Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vả

VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH Hà Nội, 2012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu kết luận văn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiền Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Đình Bính -Trưởng phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt thời gian thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn cán phòng Di truyền Vi sinh vật, tận tình bảo giúp đỡ hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè, người bên cạnh động viên, ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi giúp học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày …tháng…năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Hiền Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng B thuringiensis 1.1.2 Đặc điểm hình thái Bt 1.1.3 Đặc điểm sinh hoá 1.1.4 Đặc điểm phân loại 1.1.5 Phân loại gene độc tố vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.6 Các loại độc tố Bacillus thuringiensis 11 1.1.7 Cấu trúc nhóm độc tố tinh thể 13 1.1.8 Cơ chế tác động protein tinh thể lên côn trùng 14 1.1.9 Nghiên cứu ứng dụng Bt Việt Nam 15 1.1.10 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình hình thành bào tử tinh thể độc 16 1.1.11.Gene cry1C loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai 18 1.2 Đại cƣơng côn trùng cánh vảy 19 1.2.1 Côn trùng cánh vảy 19 1.2.2 Côn trùng thử nghiệm 19 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu 24 2.1.1 Sinh phẩm 24 2.1.2 Hóa chất thiết bị 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phân loại chủng Bt phản ứng huyết 26 2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt 27 2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm 27 2.2.4 Tách chiết DNA plasmid 28 2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C PCR 29 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C 30 2.2.7 Xác định trình tự nucleotide 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai mang gene cry1C có hoạt tính diệt sâu xanh da láng sâu tơ 33 3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể chủng Bt nghiên cứu 33 3.1.2 Phân loại Bt huyết 35 3.1.3 Hoạt tính diệt chủng Bta sâu xanh da láng sâu 36 Nồng độ bào tử 36 Hoạt tính chủng Bta diệt sâu xanh da láng sâu tơ 37 3.2 Tách dòng đọc trình tự đoạn gene cry1C 39 3.2.1 Khuếch đại gene cry1C chủng Bta PCR 39 3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C 40 3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C 44 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ Amp Ampicillin Bp Base pair Bt Bacillus thuringiensis Bta Bacillus thuringiensis subspecies aizawai dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleotide acid E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid OD Optical density 10 PCR Polymerase chain reaction 11 SDS Sodium dodecyl sulphate 12 Sol Solution 13 TE Tris EDTA 14 X-gal 5- Bromo- Chloro- indolyl β- D- galactoside Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân loại gene cry Bt………………………………………… 10 Bảng 3.1 Sự đa dạng hình thái tinh thể chủng Bt… 34 Bảng 3.2 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta sau ngày thử nghiệm 37 Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bt sau ngày thử nghiệm 38 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bào tử tinh thể B thuringiensis …………………… … Hình 1.2 Tinh thể vi khuẩn B thuringiensis Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không gian chiều protein độc tố Cry1Ac 14 Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu vi khuẩn B thuringiensis …… ………… 15 Hình 1.5 Vòng đời sâu tơ ……………… …………………………….…… 21 Hình 1.6 Rau bắp cải bị sâu hại …………… …………………………… 21 Hình 1.7 Vòng đời sâu xanh da láng …………… ……… …………… 23 Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc Bt môi trường MPA sau 72h nuôi 28ºC 33 Hình 3.2 Hình dạng bào tử tinh thể Bt phóng đại 1000 lần 34 Hình 3.3 Ngưng kết chủng TN 6.12 phân lập với type huyết kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần…………………………………… 36 Hình 3.4 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta nghiên cứu 37 Hình 3.5 Hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bta nghiên cứu……………… 38 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR chủng Bta nghiên cứu………… 39 Hình 3.7 Khuẩn lạc xanh, trắng xuất môi trường LBA sau nuôi cấy qua đêm……………………………………………………………………………… 41 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13…………………… 42 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ dòng khuẩn lạc agarose 1% 43 Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ DNA plasmid tái tổ hợp….…44 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm không khí cao điều kiện thuận lợi cho loài sâu hại nông - lâm nghiệp phát triển Côn trùng cánh vảy lớn lớp côn trùng gồm bướm bướm đêm, 180.000 loài mô tả có mặt khắp nơi giới, chúng gây thiệt hại nghiêm trọng kinh tế nông nghiệp nước nhà Để bảo vệ suất trồng, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa học với nồng độ cao để phun sau dịch sâu hại bùng phát Trung bình hectar trồng phải phun từ 5–7 kg thuốc Tuy nhiên, việc sử dụng tràn lan loại hóa chất diệt côn trùng để lại dư lượng thuốc nông phẩm, gây độc hại sức khỏe người sử dụng gây ô nhiễm môi trường Thay vào biện pháp hóa học biện pháp sinh học khuyến khích sử dụng Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus thurinngiensis (Bt) chiếm 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học giới hoàn toàn không độc với người, động vật môi trường [24] Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai (Bta) nghiên cứu nhiều 82 loài Bacillus thuringiensis Bacillus thurigiensis subsp aizawai có khả sinh tổng hợp protein tinh thể gây độc với côn trùng cánh vảy (Lepidoptera), có loài sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh (Helicoverpa armigera Hibber), sâu khoang (Spodoptera litura) số côn trùng cánh (Diptera) Cry1C loại protein thể độc Bta sinh trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng cánh vảy mạnh Vì vậy, để sản xuất thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng cánh vảy chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng cánh vảy vào trồng, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy’’ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.1 Mục tiêu - Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai (Bta) có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy - Tách dòng đọc trình tự gene cry1C chủng Bta sàng lọc có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy 1.2 Nội dung - Thu thập chủng B thuringiensis phân lập số địa điểm Thái Nguyên - Sàng lọc chủng Bt có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy phương pháp huyết học - Thử hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy chủng Bta thu nhận - Phát chủng Bta mang gene cry1C từ chủng có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy phương pháp PCR - Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy - Xác định trình tự đoạn gene cry1C tách dòng so sánh với trình tự gene Gene Bank Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng B thuringiensis  Trên giới B thuringiensis vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng nhà khoa học Nhật Bản Ishitawa phát năm 1901 ông nghiên cứu bệnh tằm dâu, phát nguyên nhân gây bệnh cho tằm loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus Ông đặt tên vi khuẩn Bacillus sotto [8] Năm 1911, Berliner (người Đức) phân lập loại vi khuẩn gây bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải vùng Thuringien ông đặt tên Bacillus thuringiensis năm 1915 [8] Năm 1930, Bacillus thuringiensis thử nghiệm chống sâu đục thân Châu Âu Năm 1938, chế phẩm Bt sản xuất lần để diệt sâu hại lúa mì Pháp Năm 1953, Hannay Fitzjame phát thể vùi công bố tinh thể có chất protein [8] Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) sản xuất thuốc “Thuricide” với khối lượng lớn từ chủng B thuringiensis subsp kurstaki Năm 1956, Angus chứng minh hoạt tính diệt sâu tinh thể tách từ tế bào bào tử [33] Năm 1962, de Barjac Bonnefoi đưa phương pháp phân loại cho chủng Bt Bacilus sphaericus (Bs) phương pháp huyết Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh phát chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... trồng, tiến hành đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy’’ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn... diệt côn trùng cánh vảy chủng Bta thu nhận - Phát chủng Bta mang gene cry1C từ chủng có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy phương pháp PCR - Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn. .. côn trùng cánh vảy mạnh Vì vậy, để sản xuất thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng cánh vảy chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng cánh vảy vào trồng, tiến hành đề tài: “Nghiên