Luận văn Thạc sỹ Sinh học Nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng Bacillus Thuringiensis sinh Protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy

Header Page of 16 VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT - NGUYỄN THỊ HIỀN NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA MỘT SỐ CHỦNG Bacillus thuringiensis SINH PROTEIN TINH THỂ DIỆT CÔN TRÙNG CÁNH VẢY LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGÔ ĐÌNH BÍNH Hà Nội, 2012 Footer Page of 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu khoa học Các số liệu kết luận văn trung thực chưa công bố công trình nghiên cứu khác Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hiền Footer Page of 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Ngô Đình Bính -Trưởng phòng Di truyền Vi sinh vật, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, người thầy tận tình hướng dẫn, tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ suốt thời gian thực hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin chân thành cảm ơn cán phòng Di truyền Vi sinh vật, tận tình bảo giúp đỡ hoàn thành luận văn tốt nghiệp Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình bạn bè, người bên cạnh động viên, ủng hộ, tạo điều kiện thuận lợi giúp học tập hoàn thành luận văn Hà Nội, ngày …tháng…năm 2012 Học viên Nguyễn Thị Hiền Footer Page of 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng B thuringiensis 1.1.2 Đặc điểm hình thái Bt 1.1.3 Đặc điểm sinh hoá 1.1.4 Đặc điểm phân loại 1.1.5 Phân loại gene độc tố vi khuẩn Bacillus thuringiensis 1.1.6 Các loại độc tố Bacillus thuringiensis 11 1.1.7 Cấu trúc nhóm độc tố tinh thể 13 1.1.8 Cơ chế tác động protein tinh thể lên côn trùng 14 1.1.9 Nghiên cứu ứng dụng Bt Việt Nam 15 1.1.10 Các yếu tố ảnh hưởng tới trình hình thành bào tử tinh thể độc 16 1.1.11.Gene cry1C loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai 18 1.2 Đại cƣơng côn trùng cánh vảy 19 1.2.1 Côn trùng cánh vảy 19 1.2.2 Côn trùng thử nghiệm 19 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Vật liệu 24 2.1.1 Sinh phẩm 24 2.1.2 Hóa chất thiết bị 24 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.2.1 Phân loại chủng Bt phản ứng huyết 26 2.2.2 Xác định mật độ bào tử Bt 27 2.2.3 Thử hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm 27 2.2.4 Tách chiết DNA plasmid 28 2.2.5 Sàng lọc chủng Bt mang gene cry1C PCR 29 Footer Page of 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 2.2.6 Tách dòng đoạn gene cry1C 30 2.2.7 Xác định trình tự nucleotide 32 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 33 3.1 Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai mang gene cry1C có hoạt tính diệt sâu xanh da láng sâu tơ 33 3.1.1 Phân loại hình dạng tinh thể chủng Bt nghiên cứu 33 3.1.2 Phân loại Bt huyết 35 3.1.3 Hoạt tính diệt chủng Bta sâu xanh da láng sâu 36 Nồng độ bào tử 36 Hoạt tính chủng Bta diệt sâu xanh da láng sâu tơ 37 3.2 Tách dòng đọc trình tự đoạn gene cry1C 39 3.2.1 Khuếch đại gene cry1C chủng Bta PCR 39 3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C 40 3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C 44 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Footer Page of 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 BẢNG NHỮNG TỪ VIẾT TẮT STT Viết tắt Viết đầy đủ Amp Ampicillin Bp Base pair Bt Bacillus thuringiensis Bta Bacillus thuringiensis subspecies aizawai dH2O Nước khử ion DNA Deoxyribonucleotide acid E coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid OD Optical density 10 PCR Polymerase chain reaction 11 SDS Sodium dodecyl sulphate 12 Sol Solution 13 TE Tris EDTA 14 X-gal 5- Bromo- Chloro- indolyl β- D- galactoside Footer Page of 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1 Phân loại gene cry Bt………………………………………… 10 Bảng 3.1 Sự đa dạng hình thái tinh thể chủng Bt… 34 Bảng 3.2 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta sau ngày thử nghiệm 37 Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bt sau ngày thử nghiệm 38 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Bào tử tinh thể B thuringiensis …………………… … Hình 1.2 Tinh thể vi khuẩn B thuringiensis Hình 1.3 Mô hình cấu trúc không gian chiều protein độc tố Cry1Ac 14 Hình 1.4 Cơ chế diệt sâu vi khuẩn B thuringiensis …… ………… 15 Hình 1.5 Vòng đời sâu tơ ……………… …………………………….…… 21 Hình 1.6 Rau bắp cải bị sâu hại …………… …………………………… 21 Hình 1.7 Vòng đời sâu xanh da láng …………… ……… …………… 23 Hình 3.1 Hình dạng khuẩn lạc Bt môi trường MPA sau 72h nuôi 28ºC 33 Hình 3.2 Hình dạng bào tử tinh thể Bt phóng đại 1000 lần 34 Hình 3.3 Ngưng kết chủng TN 6.12 phân lập với type huyết kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần…………………………………… 36 Hình 3.4 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta nghiên cứu 37 Hình 3.5 Hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bta nghiên cứu……………… 38 Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR chủng Bta nghiên cứu………… 39 Hình 3.7 Khuẩn lạc xanh, trắng xuất môi trường LBA sau nuôi cấy qua đêm……………………………………………………………………………… 41 Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13…………………… 42 Hình 3.9 Điện di đồ sản phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ dòng khuẩn lạc agarose 1% 43 Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ DNA plasmid tái tổ hợp….…44 Footer Page of 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Việt Nam có khí hậu nhiệt đới gió mùa, với độ ẩm không khí cao điều kiện thuận lợi cho loài sâu hại nông - lâm nghiệp phát triển Côn trùng cánh vảy lớn lớp côn trùng gồm bướm bướm đêm, 180.000 loài mô tả có mặt khắp nơi giới, chúng gây thiệt hại nghiêm trọng kinh tế nông nghiệp nước nhà Để bảo vệ suất trồng, người nông dân thường sử dụng thuốc hóa học với nồng độ cao để phun sau dịch sâu hại bùng phát Trung bình hectar trồng phải phun từ 5–7 kg thuốc Tuy nhiên, việc sử dụng tràn lan loại hóa chất diệt côn trùng để lại dư lượng thuốc nông phẩm, gây độc hại sức khỏe người sử dụng gây ô nhiễm môi trường Thay vào biện pháp hóa học biện pháp sinh học khuyến khích sử dụng Hiện nay, thuốc trừ sâu sinh học từ Bacillus thurinngiensis (Bt) chiếm 90% thị phần thuốc trừ sâu sinh học giới hoàn toàn không độc với người, động vật môi trường [24] Dưới loài Bacillus thuringiensis subsp aizawai (Bta) nghiên cứu nhiều 82 loài Bacillus thuringiensis Bacillus thurigiensis subsp aizawai có khả sinh tổng hợp protein tinh thể gây độc với côn trùng cánh vảy (Lepidoptera), có loài sâu tơ (Plutella xylostella), sâu xanh (Helicoverpa armigera Hibber), sâu khoang (Spodoptera litura) số côn trùng cánh (Diptera) Cry1C loại protein thể độc Bta sinh trình hình thành bào tử, có hoạt tính chống lại côn trùng cánh vảy mạnh Vì vậy, để sản xuất thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng cánh vảy chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng cánh vảy vào trồng, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy’’ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page of 16 Mục tiêu nội dung nghiên cứu 1.1 Mục tiêu - Sàng lọc chủng Bacillus thuringiensis subsp aizawai (Bta) có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy - Tách dòng đọc trình tự gene cry1C chủng Bta sàng lọc có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy 1.2 Nội dung - Thu thập chủng B thuringiensis phân lập số địa điểm Thái Nguyên - Sàng lọc chủng Bt có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy phương pháp huyết học - Thử hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy chủng Bta thu nhận - Phát chủng Bta mang gene cry1C từ chủng có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy phương pháp PCR - Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy - Xác định trình tự đoạn gene cry1C tách dòng so sánh với trình tự gene Gene Bank Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 10 of 16 Chƣơng TỔNG QUAN 1.1 Đại cƣơng Bacillus thuringiensis 1.1.1 Lịch sử nghiên cứu ứng dụng B thuringiensis  Trên giới B thuringiensis vi khuẩn có hoạt tính diệt côn trùng nhà khoa học Nhật Bản Ishitawa phát năm 1901 ông nghiên cứu bệnh tằm dâu, phát nguyên nhân gây bệnh cho tằm loại vi khuẩn thuộc chi Bacillus Ông đặt tên vi khuẩn Bacillus sotto [8] Năm 1911, Berliner (người Đức) phân lập loại vi khuẩn gây bệnh từ xác ấu trùng bướm phấn Địa Trung Hải vùng Thuringien ông đặt tên Bacillus thuringiensis năm 1915 [8] Năm 1930, Bacillus thuringiensis thử nghiệm chống sâu đục thân Châu Âu Năm 1938, chế phẩm Bt sản xuất lần để diệt sâu hại lúa mì Pháp Năm 1953, Hannay Fitzjame phát thể vùi công bố tinh thể có chất protein [8] Năm 1957, công ty Sandoz (Thụy Sỹ) sản xuất thuốc “Thuricide” với khối lượng lớn từ chủng B thuringiensis subsp kurstaki Năm 1956, Angus chứng minh hoạt tính diệt sâu tinh thể tách từ tế bào bào tử [33] Năm 1962, de Barjac Bonnefoi đưa phương pháp phân loại cho chủng Bt Bacilus sphaericus (Bs) phương pháp huyết Năm 1970, công nghiệp sản xuất Bt phát triển mạnh phát chủng Btk HD1 có hoạt tính diệt sâu cao Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 10 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 43 of 16 A B Hình 3.3 Sản phẩm ngƣng kết huyết chủng TN 6.12 phân lập với typ huyết dƣới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 lần A: Trước nhỏ huyết miễn dịch B: Sau nhỏ huyết miễn dịch 3.1.3 Hoạt tính diệt chủng Bta sâu xanh da láng sâu tơ Nồng độ bào tử Bt giai đoạn tạo bào tử đồng thời sinh tổng hợp tinh thể độc Thông qua nồng độ bào tử gián tiếp ước lượng nồng độ tinh thể chủng nghiên cứu Do tiến hành xác định nồng độ bào tử chủng Bta nghiên cứu với chủng Bta chuẩn 4J4 làm đối chứng dương Nồng độ bào tử chủng Bta dao động từ 2,5109 đến 5109 bào tử/ml Chúng chọn chủng Bta TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN5.3, TN 6.12, TN 28.6 TN 36.3 có nồng độ bào tử cao để xác định hoạt tính diệt côn trùng thử nghiệm Sinh khối chủng Bta pha loãng nhiều lần, sử dụng nồng độ 105 107 bào tử/ml để thử hoạt tính diệt sâu tơ nồng độ 107 109 bào tử/ml diệt sâu xanh da láng Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 43 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 44 of 16 Hoạt tính chủng Bta diệt sâu xanh da láng sâu tơ  Hoạt tính diệt sâu da láng Bảy chủng Bta đươc pha loãng tới nồng độ 107 109 bào tử/ml nước cất vô trùng Tiến hành thử nghiệm đối tượng sâu xanh da láng theo công thức Abbott Tỷ lệ sâu chết tính sau ngày thử nghiệm Kết thử nghiệm trình bày Hình 3.4 Bảng 3.2 Hình 3.4 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta nghiên cứu Bảng 3.2 Hoạt tính diệt sâu xanh da láng chủng Bta sau ngày thử nghiệm STT Tên chủng Tỷ lệ sâu chết (%) nồng độ 107 bào tử/ml nồng độ 109 bào tử/ml ĐC âm 0 ĐC dương (4J4) 33 78 TN 1.12 22 56 TN 3.4 11 22 TN 4.4 11 33 TN 5.3 11 44 TN 6.12 22 56 TN 28.6 22 67 TN 36.3 22 55 Bảng 3.2 cho thấy chủng Bta có hoạt tính diệt sâu xanh da láng Sau ngày thử nghiệm, chủng TN1.12, TN6.12, TN28.6 TN 36.3 có hoạt tính Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 44 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 45 of 16 diệt sâu xanh da láng 50% nồng độ 109 bào tử/ml Các kết thử hoạt tính diệt sâu sở để tiến hành nghiên cứu  Hoạt tính diệt sâu tơ Với chủng Bta lựa chọn được, thử nghiệm diệt sâu tơ, tỷ lệ sâu chết theo dõi ngày tính toán theo công thức Abbott Kết thử nghiệm trình bày Hình 3.5 Bảng 3.3 Hình 3.5 Hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bta nghiên cứu Bảng 3.3: Hoạt tính diệt sâu tơ chủng Bt sau ngày thử nghiệm Tỷ lệ sâu chết (%) Tên chủng Ở nồng độ 105 Ở nồng độ 107 bào tử/ml bào tử/ml ĐC âm 0 ĐC dương (4J4) 77 93 TN 1.12 53 80 TN 3.4 63 83 TN 4.4 50 77 TN 5.3 53 80 TN 6.12 57 80 TN 28.6 60 87 TN 36.3 53 83 STT Bảng 3.3 cho thấy tất chủng Bta TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN5.3, TN 6.12, TN 28.6 TN 36.3 lựa chọn có hoạt tính diệt sâu tơ tương đối cao Sau ngày thử hoạt tính đa số chủng cho tỷ lệ sâu chết lớn 50%, hai nồng độ pha loãng Đặc biệt tất chủng trừ TN 4.4 thử nồng độ 107 bào tử/ml có tỷ lệ sâu chết lên tới 80% Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 45 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 46 of 16 Qua kết thử hoạt tính chủng Bta diệt loại côn trùng thử nghiệm kết luận sau: - chủng Bta nghiên cứu có hoạt tính diệt loại côn trùng thử nghiệm - Các chủng TN28.6,TN1.12, TN6.12, TN36.3 có hoạt tính diệt cao loại côn trùng thử nghiệm Các kết thử hoạt tính diệt sâu nói sở để tiến hành nghiên cứu gene mã hóa độc tố tinh thể 3.2 Tách dòng đọc trình tự đoạn gene cry1C 3.2.1 Khuếch đại gene cry1C chủng Bta PCR Nhóm gene cry1C mã hóa protein tinh thể có khả diệt côn trùng cánh vảy Để phát gene độc tố sử dụng phương pháp PCR nhằm khuếch đại đoạn gene cry1C chủng Bta có hoạt tính diệt sâu với cặp mồi đặc hiệu Theo tính toán lý thuyết, sản phẩm đoạn gene cry1C với cặp mồi đặc hiệu có kích thước 288 bp Sản phẩm PCR điện di kiểm tra gel agarose 1% (Hình 3.6) Hình 3.6 Điện di đồ sản phẩm PCR chủng Bta nghiên cứu Giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8: TN 1.12, TN 3.4, TN 4.4, TN 5.3, TN 6.12, TN 28.6, TN 36.3, ĐC dương M: DNA Marker Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 46 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 47 of 16 Hình 3.6 cho thấy sản phẩm PCR có băng với kích thước khoảng 300 bp Như chủng thuộc loài Bta nghiên cứu mang gene cry1C Để khẳng định chủng chắn mang gene cry1C hay không, chọn chủng TN 6.12 TN 28.6 để tách dòng đoạn gene cry1C xác định trình tự chúng 3.2.2 Tách dòng đoạn gene cry1C Gắn sản phẩm PCR vào vector tách dòng pGEM-T Easy Vector pGEM-T Easy tồn dạng mạch thẳng với đầu tự thừa nucleotide T nên dễ dàng bắt cặp theo nguyên tắc bổ sung với đầu so le A sản phẩm PCR (Taq polymerase có hoạt tính gắn thêm adenine vào đầu 3’ kết thúc PCR) chọn vector pGEM-T Easy làm vector tách dòng Đoạn gene tính toán theo lý thuyết 288 bp thu từ sản phẩm PCR chủng TN 6.12 chủng TN 28.6 gắn trực tiếp vào vector pGEM-T Easy Sản phẩm vector tái tổ hợp pGEM-T Easy- cry1C-TN 6.12 pGEMT Easy-cry1C-TN 28.6 Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E coli DH5α Tiến hành biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α phương pháp sốc nhiệt trình bày phần phương pháp Sau biến nạp, chủng E.coli DH5α mang vector tái tổ hợp pGEM-T Easycry1C nuôi cấy môi trường LB + ampicillin + X-gal 37ºC qua đêm thấy xuất khuẩn lạc màu xanh trắng mặt thạch (Hình 3.7) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 47 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 48 of 16 Hình 3.7 Khuẩn lạc xanh, trắng xuất môi trƣờng LBA sau nuôi cấy qua đêm (1: Khuẩn lạc trắng, 2: khuẩn lạc xanh) Các dòng vi khuẩn mọc môi trường chứa ampicillin dòng biến nạp vector pGEM-T Easy có gene kháng kháng sinh Khuẩn lạc xanh xuất promoter lac - operon vectơ pGEM-T Easy hoạt động bình thường nên β- galactosidase tổng hợp có khả chuyển hóa X-gal từ không màu sang màu xanh chàm Khuẩn lạc trắng xuất hai nguyên nhân sau: nguyên nhân thứ tế bào vi khuẩn nhận vector tái tổ hợp mang đoạn DNA chèn vào gene cấu trúc lacZ làm hỏng promoter gene lac-operon vector pGEM–T Easy nên trình sống không tạo β- galactosidase, khả chuyển hoá chất X- gal có môi trường nuôi cấy vi khuẩn mà màu xanh Nguyên nhân thứ hai promoter điều khiển hoạt động gene mã hoá cho β - galactosidase bị hỏng, dẫn đến không tổng hợp β- galactosidase mà vi khuẩn E coli không chuyển hoá X-gal có môi trường nên tạo thành khuẩn lạc màu trắng Để biết khuẩn lạc trắng có mang gene mong muốn hay không, kiểm tra cách cắt DNA plasmid tinh Các dòng khuẩn lạc trắng cấy vào môi trường LB bổ sung ampicillin nuôi lắc qua đêm để tách plasmid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 48 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 49 of 16 Do có tới hai khả dẫn đến việc khuẩn lạc có màu trắng mà phải tiến hành PCR colony với mồi đặc hiệu vector M13 để chọn dòng khuẩn lạc mang vector có đoạn gene cry1C chèn vào Hình 3.8 Điện di đồ sản phẩm PCR colony với mồi M13 1, 3: Sản phẩm PCR dòng khuẩn lạc trắng TN 28.6 –p3, TN 6.12 –p7 2: Sản phẩm PCR dòng khuẩn lạc trắng TN 6.12 –p5 M: Thang DNA chuẩn Điện di đồ sản phẩm PCR cho thấy DNA khuẩn lạc trắng TN 28.6 –p3, TN 6.12–p7 có kích thước khoảng 600 bp, phù hợp với tính toán lý thuyết (là kích thước đoạn gene cry1C cộng với kích thước sản phẩm PCR vector mồi M13) Trong khuẩn lạc trắng TN 6.12–p5 tổng hợp đoạn gene có kích thước khoảng 300 bp (là kích thước sản phẩm PCR vector mồi M13) Điều chứng tỏ khuẩn lạc trắng TN 28.6–p3 TN 6.12–p7 biến nạp vector mang gene cry1C Chúng lấy khuẩn lạc trắng sàng lọc PCR colony khuẩn lạc xanh chủng cấy vào lọ penicillin chứa 2ml môi trường LB bổ sung Amp (nồng độ 50 µg/ml) nuôi lắc 370C qua đêm để tách plasmid DNA plasmid kiểm tra enzyme giới hạn Do vùng MCS (multi cloning site) vector pGEM–T Easy có chứa vị trí cắt EcoRI nằm đầu đoạn DNA insert nên cắt DNA plasmid enzyme Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 49 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 50 of 16 để kiểm tra có mặt gene cry1C Sản phẩm cắt điện di gel agarose (Hình 3.9) Hình 3.9 Điện di đồ phẩm cắt DNA plasmid tách chiết từ dòng khuẩn lạc Giếng 1,3 Sản phẩm cắt DNA plasmid dòng khuẩn lạc trắng plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy– cry1C – TN28.6- p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 Giếng DNA plasmid dòng khuẩn lạc xanh (ĐC) M:Thanh DNA chuẩn Kết cho thấy DNA plasmid dòng khuẩn lạc trắng sau cắt EcoRI tạo hai băng, băng lớn vectơ tách dòng pGEM-T Easy có kích thước 3000 bp, băng nhỏ có kích thước gần 300 bp tương ứng với sản phẩm PCR đoạn gene cry1C Trong đó, plasmid khuẩn lạc xanh sau phản ứng cắt cho băng có kích thước khoảng 3000 bp (tương ứng với kích thước vector tách dòng) Để xác định chắn có mặt gene cry1C khuẩn lạc trắng khuếch đại đoạn gene cry1C từ khuôn plasmid thu với cặp mồi đặc hiệu TYIC TYIUNI (Hình 3.10) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 50 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 51 of 16 Hình 3.10 Điện di đồ sản phẩm PCR gene cry1C từ DNA plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy – cry1C – TN28.6 - p3, pGEM-T Easy – cry1C – TN 6.12 – p7 Từ kết thu trên, bước đầu kết luận tách dòng thành công gene cry1C vector pGEM–T Easy Tuy nhiên để kết luận xác đoạn gene tách dòng có phải đoạn gene cry1C hay không tiến hành đọc trình tự đoạn gene so sánh với trình tự gene Gene Bank 3.2.3 Xác định trình tự đoạn gene cry1C Plasmid tái tổ hợp pGEM-T Easy–cry1 –TN28.6 - p3 pGEM-T Easycry1C–TN 6.12–p7 chọn để đọc trình tự so sánh với trình tự có mã số AF362020 Gene Bank Đoạn gene 288 bp chủng TN6.12 có độ tương đồng 100% so với trình tự gene cry1C chủng Bta C002 (AF362020) công bố Gene Bank Trong đó , trình tự đoạn gen e cry1C chủng TN 28.6 có độ tương đồng 99% so với chủng Bta C002 (AF362020) bị mấ t nucleotide ở vị trí 282 Trình tự AF362020 trình tự gene cry1Ca mã hóa protein Cry1Ca Như kết luận, trình tự gene cry1C chủng tách dòng thuộc phân nhóm gene cry1Ca Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 51 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 52 of 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 52 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 53 of 16 Chƣơng 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Từ 150 chủng Bacillus cereus chưa qua phân loại, xác định 54 chủng B thuringiensis sinh tinh thể, 26/54 chủng sinh loại tinh thể dạng lưỡng tháp cầu nhận dạng type huyết chuẩn Trong có 10 chủng thuộc loài B thuringiensis subsp aizawai chiếm tỷ lệ 38% chủng Bta có hoạt tính diệt sâu tơ sâu xanh da láng, chủng TN28.6, TN 1.12, TN6.12, TN 36.3 có hoạt tính diệt sâu cao Khuếch đại gene cry1C từ chủng Bta cho sản phẩm có hoạt tính diệt sâu với cặp mồi đặc hiệu có kích thước 288 kb Đoạn gene cry1C từ chủng TN 6.12 TN 28.6 tách dòng, đọc so sánh với trình tự gene cry1C chủng Bta có mã số AF362020 có độ tương đồng 100% 99% Các gene tách dòng thuộc phân nhóm gene cry1Ca 4.2 KIẾN NGHỊ Gene cry1C tách dòng từ chủng TN6.12 TN28.6 có hoạt tính diệt sâu cao, xác định đoạn gene cry1Ca mã hóa protein Cry1Ca Trên sở đó, thiết kế vector biểu protein Cry1Ca nhằm nghiên cứu: sản xuất thuốc trừ sâu sinh học Bt diệt côn trùng cánh vảy làm nguyên liệu chuyển gene cry1C vào trồng tạo khả kháng lại côn trùng cánh vảy Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 53 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 54 of 16 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đái Duy Ban (2006), Công nghệ gen, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, trang 153 Đặng Trọng Lương, Vũ Đức Quang, Nguyễn Hữu Đống, Trần Duy Quý (1999), Thiết kế lại cấu trúc gene Bt để chuyển vào hai mầm, Báo cáo Hội nghị sinh học toàn quốc, trang 1371-1376 Hoàng Thị Lợi (2003), Giáo trình côn trùng học nông nghiệp đại cương tập 2, Nhà xuất Nông Nghiệp Hà Nội, trang 122 – 167 Khuất Hữu Thanh (2004), Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen, Nhà xuất khoa học kỹ thuật, trang 109-147 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt (2002), Thu nhận huyết miễn dịch cho phân loại Bacillus thuringiensis, Kỷ yếu Viện Công nghệ Sinh học 200-2001, trang 296-303 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Nguyễn Ánh Nguyệt, Trịnh Thế Cường, Jasser Mohamad Jamil, Ngô Đình Anh Trí, Nguyễn Hoài Trâm (2000), Nghiên cứu phân bố đa dạng sinh học Bacillus thuringiensis phân lập từ số tỉnh Việt Nam “Những vấn đề nghiên cứu sinh học” Báo cáo khoa học hội nghị sinh học quốc gia, trang 484488 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Văn Thưởng, Trịnh Thị Ngọt, Nguyễn Ánh Nguyệt (2000), Sự phân bố Bacillus thuringiensis mẫu đất Việt Nam, Tài nguyên sinh vật đất phát triển bền vững hệ sinh thái đất, trang 1-7 Ngô Đình Bính (2005), Giáo trình thuốc trừ sâu sinh học Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học, Nxb Giáo dục Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 54 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 55 of 16 10 Ngô Đình Bính, Lê Thị Minh Thành, Trịnh Thị Thu Hà, Phạm Kiều Thúy, Phạm Minh Hương, Nguyễn Thị Luy, Lê Thị Hồng Nhung, Đặng Văn Tiến (2010), “35 năm nghiên cứu phát triển thuốc trừ sâu sinh học Bacillus thuringiensis Việt Nam”, Hội nghị khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, tr 288 – 300 11 Lê Thị Minh Thành, Nguyễn Thị Thanh Hạnh, Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Đình Tuấn, Phạm Kiều Thúy, Ngô Đình Bính (2005), Nghiên cứu phân bố đa dạng gene vi khuẩn Bacillus thuringiensis phân lập số tỉnh thuộc vùng Bắc Bộ, Tạp chí Di truyền ứng dụng, số 4, tr 29 – 34 12 Ngô Đình Bính, Nguyễn Quỳnh Châu, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Xuân Cảnh, Vi Thị Đoan Chính, Nguyễn Hoài Trâm, Nguyễn Văn Tuất (2003), “Tách dòng biểu gene mã hóa protein Cry1C diệt sâu khoang từ Bacillus thuringiensis subsp aizawai” , Những vấn đề nghiên cứu Khoa học Sự sống, Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, tr 830 – 832 13 Nguyễn Xuân Cảnh, Nguyễn Ánh Nguyệt, Nguyễn Thanh Hạnh, Nguyễn Quỳnh Châu, Ngô Đình Bính (2004), “ Nghiên cứu đa dạng sinh học vi khuẩn Bacillus thuringiensis Việt Nam”, Báo cáo khoa học, nghiên cứu Khoa học sống định hướng Nông lâm nghệp miền núi, Thái Nguyên 2004, NXB KHKT, tr 59 – 62 Tiếng Anh 14 Abad AR, Duck NB, Feng X, Flannagan RD, Kahn TW, Sims LE (2002) Genes encoding novel protein with pesticidal activity against coleopterans 15 Wu, Cao XL, Bai YY, and Aronson AI (1991), “Sequensing of an operon containing a novel δ-endotoxin gene from Bacillus thuringiensis’’ FEMS Microbi Lett, page 31- 35 16 Klier A (1985), “Biopesticide opportunities and challegene for anegement insect Parteun International Symposia”, page 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 55 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 56 of 16 17 Tang W, Chen H, Xu C, Li, X., Lin, Y., Zhang X (2007), “Development of insect – resistant transgenic indica rice with a synthetis Cry1C * gene” Mol Breed, 18, pp 1- 10 18 Asano S., Yamashita C., Iizuka T., Takeuchi K.,Yamanaka S., Cerf D., and Yamamoto S.(2003), “A strain of Bacillus thurigiensis subsp galleriae contaning a novel cry8 gene highly toxic to Anomala cuprea” Biological Control 28, page 191-196 19 Lyon WaF Confused and red flour beetles-HYG-2087-97, page 38.Ohio State University Extention Fact Sheet 20 Crichmore N(2011), Bacillus thurigiensis Toxin Gene Nomenclature http://www.lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt,27/07/2012 21 Deacon J "The microbial world: Bacillus thuringiensis", www.helios.bto.ed.ac.uk/bto/microbes/Bacillus thuringiensis.htm 20/06/2012 22 Promega (2010), Technical Manual: pGEM®-T and pGEM®-T Easy Vector Systems, Instructions for use of products A1360, A1380, A3600, A3610, USA 23 Sambrook J and Russell D.W.(2001), Molecular Cloning - A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press 24 Schnepf E, Crickmore N., Van Rie N., Lereclus D., Baum F., Feitelson J., Zeigler D.R., and Dean D.H.,(1998) “Bacillus thuringiensis and its pesticidal crystal protein” Microbiol Mol Biol Rev 62: page 775-806 25 Burges H D (2001), "Bacillus thuringiensis in Pest control", Pesticide Outlook, pp 90-98 26 Nester E.W, Thomashow L S, Metz M and Gordon M (2002), 100 years of Bacillus thuringiensis: A Critical Scientific Assessment, American Academy of Microbiology,Washington, USA 27 Theiry and E Franchon (1997), “Identification, isolation, culture and preservation entomopathogenic bateria”, Biotechniques Manual of Technology in insect Pathology, Edited by Lawrence A Lacey, Academic Press, pp 55 – 57 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 56 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn Header Page 57 of 16 28 Wijnands L.M., Dufrene J.B., Van Leusden F.M (2002), Characterization of Bacillus Cereus RIVM report 250912002/2002, The National Institue for Public Health and the Environment, Bilthoven, The Netherlands 29 Barjac D H (1981), “Identification of H- serotypes of Bacillus thuringiensis”, page 36–42 30 Barjac D H and Bonnefoi A (1962), “Essai de classification biochimique et serologique de 24 souches de Bacillus du type B Bacillus thuringiensis.” Entomophaga 7, pp – 31 31 Li, Caroll J J., and Ellar D J (1991), "Crystal structure of insecticidal δ endotoxin from Bacillus thuringiensis at 2.5 A resolution", Nature 353, pp 815-821 32 Höfte H and Whiteley H R (1989) “Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis”, Microbio Rev, 53 (2), page 242-25 33 Metahelix Life Sciences Private Limited, Bio- Safety Evaluation of Cry1C Protein Expressed in Bt cotton carrying Cry1C genes, Review Committee on Genetic Modifications Department of Biotechnology MST, GOI New Delhi 110003 event MLS9124 34 Proceedings of the 2nd Canberra B thuringiensis meeting September, Lanberra, 1993 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page 57 of 16 http://www.lrc-tnu.edu.vn ... trồng, tiến hành đề tài: Nghiên cứu đặc điểm sinh học số chủng Bacillus thuringiensis sinh protein tinh thể diệt côn trùng cánh vảy ’ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Footer Page of... diệt côn trùng cánh vảy chủng Bta thu nhận - Phát chủng Bta mang gene cry1C từ chủng có hoạt tính diệt côn trùng cánh vảy phương pháp PCR - Tách dòng gene cry1C mã hóa protein tinh thể diệt côn. .. côn trùng cánh vảy mạnh Vì vậy, để sản xuất thuốc trừ sâu Bt đặc hiệu riêng với côn trùng cánh vảy chuyển gene mã hóa protein tinh thể kháng côn trùng cánh vảy vào trồng, tiến hành đề tài: “Nghiên