Sâu tơ
Sâu tơ (Plutella xylostella) thuộc bộ cánh vảy (Lepidoptera), họ ngài rau (Plutellidae) hay còn gọi là sâu bay, sâu đu, sâu nhẩy dù.
Sâu tơ phá hoại hầu hết các loại lá: xu hào, cải bắp, đậu tương. Chúng được đánh giá là một loại sâu hại nghiêm trọng và có tính kháng thuốc trong nhiều nghiên cứu. Sâu tơ phân bố rộng rãi, tính đến năm 1982 có tới 128 nước và vùng lãnh thổ đã công bố thấy xuất hiện loài sâu này. Sâu tơ sinh sản cao,
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
vòng đời ngắn, tính kháng thuốc nhanh. Thiệt hại hàng năm do sâu tơ gây ra khoảng 30- 50% năng suất, chi phí phòng trừ chiếm 20-40% tổng chi phí đầu tư nhất là trên bắp cải [3].
Đặc tính sinh học và hình thái của sâu tơ
Tùy theo nhiệt độ mà sâu tơ có chu kỳ sinh trưởng khác nhau, ở nhiệt độ 20 -300C thì vòng đời của chúng là 20 -30 ngày, ở nhiệt độ 15–200C thì vòng đời là 40 ngày. Đây là loài biến thái qua 4 pha: Trứng – sâu non – nhộng – trưởng thành (Hình 1.5).
Thời trứng 2-3 ngày, hình bầu dục, màu vàng nhạt dài 4- 5mm, đường kính 0,3-0,5mm.Trứng đẻ rời rạc ở mặt dưới lá, gần gân chính và nở trong vòng 3–4 ngày.Thời kỳ sâu non 8-10 ngày, hình ống, màu xanh nhạt, dài 8- 10mm, đầu có màu nâu nhạt, trên các đốt có lông tơ. Sâu non phát triển qua 4 tuổi.Tuổi 1: Thân màu trắng đục, dài khoảng 0,8 mm. Đến cuối tuổi này cơ thể sâu dài từ 1,2-1,5 mm. Tuổi 1 phát triển từ 2-4 ngày.Tuổi 2: Mình sâu bắt đầu chuyển sang màu hơi xanh nhưng vẫn còn đục. Sâu dài từ 1,5-3,5 mm. Ở tuổi 2 sâu phát triển trong thời gian từ 1-3 ngày.Tuổi 3: Mình sâu màu xanh lục tươi, dài từ 3,5-5,5 mm và phát triển từ 1- 3 ngày.Tuổi 4: Sâu có màu xanh lục sậm hơn, kích thước cơ thể từ 5,5-9 mm, phát triển từ 1-4 ngày. Giai đoạn này sâu có màu xanh nhạt, hình ống với nhiều đốt, mỗi đốt đều có nhiều lông nhỏ. Đầu màu nâu vàng có các phiến cứng, trên đó có các chấm mầu nâu nhạt. Trên mảnh cứng của lưng ngực có những chấm xếp thành hình chữ U.
Thời kỳ nhộng 3- 4 ngày, nhộng có màu xanh hoặc vàng nhạt, dài 6-7mm được bao bọc trong kén mỏng màu trắng xốp nằm dưới mặt lá.
Thời kỳ trưởng thành 5-7 ngày, sâu trưởng thành (bướm) thân dài 6- 10mm, sải cánh trung bình 15mm, cánh màu nâu xám, mép cánh trước có ba dấu hình tam giác màu nâu nhạt ngả trắng và có lông nhỏ dài mịn, khi đậu cánh sát thân. Bướm ít bay mà thường di chuyển theo gió, hoạt động nhiều từ chập tối đến nửa đêm, mỗi con cái đẻ từ 50-400 trứng. Trứng được đẻ riêng rẽ trên bề
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
mặt của lá. Sâu non có 4 tuổi, sâu mới nở đục lá tạo thành rãnh, tuổi lớn ở mặt dưới của lá [3].
Hình 1.5. Vòng đời sâu tơ [3]
Đặc điểm gây hại
Sâu tơ thường gây hại cho các loại cây trồng thuộc họ cải. Sâu non ăn lá, khi mật độ cao nó sẽ ăn thủng lá làm cho lá xơ xác, lá bị tổn thương mất khả năng quang hợp và giữ nước, cây phát triển kém và chết. Sâu tơ phá hoại toàn bộ lá của cây, đặc biệt quan trọng khi sâu tấn công ở giai đoạn mới trồng, sâu non nở đục tạo thành rãnh, ở tuổi sâu lớn ăn toàn bộ biểu bì phiến lá sẽ bị thủng lỗ chỗ. Sâu tơ gây hại quanh năm và gây hại nhiều nhất là vào vụ Đông xuân.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Các nghiên cứu chỉ ra rằng sâu tơ là loại sâu hại nghiêm trọng có khả năng kháng thuốc cao. Trong cơ thể sâu tơ có loại men có thể phân giải thuốc thành chất không độc, đó là hệ men vi thể (microsonal enzyme system). Khi cơ thể sâu tiếp xúc với hóa chất độc, hệ men vi thể được kích thích hoạt động tăng 100- 200 lần [3].
Sâu xanh da láng
Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)có tên khoa học là Spodoptera
exigua Hubner, thuộc họ Noctuidae (Ngài Đêm), Lepidoptera (bộ Cánh Vảy).
Ở Việt Nam, nhất là ở vùng đồng bằng sông Cửu Long, từ năm 1981 sâu là đối tượng gây hại chính trên đậu nành, đậu xanh, hành, ớt và một số loại hoa màu ngắn ngày khác.Vòng đời của sâu khoảng 30 đến 40 ngày, chia thành 3 giai đoạn:
Giai đoạn trưởng thành: Bướm là loại bướm đêm, màu trắng xám, chiều dài thân từ 7-10 mm, sải cánh rộng từ 20-25 mm. Đầu màu xám, mang nhiều lông, hai mắt kép to, màu đen, râu đầu hình sợi chỉ, dài từ 5-6 mm. Ngực màu nâu đỏ, được phủ kín bởi một lớp phấn màu xám tro có ánh kim. Cánh trước màu xám hơi ngả nâu, thon dài, hình tam giác, góc cánh hơi bầu, có nhiều vân. Thời gian sống của bướm từ 5-10 ngày và một bướm cái có thể đẻ từ 300- 400 trứng trong vòng từ 3-5 ngày.
Trứng có hình cầu, đường kính từ 0,4-0,5mm, mới đẻ màu xanh đến vàng nhạt, sau chuyển sang màu trắng đục, sắp nở có một chấm đen trên vỏ trứng, đó là mắt của sâu. Trứng được đẻ thành từng ổ, trên phủ lớp lông màu trắng ngà. Thời gian ủ trứng từ 2-4 ngày.
Giai đoạn sâu non: Sâu có từ 5-6 tuổi, phát triển trong thời gian từ 10-19 ngày. Mặt lưng của sâu màu xanh và trơn láng nên còn có tên là "Sâu xanh da láng" để phân biệt với sâu xanh (Heliothis armigera). Chi tiết trong từng tuổi sâu như sau:
Tuổi 1: thân sâu có màu xanh lá cây hay vàng xanh, đầu đen bóng, mang nhiều lông, bụng màu vàng nhạt, cơ thể có chiều dài từ 1,2-1,5mm, thường phần đầu có chiều ngang lớn hơn chiều ngang thân mình và các sọc trên cơ thể chưa rõ ràng. Thời gian phát triển của sâu ở tuổi này từ 2-5 ngày.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Từ tuổi 2, màu sắc trên mình sâu bắt dầu thể hiện rõ dần. Bụng màu vàng xanh, các đốt trên thân phân biệt rõ dần. Mình sâu có 3 sọc màu trắng mờ, một sọc giữa lưng và 2 sọc ở hai bên thân, cả 3 sọc trên chạy từ đốt thứ nhất đến đốt cuối của bụng. Ở tuổi này sâu có kích thước cơ thể trung bình là 0,45x3,7mm. Thời gian phát triển của sâu tuổi 2 từ 2-4 ngày. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sang tuổi 3, lúc mới lột xác sâu có màu vàng xanh, sau chuyển sang màu xanh lá cây. Đầu màu vàng nhạt, bóng; vẫn còn mang nhiều lông. Các chấm trên mình sâu nhỏ dần, lông ngắn hơn. Thời gian phát triển của sâu ở tuổi này từ 2-3 ngày.
Sau khi nở sâu sống tập trung quanh ổ trứng, ăn phần diệp lục của lá thành những lổ nhỏ, chừa lại lớp biểu bì trắng. Cuối tuổi 1 sâu bắt đầu phân tán sang các lá lân cận. Ấu trùng tuổi 2 ăn lủng lá thành những lổ nhỏ và có tập quán nhả tơ buông mình xuống đất khi bị động. Ở tuổi 3 sâu ăn phá mạnh nhất, cắn lá thành những lổ to; sâu còn đeo trên các chùm hoa của cây đậu nành và ăn các cánh hoa vừa mới nhú. Ở những ruộng có mật số cao sâu ăn lá còn trơ gân chính và cuống và cả trái non [3].
Giai đoạn nhộng: Kéo dài từ 7–10 ngày, sâu thường hóa nhộng trong đất hoặc lùm cỏ khô.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu
2.1.1. Sinh phẩm
150 chủng Bt phân lập từ mẫu đất ở Thái Nguyên, chưa qua phân loại và xác định hình dạng tinh thể, do Phòng Di truyền vi sinh vật cung cấp.
E. coli DH5α được nhận từ Phòng Di truyền Vi sinh, Viện Công nghệ
Sinh học.
Sâu tơ (Plutella xylostella) và sâu xanh da láng (Spodoptera exigua)tuổi 2 do Viện Bảo vệ thực vật cung cấp.
Các cặp mồi được sử dụng để khuếch đại gene cry1C do phòng Di truyền vi sinh vật cung cấp.
- Cặp mồi đặc hiệu gene cry1C
TYIC 5’ – CAACCTCTATTTGGTGCAGGTTC 3’
TYIUNI 5’- TCACTGAGTCGCTTCGCATGTTTGACTTTCTC 3’ - Cặp mồi M13
Reverse M13: 5’- CAGGAAACAGCTATG – 3’ Forward M13: 3’- GTAAAACGACGGCCA – 5 ’ Vector tách dòng plasmid: pGEM-T Easy
Taq polymerase, enzyme giới hạn (EcoRI), ligase…của hãng Invitrogen, Fermentas.
2.1.2. Hóa chất và thiết bị
Hóa chất:
- Hóa chất sử dụng trong phân lập và nuôi cấy Bt: agar, cao thịt, cao nấm men, peptone, NaCl….
- Hóa chất sử dụng nhuộm bào tử và tinh thể: fuchsin base
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR: dNTPs, Taq polymease, đệm, nước khử ion…
Thiết bị:
Các thiết bị nghiên cứu gồm: Máy li tâm (Fresco, Đức), máy PCR (PTC- 100, Mỹ), máy vortex (IKA, Đức), máy lắc (Gerharat, Đức), máy soi gel (Vilber Lourmat, Đức), máy chụp gel (Gen Doc), kính hiển vi (Olympus, Nhật), tủ lạnh sâu (Frigo, Đan Mạch)
Ngoài ra chúng tôi cũng sử dụng một số dụng cụ khác phục vụ cho quá trình nghiên cứu như: đĩa petri, bình tam giác, pipet
Môi trƣờng:
Các loại môi trường đã sử dụng trong quá trình thực hiện thí nghiệm:
Môi trƣờng MPA- MT1 (g/l) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Agar: 20g Pepton: 10g Nước cất: 1l NaCl: 5g Cao thịt: 4g pH: 7
Môi trƣờng MPB- MT2 (g/l)
Pepton: 10g Nước cất: 1l pH: 7 NaCl: 5g Cao thịt: 4g
Môi trƣờng Craige- MT3 (g/l)
Bacto agar: 8g Pepton: 10g Nước cất: 1l NaCl: 5g Cao thịt: 4g pH: 7
Môi trƣờng LB- MT4 (g/l)
Trypton: 10g Nước cất: 1l pH: 7 NaCl: 5g Cao men: 4g
Môi trƣờng LBA- MT5 (g/l)
Agar: 20g Trypton: 10g Nước: 1l NaCl: 5g Cao men: 4g pH: 7
Các loại dung dịch:
Các dung dịch dùng trong tách chiết DNA plasmid
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
EDTA, pH = 8.0: 10mM Glucose: 50mM
Dung dịch Sol II: NaOH: 20mM. SDS: 1%
Dung dịch Sol III: CH3COOK: 60ml CH3COOH: 11,5ml H2O: 28,5ml
Các dung dịch dung trong điện di trên gel agarose
Dung dịch TE: Tris HCl 10mM, pH= 8.0 EDTA 1mM, pH= 8.0
Dung dịch đệm điện di TAE 50X: Tris base 121g
Acid acetic 5M: 28.6 ml EDTA 0.5M pH=8.0: 50ml Nước khử ion đủ 500ml
Dung dịch đệm tra mẫu DNA (loading buffer) 5X: Tris HCl 1M pH= 8.0: 1ml EDTA 0.5M pH=8.0: 2ml Glycerol: 2ml
Bromphenol blue 1%: 2ml
Gel điện di agarose 1%: agarose 1g, TAE 1X: 100ml
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Phân loại các chủng Bt bằng phản ứng huyết thanh
Phương pháp phân loại Bt bằng phản ứng huyết thanh dựa trên đặc tính huyết thanh học của chủng Bt, nghĩa là dựa trên kháng nguyên tiêm mao H và được tiến hành bằng phản ứng ngưng kết các tế bào sinh dưỡng với kháng huyết thanh tương ứng. Phương pháp này cho phép xác định dưới loài Bt, tạo điều kiện thuận lợi cho việc lựa chọn các chủng Bt có hoạt tính cao với các bộ côn trùng. Các chủng Bt tham gia vào phản ứng ngưng kết huyết thanh phải là các chủng
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
có khả năng chuyển động. Do vậy, trước khi tiến hành phương pháp này, chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng chuyển động của các chủng nghiên cứu trên môi trường MT3 [30].
Cách tiến hành: các chủng Bt được cấy vào trong ống Craige (là ống thủy tinh nhỏ, được cắm thẳng đứng vào môi trường Craige chứa trong ống nghiệm to), nuôi ở 37ºC trong 24-28 giờ. Khi đó, những tế bào có khả năng chuyển động sẽ di chuyển lên phía trên bề mặt môi trường, giữa ống Craige và ống nghiệm. Vi khuẩn phát triển ở bề mặt này sẽ được cấy vào ống nghiệm có chứa 2ml môi trường MT2, lắc ở 70–75 vòng/phút trong khoảng thời gian 12-15 giờ [30]. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh tương ứng được quan sát trên kính hiển vi: lấy 2µl dịch nuôi nhỏ lên phiến kính lõm để kiểm tra khả năng chuyển động của vi khuẩn, sau đó nhỏ tiếp 2µl huyết thanh chuẩn (đã pha loãng) và quan sát dưới kính hiển vi.
2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt
Cấy các chủng Bt ra từng đĩa môi trường MPA riêng rẽ, nuôi ở 28ºC sau 3 ngày để thu sinh khối. Sinh khối vi khuẩn được xử lý ở 70ºC trong 10 phút, sau đó pha loãng đến nồng độ 10-8
lấy 100µl dịch ở mỗi nồng độ pha loãng 10-7 và 10-8 cấy thảm trên đĩa petri chứa môi trường MPA. Nuôi ở 28ºC trong 24h, đếm số khuẩn lạc mọc trên đĩa có nồng độ pha loãng nhỏ nhất. Số lượng bào tử được tính theo công thức:
CFU = n . a . 10
CFU: số lượng bào tử trong 1 ml dịch nuôi cấy.
n: số khuẩn lạc trung bình tạo thành trong 100µl dịch pha loãng a: nồng độ pha loãng.
2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm
Để đánh giá khả năng tiêu diệt côn trùng bộ cánh vảy của các chủng nghiên cứu, chúng tôi tiến hành thử nghiệm trên đối tượng sâu xanh da láng
(Spodoptera exigua) và sâu tơ (Plutella xylostella) theo phương pháp của Thiery
và Frachon ở nồng độ 107
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
105 và 107 bào tử/ml đối với sâu tơ 105. Mỗi nồng độ thử nghiệm với 3 đĩa petri và mỗi đĩa 10 con sâu tơ và 3 con sâu đối với sâu xanh da láng [34].
Chuẩn bị:
Các chủng Bt được cấy thảm trên môi trường MPA, nuôi ở 280C trong 72 giờ. Sau đó, sinh khối được thu vào ống eppendorf chứa 1ml nước cất vô trùng. Pha loãng mật độ bào tử ở nồng độ 105 đến 107 bào tử/ml để thử hoạt tính.
Lá cải xanh hoặc lá bắp cải sạch (không phun thuốc trừ sâu, không sâu bệnh) rửa sạch và tráng qua bằng nước cất, để khô tự nhiên, cắt lá với diện tích đều nhau sao cho vừa đĩa petri. Nhúng lá vừa cắt vào dịch Bt đã pha loãng và để 10 phút cho hai mặt lá được ngấm hết dịch Bt, lấy ra để khô ở nhiệt độ phòng. Sau đó cho lá đã khô dịch vào các đĩa petri, mỗi đĩa thử 10 con hoặc 3 con sâu xanh da láng. Nuôi ở nhiệt độ phòng và nơi thoáng mát và theo dõi tỉ lệ sâu chết trong 3 ngày.
Tỉ lệ sâu chết được tính theo công thức Abbott:
A = (C – T)/C. 100
A: % sâu chết
C: số sâu sống ở mẫu đối chứng T: số sâu sống ở mẫu thí nghiệm.
2.2.4Tách chiết DNA plasmid
- Nuôi vi khuẩn trong môi trường MPB ở 28°C, lắc 200 vòng/phút, qua đêm.
- Lấy 1,5ml dịch nuôi cấy ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, thu cặn.
- Bổ sung 150µl dung dịch sol I, vortex.
- Bổ sung 150µl dung dich sol II, đảo nhẹ bằng tay.
- Bổ sung 150µl dung dịch sol III, lắc mạnh cho tủa hòa tan. - Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, 4ºC, thu dịch nổi. - Bổ sung 1ml cồn tuyệt đối
- Tủa ở - 20°C trong 4 giờ.
- Ly tâm 10000 vòng/phút trong 10 phút, thu tủa. - Làm khô tự nhiên.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Đẩy nước lên tới 500µl.
- Bổ sung chloroform: isoamylalcohol (24:1); tỷ lệ 1: 1, đảo bằng tay. - Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút, 4ºC, thu dịch nổi
- Bổ sung NaOAC/KOAC, tỷ lệ 1: 10. - Bổ sung cồn tuyệt đối, tỷ lệ 2,5: 1. - Ủ ở -20ºC trong ít nhất 4h.