc serine vào trong môi trường nuôi cấy Bt thì gây ức chế sự hình

thành tinh thể độc nhưng nếu đưa cả hai loại đó vào trong môi trường thì sự ức chế bị mất Tác dụng ức chế của amino acid serine cũng bị mất đi nếu như có mặt axit amin methionine Acid  – picoline và acid flucoacetate cũng ức chế việc tạo ra bào tử và sự hình thành tinh thể độc Chất kháng sinh erythromycine

ở nồng độ thấp không đủ để ức chế việc tạo ra bào tử và sự hình thành tinh thể

độc [8]

Trang 25

1.1.11 Gene cry1C và dưới loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai

Gene cry1C

Gene cry1C có kích thước khoảng 3 kb trong đó đoạn bảo thủ mã hóa độc

tố có kích thước 288bp Gene cry1C mã hóa protein tinh thể độc tố có khối lượng phân tử khoảng 130kDa Nhóm dưới loài B.thuringiensis subsp aizawai

có khả năng sinh tinh thể hình thoi chứa gene cry1C Cho đến thời điểm hiện nay đã có trên 16 gene thuộc phân nhóm cy1C được tách dòng và công bố trên

cơ sở dữ liệu của Crichmore, trong đó mới nhất là gene cry1CAa14

Trong nghiên cứu khả năng tổ chức các thụ thể trên màng tế bào ruột côn trùng thì vùng 2 của độc tố Cry1C có khả năng liên kết cả 3 loại thụ thể có khối lượng phân tử khác nhau

Dưới loài Bta

Bta là một trong số 82 dưới loài của vi khuẩn B thuringiensis, thuộc typ

huyết thanh số 7 theo khóa phân loại của Bonnefoi và de Barjac, 1963 Trong số

các chủng B thuringiensis phân lập ở Việt Nam thì có tới 15% số chủng là Bta

[5,10]

Bta hình thành tinh thể diệt sâu trong chu kì phát triển ở pha ổn định Tinh

thể có dạng hình thoi là chủ yếu Dưới loài Bta mang gene mã hóa nhiều loại

protein tinh thể của nhóm Cry 1 như Cry 1C, Cry 1D, Cry 1Aa, Cry 1Ab Vì thế

Bta là một trong những dưới loài được sử dụng phổ biến nhất trong các chế

phẩm từ Bt Bta có khả năng diệt nhiều loài sâu hại quan trọng như: sâu tơ (Plutella Xylustella), CL, ICW, sâu xanh da láng, sâu quả cà chua, sâu khoang

Bta vẫn có hiệu quả diệt sâu trên những vùng đã có biểu hiện kháng độc tố Btk

[38]

Trên thị trường hiện nay, chế phẩm XenTari sản xuất từ Bta được sử dụng

rộng rãi và có hoạt tính diệt các loại sâu hại quan trọng mà đã kháng lại thuốc trừ sâu hóa học như: sâu khoang, sâu xanh [10]

Trang 26

1.2 Đại cương về côn trùng bộ cánh vảy

1.2.1 Côn trùng bộ cánh vảy

Bộ cánh vảy(Lepidoptera) là một bộ lớn trong côn trùng học, bao gồm

bướm và bướm đêm Bộ cánh vảy gồm hơn 180.000 loài trong 128 ngành và 47

họ Trong số hơn 180.000 loài được mô tả cho đến nay có thể tìm thấy hầu như

ở khắp mọi nơi Khoảng 11.300 loài được tìm thấy từ Bắc Mỹ và 10.000 loài tìm thấy ở Úc Bộ cánh vảy được tìm thấy phần lớn ở hầu hết các môi trường sống, nhưng hầu như chúng luôn luôn sống ở các vùng thực vật bậc cao, đặc biệt là

thực vật hạt kín [3]

Cũng như tất cả các côn trùng, loài cánh vảy có một bộ xương ngoài và tách ra thành ba phần : phần đầu, phần ngực, phần bụng Chúng có 3 cặp chân ở ngực, hai mắt kép lớn và một thuôn dài trên miệng được gọi là vòi Còn ấu trùng thì cơ thể mềm, phần đầu phát triển và có đến 11 cặp chân (thông thường là 8 cặp) Chúng thường đẻ trứng trên các loài cây chủ, số lượng trứng là khác nhau

từ một vài cho đến một vài nghìn Trứng sau khi nở thành ấu trùng, các ấu trùng

ăn tất cả các phần của cây Ấu trùng phát triển nhanh với nhiều thế hệ trong một năm, tuy nhiên một số loài thời kỳ phát triển mất đến 3 năm Bộ cánh vảy gây hại nghiêm trọng cho nông nghiệp, chủ yếu là khi tuổi ấu trùng, chúng đục thân,

ăn lá làm tổn hại đến cây dẫn đến cây chết: sâu hại bắp ngô, sâu tơ hại rau, sâu

đục quả đậu rau

1.2.2 Côn trùng thử nghiệm

Sâu tơ

Sâu tơ (Plutella xylostella) thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera), họ ngài rau

(Plutellidae) hay còn gọi là sâu bay, sâu đu, sâu nhẩy dù

Sâu tơ phá hoại hầu hết các loại lá: xu hào, cải bắp, đậu tương Chúng được đánh giá là một loại sâu hại nghiêm trọng và có tính kháng thuốc trong nhiều nghiên cứu Sâu tơ phân bố rộng rãi, tính đến năm 1982 có tới 128 nước

và vùng lãnh thổ đã công bố thấy xuất hiện loài sâu này Sâu tơ sinh sản cao,

Trang 27

vòng đời ngắn, tính kháng thuốc nhanh Thiệt hại hàng năm do sâu tơ gây ra khoảng 30- 50% năng suất, chi phí phòng trừ chiếm 20-40% tổng chi phí đầu tư

nhất là trên bắp cải [3]

Đặc tính sinh học và hình thái của sâu tơ

Tùy theo nhiệt độ mà sâu tơ có chu kỳ sinh trưởng khác nhau, ở nhiệt độ

20 -300C thì vòng đời của chúng là 20 -30 ngày, ở nhiệt độ 15–200C thì vòng đời

là 40 ngày Đây là loài biến thái qua 4 pha: Trứng – sâu non – nhộng – trưởng

thành (Hình 1.5)

Thời trứng 2-3 ngày, hình bầu dục, màu vàng nhạt dài 4- 5mm, đường kính 0,3-0,5mm.Trứng đẻ rời rạc ở mặt dưới lá, gần gân chính và nở trong vòng 3–4 ngày.Thời kỳ sâu non 8-10 ngày, hình ống, màu xanh nhạt, dài 8- 10mm, đầu có màu nâu nhạt, trên các đốt có lông tơ Sâu non phát triển qua 4 tuổi.Tuổi 1: Thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm Đến cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ 1,2-1,5 mm Tuổi 1 phát triển từ 2-4 ngày.Tuổi 2: Mình sâu bắt đầu chuyển sang màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục Sâu dài từ 1,5-3,5 mm Ở tuổi 2 sâu phát triển trong thời gian từ 1-3 ngày.Tuổi 3: Mình sâu màu xanh lục tươi, dài từ 3,5-5,5 mm

và phát triển từ 1- 3 ngày.Tuổi 4: Sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể

từ 5,5-9 mm, phát triển từ 1-4 ngày Giai đoạn này sâu có màu xanh nhạt, hình ống với nhiều đốt, mỗi đốt đều có nhiều lông nhỏ Đầu màu nâu vàng có các phiến cứng, trên đó có các chấm mầu nâu nhạt Trên mảnh cứng của lưng ngực

có những chấm xếp thành hình chữ U

Thời kỳ nhộng 3- 4 ngày, nhộng có màu xanh hoặc vàng nhạt, dài 6-7mm

được bao bọc trong kén mỏng màu trắng xốp nằm dưới mặt lá

Thời kỳ trưởng thành 5-7 ngày, sâu trưởng thành (bướm) thân dài 10mm, sải cánh trung bình 15mm, cánh màu nâu xám, mép cánh trước có ba dấu hình tam giác màu nâu nhạt ngả trắng và có lông nhỏ dài mịn, khi đậu cánh sát thân Bướm ít bay mà thường di chuyển theo gió, hoạt động nhiều từ chập tối đến nửa đêm, mỗi con cái đẻ từ 50-400 trứng Trứng được đẻ riêng rẽ trên bề

Trang 28

mặt của lá Sâu non có 4 tuổi, sâu mới nở đục lá tạo thành rãnh, tuổi lớn ở mặt dưới của lá [3]

Hình 1.5 Vòng đời sâu tơ [3]

Đặc điểm gây hại

Sâu tơ thường gây hại cho các loại cây trồng thuộc họ cải Sâu non ăn lá, khi mật độ cao nó sẽ ăn thủng lá làm cho lá xơ xác, lá bị tổn thương mất khả năng quang hợp và giữ nước, cây phát triển kém và chết Sâu tơ phá hoại toàn

bộ lá của cây, đặc biệt quan trọng khi sâu tấn công ở giai đoạn mới trồng, sâu non nở đục tạo thành rãnh, ở tuổi sâu lớn ăn toàn bộ biểu bì phiến lá sẽ bị thủng

lỗ chỗ Sâu tơ gây hại quanh năm và gây hại nhiều nhất là vào vụ Đông xuân

Hình 1.6 Rau bắp cải bị sâu hại [3]

Định dạng
Số trang	57
Dung lượng	1,21 MB