Phương pháp PCR do Karl Mulis và cộng sự phát hiện năm 1985. Nhờ enzym DNA polymerase xúc tác, trên các mạch khuôn DNA tổng hợp nên các mạch đơn mới. Các mạch đơn mới được tổng hợp lại được sử dụng làm khuôn cho quá trình tổng hợp mạch mới ở chu kỳ tiếp theo. Sự tổng hợp mạch đơn DNA mới cần có sự tham gia của DNA mồi tạo các nhóm 3’-OH tự do. Các nucleotide được gắn ở vị trí nhóm OH tự do tạo thành mạch đơn mới.
Thành phần 1 phản ứng PCR: dNTPs 2µl Đệm (có Mg2+ ) 2µl Mồi 1C F 1µl Mồi 1R 1µl Taq polymease 0,2µl DNA Temp 2µl dH2O 11,8µl Thể tích/phản ứng: 20µl
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%.
2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C
Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy
Sản phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector tách dòng nhờ enzyme nối T4- DNA ligase. Thành phần phản ứng gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng: Đệm 5µl Vector 1µl T4-DNA ligase 1µl Sản phẩm PCR 3µl
Phản ứng ghép nối được tiến hành 14 - 16h ở 4ºC.
Biến nạp plasmid tái tổ hợp vào E. coli DH5α
Nguyên tắc: Dưới tác dụng của CaCl2 thành tế bào đang ở thời kỳ sinh trưởng trở nên xốp tạo điều kiện cho DNA có thể chui qua lỗ màng vào tế bào chất khi sốc nhiệt.
Quy trình gồm 2 bước + Chuẩn bị tế bào khả biến:
- Nuôi cấy 1 khuẩn lạc E. coli DH5α trong môi trường LB lỏng qua đêm. - Chuyển 0,5ml dịch nuôi cấy tế bào qua đêm sang 50ml môi trường LB. - Lắc 200 vòng/phút trong 2h ở 37ºC. Đo OD600 đạt 0,5-0,6 thì hút lấy mẫu vào ống eppendorf đặt trên đá 1h. Sau bước này mọi thao tác luôn phải được thực hiện ở 4ºC.
- Mẫu sau đặt đá 1h được ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút, loại dịch nổi. Hòa tế bào thu được trong 1-1,5ml CaCl2 100mM vô trùng, vortex và ly tâm thu tủa ở 6000 vòng/phút trong 10 phút.
- Hòa tan lại tủa trong 1,5ml CaCl2 100mM, vortex, ủ mẫu trên đá trong 2h, cứ 15 phút đảo 1 lần.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
- Ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút ở 4ºC, hòa tế bào trong 60µl CaCl2
100 mM, bổ sung 15% glycerol. - Bảo quản tế bào ở - 80ºC + Biến nạp:
- Lấy tế bào khả biến từ - 80ºC để vào đá 30 phút.
- Hút 5µl sản phẩm của phản ứng nối ghép gene vào dung dịch tế bào khả biến và trộn đều, để đá 30 phút (nhằm tạo cho hỗn hợp có một nhiệt độ thấp nhất định và tạo điều kiện cho vector tái tổ hợp tiếp cận tế bào một cách đồng đều).
- Sốc nhiệt ở 42ºC trong 60-90 giây sau đó giữ trong đá 2 phút.
- Bổ sung 200-300µl môi trường LB và lắc ở 37ºC, 200 vòng/phút trong 1- 1,5 giờ.
- Trải 150µl sản phẩm trên đĩa petri chứa môi trường LBA bổ sung ampicilin + X- gal, nuôi ở 37ºC từ 14-16h.
Sàng lọc khuẩn lạc bằng PCR colony
Các thành phần PCR colony tương tự như phản ứng khuếch đại gene cry1C
với mồi đặc hiệu, chỉ khác ở chỗ khuôn DNA được thay thế bằng một lượng nhỏ sinh khối từ các khuẩn lạc trắng và sử dụng cặp mồi M13.
Tách DNA plasmid từ E. coli DH5α
Lấy khuẩn lạc vi khuẩn chứa plasmid tái tổ hợp (khuẩn lạc màu trắng) cấy vào 2ml môi trường LB chứa ampicillin, lắc qua đêm 200 vòng/phút ở 37ºC.
Qui trình tách tương tự như quy trình tách DNA plasmid của Bt
Xử lý DNA plasmid bằng enzyme giới hạn EcoRI
Để xác định chính xác vector tái tổ hợp có mang đoạn gene mong muốn hay không, cắt đoạn DNA đã ghép nối vào plasmid bằng EcoRI.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thành phần của phản ứng cắt: Thành phần Thể tích (µl) DNA plasmid 6µl Buffer 1µl EcoRI 0,5µl dH2O 2.5µl Tổng thể tích 10µl
Phản ứng cắt được tiến hành ở 37ºC trong 4h.