Nghiên cứu đặc điểm bộ gen của một số chủng enterovirus 71 gây bệnh chân tay miệng ở Việt Nam năm 2011 – 2013

1 ĐẶT VẤN ĐỀ Trong năm gần đây, bệnh Tay chân miệng (TCM) trở thành vấn đề quan tâm hàng đầu nước giới, nước phát triển, có Việt Nam Do gia tăng bệnh, số người nhập viện ngày nhiều dẫn đến tình trạng tải nhiều bệnh viện Trong đó, nhận thức thực hành biện pháp phòng bệnh người dân hạn chế tập quán ăn uống sinh hoạt người dân chưa đảm bảo vệ sinh Đến nay, chưa tìm phương pháp điều trị vắc xin dự phòng cách hiệu Các vụ dịch TCM thường xảy hàng năm từ tháng đến tháng 11 Enterovirus 71 (EV-A71) nguyên quan trọng liên quan đến vụ dịch TCM khắp nơi khu vực Châu Á Thái Bình Dương Việt Nam [1].Vụ dịch năm 2011 2013 với số ca mắc hàng năm 100 000 người, gây tử vong 200 trẻ, nguyên phân lập chủ yếu Enterovirus 71 (EV-A71) với 68%, chủng lưu hành có genotype C4 C4A Cho đến nay, nhà khoa học chưa hiểu rõ đặc điểm di truyền chủng EV - A71 gây bệnh TCM vụ [2] Các vụ dịch TCM EV - A71gây nên, đặc biệt nhóm, nhóm, kèm theo tái tổ hợp di truyền chủng Do đó, hiểu biết thay đổi gen EV - A71 cần thiết, đóng vai trò việc nghiên cứu dịch tễ học, chẩn đoán, điều trị phát triển vắc-xin phòng bệnh Có nhiều kỹ thuật xác định thay đổi di truyền chủng vi rút nói chung, cóEV - A71 Trong năm gần giải trình tự gen hệ (NGS) công nghệ giúp giải mã nhanh chóng xác toàn bộ gen EV - A71 Mặc dù kỹ thuật NGS phát triển từ năm 2005, Việt Nam kĩ thuật có nghiên cứu ứng dụng kĩ thuật vào phân tích đặc điểm di truyền EV - A71 Chính tiến hành đề tài “Nghiên cứu đặc điểm gen số chủng enterovirus 71 gây bệnh chân tay miệng việt nam năm 2011 – 2013” Với mục tiêu: Xác định trình tự toàn bộ gen số chủng EV - A71 gây bệnh TCM Việt Nam năm 2011 – 2013 kỹ thuật giải trình tự gen hệ So sánh biến đổi mặt di truyền chủng EV - A71 CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Bệnh Tay Chân Miệng 1.1.1 Sơ lược bệnh TCM Bệnh TCM có thời gian ủ bệnh trung bình từ đến ngày Đầu tiên, vi rút thường cư trú niêm mạc má hay niêm mạc hồi tràng sau 24 giờ, vi rút lan đến hạch bạch huyết Nhiễm vi rút huyết thường xảy nhanh chóng sau vi rút di chuyển đến niêm mạc miệng da Vào ngày thứ sau nhiễm bệnh, kháng thể trung hòa tăng cao vi rút bị thải loại Các dấu hiệu tiền triệu bao gồm sốt nhẹ, mệt mỏi, đau bụng đau miệng Trong giai đoạn toàn phát, bệnh nhân có biểu sốt, đau đầu, nôn, mệt mỏi, đau họng, loét miệng, ăn không ngon, tiêu chảy Khám thấy vết loét, xung quanh có viền đỏ, thường niêm mạc miệng, thấy lưỡi, vòm họng, lưỡi gà, a-mi-đan, lợi da lòng bàn tay, bàn chân kẽ ngón tay, ngón chân Ở trẻ em tuổi, triệu chứng điển hình người lớn Các tổn thương da ban đầu thường dạng dát sau nhanh chóng tiến triển thành nước hình oval, đường kính từ 210mm, màu xám ban hồng Ở trẻ sơ sinh, tổn thương thân mình, đùi mông Trong trường hợp không điển hình có nước xen kẽ với hồng ban, có hồng ban mà nước loét miệng đơn Một số trường hợp có biến chứng hệ thần kinh trung ương Biểu lâm sàng thường hay gặp viêm màng não, liệt mềm cấp, viêm não Các biến chứng gặp bao gồm điều hòa tiểu não, hội chứng GuillainBarré, viêm tủy cắt ngang, tăng áp lực nội sọ lành tính, tỷ lệ tử vong số trường hợp mắc từ 40-80% Các biến chứng khác phù phổi cấp, xuất huyết, suy tuần hoàn Nhiều biến chứng phối hợp xảy bệnh nhân Bệnh TCM thường xảy thành dịch từ nhỏ đến lớn đe dọa sức khỏe tính mạng trẻ em Y văn giới ghi nhận vụ dịch TCM xảy Đài Loan, Trung Quốc, Singapore Tại Việt Nam, giai đoạn 2011-2013 số ca mắc tử vong bệnh TCM tăng đột biến, đó, chưa tìm phương pháp điều trị vắc xin dự phòng - + + - Phân độ lâm sàng [4], [5]: + Độ 1: Chỉ loét miệng và/hoặc tổn thương da + Độ 2: Biến chứng thần kinh tim mạch mức độ trung bình • Rung giật • Đi loạng choạng • Ngủ gà • Yếu liệt chi • Mạch nhanh >150 lần/phút (khi trẻ nằm yên không sốt) • Sốt cao ≥ 3905C (nhiệt độ hậu môn) Độ 3: Biến chứng nặng thần kinh, hô hấp, tim mạch • Co giật, hôn mê (Glasgow < 10 điểm) • Khó thở: Thở nhanh, rút lõm ngực, SpO2 < 92% (không oxy hỗ trợ) • Mạch nhanh >170 lần/phút tăng huyết áp Độ 4: Biến chứng nặng, khó hồi phục • Phù phổi cấp • Sốc, truỵ mạch • SpO2 < 92% với oxy qua gọng mũi lít/phút • Ngừng thở Phân loại mức độ bệnh [6]: + Bệnh nhẹ: bệnh nhân độ độ 2a + Bệnh nặng: bệnh nhân từ độ 2b trở lên 1.1.2 Tác nhân gây bệnh TCM [7] Bệnh TCM nhóm vi rút đường ruột (Enterovirus) gây nên Enterovirus gây bệnh cho người gồm nhóm: Poliovirus (PV), Coxsackievirus A (CVA), Coxsackievirus B (CVB), Echovirus (ECV) Enterovirus 68 đến 71 (EV68-71) Trong đó, tác nhân chủ yếu gây bệnh TCM làEV - A71và CVA16.EV - A71 gây biến chứng thần kinh nặng dẫn đến tử vong, vi rút đường ruột khác thường thể nhẹ 1.1.3 Một số kĩ thuật phát EV - A71 phòng xét nghiệm Các mẫu bệnh phẩm dùng để xác định nguyên bao gồm phân, dịch ngoáy họng, ngoáy hậu môn, dịch nốt dịch não tuỷ Mỗi loại bệnh phẩm có ưu nhược điểm riêng - Nuôi cấy Nuôi cấy vi rút kỹ thuật gây nhiễm vi rút (có mẫu bệnh phẩm) lên dòng tế bào nuôi thích hợp nhằm tăng sinh phát triển, từ xác định vi rút Dòng tế bào thích hợp cho nuối cấy Enterovirus nói chúng tế bào L20B có nguồn gốc từ tế bào Lympho chuột tế bào RD có nguồn gốc từ sarcom mô liên kết người - Phản ứng trung hòa Phát kháng thể IgM kháng EV - A71 phát triển, cho kết dương tính giả giá trị dự báo dương tính thấp - Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián tiếp: gián tiếp sử dụng kháng thể đơn dòng kháng EV - A71 cho kết nhanh giá thành cao [8] [9] - Kỹ thuật khuếch đại gen kỹ thuật RT – PCR (Reverse transcription – polymerase chain reaction) Một số tác giả sử dụng cặp mồi cặp mồi MD91/MD90 khuyếch đại vùng gen đầu 5’UTR PCR primers cặp mồi MAS01S/MAS02A khuếch đại vùng gen VP1 [10] - Kỹ thuật giải trình tự gen Kỹ thuật giúp định danh nhanh chóng xác loại vi rút có trình tự riêng biệt, không trùng lẫn với loài khác Các phương pháp giải trình tự gen cổ điển 1.1.4 Điều trị bệnh TCM - Nguyên tắc điều trị [4]: Hiện chưa có thuốc điều trị đặc hiệu, điều trị hỗ trợ (không dùng kháng sinh bội nhiễm) Theo dõi sát, phát sớm điều trị biến chứng Bảo đảm dinh dưỡng đầy đủ, nâng cao thể trạng - Điều trị cụ thể [4]: + Độ 1: • Điều trị ngoại trú theo dõi y tế sở • Tái khám 1-2 ngày 5-10 ngày đầu bệnh • Dặn dò dấu hiệu nặng cần tái khám ngay: Sốt cao ≥ 39 0C; thở nhanh, khó thở; rung giật cơ, chới với, run chi, quấy khóc, bứt rứt khó ngủ; Co giật, hôn mê; yếu liệt chi; da vân tím + - Chỉ định nhập viện: • Biến chứng thần kinh, tim mạch, hô hấp (từ độ 2) • Sốt cao ≥ 390C • Nôn nhiều • Nhà xa: khả theo dõi, tái khám Độ 2: Điều trị nội trú bệnh viện huyện tỉnh + Điều trị độ + Nằm đầu cao 30o, cổ thẳng + Điều trị chống suy hô hấp, co giật + Immunoglobµlin (nếu có) + Theo dõi mạch, nhiệt độ, huyết áp, nhịp thở, tri giác, ran phổi, mạch 4- + - Đo độ bão hòa oxy SPO2 theo dõi mạch liên tục (nếu có máy) Độ 3: Điều trị nội trú bệnh viện tỉnh bệnh viện huyện đủ điều kiện + Chống suy hô hấp, chống phù não, chống co giật + Điều trị hạ đường huyết, điều chỉnh rối loạn nước, điện giải, toan kiềm + Dùng thuốc vận mạch Dobutamin suy tim mạch + Immunoglobµlin (nếu có) + Theo dõi mạch, nhiệt độ, huyết áp, nhịp thở, tri giác, ran phổi, SpO 2, 1- - Độ 4: Điều trị nội trú bệnh viện trung ương, bệnh viện tỉnh, huyện đủ điều kiện.Xử trí tương tự độ - Điều trị biến chứng: suy hô hấp, suy tuần hoàn, chống phù não - Immunoglobµlin (nếu có): + Chỉ định từ độ độ + Liều: 1g/kg/ngày truyền tĩnh mạch 6- x ngày liên tiếp + Riêng độ cần đánh giá lại lâm sàng trước định liều thứ Không dùng liều lâm sàng cải thiện tốt 1.1.5 Phòng bệnh Hiện chưa có vắc xin phòng bệnh đặc hiệu Áp dụng biện pháp phòng bệnh bệnh lây qua đường tiêu hoá Phòng bệnh sở y tế: Cách ly theo nhóm bệnh Nhân viên y tế: Mang trang, rửa, sát khuẩn tay trước sau chăm sóc Khử khuẩn bề mặt, giường bệnh, buồng bệnh Chloramin B 2% Xử lý chất thải theo quy trình phòng bệnh lây qua đường tiêu hoá Phòng bệnh cộng đồng: Vệ sinh cá nhân, rửa tay xà phòng (đặc biệt sau thay quần áo, tã, sau tiếp xúc với phân, nước bọt) 1.2 Đặc điểmEV - A71 [1] EV-A71 thuộc họ (family) Picornaviridae Do màng bao lipid nên Enterovirus bền vững môi trường vật chủ, kể tiếp xúc với dịch vị dày chúng tồn nhiệt độ phòng vài ngày Các vi rút không bị hòa tan dung môi hữu (như ether chloroform), cồn Tuy nhiên vi rút bị bất hoạt nhiệt độ 56 oC, khử trùng chlo, formaldehyde tia cực tím EV - A71 Enterovirus khác tìm thấy mặt nước, nước ngầm suối nước nóng Chu kỳ sống nhân lên vi rút: Chu kỳ sống vi rút xảy hoàn toàn tế bào chất Giống loài Enterovirus khác, chu kì chép EV - A71 tương tự Polioviruses - Hấp phụ xâm nhập: Vi rút xâm nhập vào tế bào vật chủ thích hợp nhờ receptor đặc hiệu Vi rút xâm nhập theo chế nhập bào thông qua clathrin (clathrin-mediated endocytosis) - Dịch mã: Bộ gen ARN sợi (+) có trình tự nucleotide giống với trình tự mARN nên có chức mARN dịch mã thành polyprotein Sau đó, nhờ protease phân cắt polyprotein thành protein cấu trúc protein không cấu trúc (enzyme) để thực chức khác - Tổng hợp ARN vi rút: ARN polymerase phụ thuộc ARN vi rút dùng ARN sợi (+) để tạo ARN sợi (-) Sau đó, ARN polymerase phụ thuộc ARN lại dùng ARN sợi (-) làm khuôn để tạo nhiều gen vi rút ARN sợi (+) - Lắp ráp giải phóng: Các protein cấu trúc tham gia lắp ráp tạo capsid ARN virion đóng gói capsid tạo thành hạt vi rút trưởng thành Các hạt vi rút tổng hợp giải phóng ly giải tế bào vi rút phóng thích tiếp tục lây nhiễm 1.2.1 Phân loại Sau phân lập năm 1969,EV - A71 gây 28 dịch TCM vừa nhỏ [11] Trong 15 năm qua, vụ dịch lớn khu vực Đông Nam EV - A71 Dựa vào kết giải tŕnh tự gen VP1 xác định có nhóm EV - A71 độc lập A, B, C D Các vi rút đươc xếp vào genotype có trình tự vùng gen VP1 giống 92% trở lên Nhóm A có chủng BrCr phân lập Mỹ năm 1969 Trong vụ dịch nhỏ TCM EV - A71 Trung Quốc, có chủng xếp vào nhóm A, nghiên nguồn gốc vi rút chưa rõ ràng [11] Nhóm D có chủng phân lập Ấn Độ năm 2002 Nhóm B chia làm nhóm (subgenotype): B1–5 B0 Giữa B1 B2 có 12% khác biệt nucleotide Chủng B1 B2 chủng lưu hành mạnh vào năm 1970 1980 [12] Chủng B3, B4, B5 cho lưu hành từ năm 1997[13] Chủng B5, lần phân lập Nhật Bản Sarawak (Malaysia) vào năm 2003 Đây nguyên tạo nên vụ dịch B-ru-nây, Sarawak Đài Loan năm 2006 Chủng B0 mô tả, phân lập Châu Âu từ 1963 đến 1967 [14] Nhóm C chia thành nhóm (subgenotype): C1-5 C1 phân lập Châu Âu Mỹ năm 1987 C2 từ năm 1995 C3 – C5 liên quan đến vụ dịch Nam Á từ năm 1997 [1] [15] Trong vụ dịch TCM lớn EV - A71 gây Trung Quốc năm 2008 có 201 chủng C4 ghi nhận lưu hành rộng rãi 1.2.2 Cấu trúc gen EV - A71 [16] Bộ gen EV - A71 chứa sợi dương ARN dài khoảng 7400 nucleotid chưa tính phần PolyA Về mặt di truyền gần với CV-A16 Cấu trúc gen gồm vùng 5’-UTR, khung đọc mở (ORF) mã hóa polyprotein, 3’-UTR, phần PolyA Vùng 5’-UTR gồm 742 nucleotid, có cấu trúc mã hóa stem-loop 10 stem-loop I stem-loop hình tham gia vào trình tổng hợp ARN vi rút stem-loop II đến VI gồm các trình tự tiếp nhận ribosome bên ((internal ribosome entry site – IRES) liên quan đến trình dịch mã protein Vùng 5’-UTR EV - A71 giống với polioviru chia thành vùng: vùng 5′ terminal cloverleaf nucleotide đến 89 101 nucleotid, vùng IRES có kích thước từ nucleotide 123–126 đến nucleotide 602–605, vùng siêu biến đổi khoảng 120 nucleotid Khung đọc mở mã hóa polyprotein gồm protein cấu trúc P1 dài 2586 nucleotid, protein không cấu trúc P2 (1,734 nt) P3 (2,259 nt), tham gia vào chép ARN vi rút Polyprotein chia thành 11 protein gồm protein capsid thuộc P1 VP1, VP2, VP3, VP4 protein không cấu trúc gồm P2 có 2A, 2B, 2C P3 có 3A, 3B, 3C, 3D [12] VP1, VP2, VP3 tạo thành tiểu đơn vị pentamer, gồm 60 kết nối để tạo thành capsid có cấu trúc khối đa diện đều, vùng có nhiều định kháng nguyên nhiên kháng thể trung hòa xác định chủ yếu từ kháng nguyển vùng VP1, VP4 gắn vào mặt vỏ capsid Ở vùng 2A chứa gen mã hóa enzyme protease đóng vai trò phân cắt protein tế bào vật chủ có dystrophin thành phần tế bào tim [17] Vùng VP1 gồm 891 nucleotid, vùng gây ảnh hưởng đáng kể đến biến đổi gen, đặc điểm hình thái thích hợp cho qua trình phát sinh loài vi rút Vùng gen mã hóa protein VP1 chứng minh vùng gen kháng nguyên, định đến tính kháng nguyên tính độc lực vi rút Những đột biến vùng VP1dễ dẫn đến thay đổi thành phần acid amin đặc tính gây bệnh vi rút, từ hình thành biến chủng Vùng không dịch mã 3’-UTRs (81nt) chứa cấu trúc mã hóa stem-loop X, Y, Z [18] Phần PolyA gắn đầu 3’ 73 thích nghiên cứu tiến hành chủng EV – A71 từ bệnh nhân bị bệnh TCM thuộc nhóm type nên chúng có tỷ lệ nucleotid tương đồng cao Vùng gen mã hóa protein không cấu trúc P2 P3 có vai trò quan trọng việc tạo thành protease phân hủy proteolytic để giải phóng protein cấu trúc RNA phụ thuộc RNA polymease 4.2.2.5 Vùng 3’ UTR Tỷ lệ % nucleotid tương đồng so sánh với chủng tham chiếu 97,5 – 100% Tỷ lệ tương đồng cao đối tượng nghiên cứu nghiên cứu giống nhau, mẫu thuộc nhóm type nên tỷ lệ vùng gen tương đối giống Kết cao so với kết cao kết tác giả Linlin Li [42] Lê Phan Kim Thoa [38] Kết tác giả cho thấy tỷ lệ phần trăm nucleotid tương đồng từ 54,5% đến 95,5% Do tác giả so sánh nhiều chủng từ nhóm type khác chủng thuộc nhóm type C 4.2.2.6 Vùng 5’ UTR Vùng cho tỷ lệ tương đồng nucleotid với chủng tham chiếu 98,3% đến 100% Kết tương tự với kết tác giả Linlin Li cho thấy tương đồng nucleotid 93,3% - 100% Kết nghiên cứu có nhiều khác biệt với nghiên cứu Jen-Ren Wang, tác giả so sánh tương đồng với chủng khác có thay đổi từ 74,1% đến 100% [35] Sự khác biệt khác cỡ mẫu nghiên cứu, quần thể nghiên cứu khác thời gian thu mẫu khác nghiên cứu 18 chủng EV – A71 phân lập Việt Nam từ 2011 – 2013, tác giả nghiên cứu 75 chủng EV – A71 phân lập từ 1998 đến 2000 Vùng 5’UTR đóng vai trò quan trọng phiên mã dịch mã, nghiên cứu tác giả Wang HL nghiên cứu vùng 5’UTR chủng EV – A71 gây bệnh TCM trẻ em có triệu chứng thần kinh, cho thấy từ nucleotid thứ 11 74 trình tự vùng 5’UTR thêm bớt nucleotid xảy phổ biến, nhiên thay đổi không tìm thấy liên quan với triệu chứng nặng, thay đổi nucleotid vùng 5’UTR không thấy có ý nghĩa [28] Các kết đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu Đặc điểm lâm sàng, Dịch tễ học, Phương pháp chẩn đoán, Điều trị, Dự phòng Bệnh Tay Chân Miệng Việt Nam Đề xuất chủng vi rút để sản xuất vắc xin” năm 2011 2013 Bệnh viện Bệnh Nhiệt đới Trung ương dừng lại kết giải trình tự gen vùng VP1 phân tích đặc điểm di truyền vùng này, chưa cho thấy tranh toàn cảnh đặc điểm di truyền của các vùng gen khác, đặc điểm trình tự toàn bộ gen chủng EV – A71, khác biệt mặt di truyền chủng nghiên cứu với chủng khác giới nguồn gốc di truyền chủng Nghiên cứu giải mã thành công toàn bộ gen 18 chủng EV – A71 có ý nghĩa to lớn công tác dịch tễ, phòng bệnh, nghiên cứu vắc-xin phòng bệnh 75 KẾT LUẬN Trình tự toàn bộ gen số chủng EV - A71 gây bệnh TCM Việt Nam năm 2011 – 2013 Bằng kỹ thuật giải trình tự gen hệ tiến hành giải trình tự thành công 18 chúng EV – A71 cho thấy Chiều dài gen cuả EV – A71 7404 bp Chiều dài vùng gen EV – A71 Vùng 5’UTR 738 nt, khung đọc mở mã hóa cho protein cấu trúc P1 có 2,577 nt) vùng VP1 có chiều dài trung bình 882 nt, VP2 762 nt, VP3 có 726nt, vùng VP4 có 207nt, protein không cấu trúc P2 có 1,733 nt vùng 2A có 450 nt, vùng 2B có 296 nt, vùng 2C có 987 nt, P3 có 2,275 nt vùng 3A có 258 nt, 3B có 66 nt, 3C có 549 nt, vùng 3-UTR có 80 nt Tỷ lệ nucleotid G + C: 47,7%, nucleotid A 27 %, nucleotid U 24,8 % nucleotid G 23,8, nucleotid C 23,9, nucleotid khác 0,5% Sự biến đổi mặt di truyền chủng EV - A71 Không có biến đổi mặt di truyền chủng EV – A71 nghiên cứu Các chủng virus EV – A71 nghiên cứu nằm nhánh riêng có mối quan hệ gần với chủng KP 308460 Campuchia, chủng KC296443.1_Enterovirus_A71_strain_HCM84-VNM-2011 Nguồn gốc chủng nghiên cứu có khác biệt định chủng EV 71 nước khác TÀI LIỆU THAM KHẢO Penny Lewthwaite Tom Solomon, David Perera, Mary Jane Cardosa et al (2010) Virology, epidemiology, pathogenesis, and control of enterovirus 71 Lancet Infect, 2010 10 (11), 778–790 Bộ Y Tế (2008) Nghiên cứu đặc điểm dịch tễ học, lâm sàng, phương pháp chẩn đoán, điều trị, dự phòng, bệnh Tay chân miệng Việt Nam Quyết định số 1732 /QĐ-BYT ngày 16 tháng năm 2008 Bộ trưởng Bộ Y tế) George Christakos Jin-feng Wang , Yan-Sha Guo et al (2011) Hand, foot and mouth disease: spatiotemporal transmission and climate International Journal of Health Geographics 10-25 Bộ Y tế (2008) Hướng dẫn chẩn đoán, điều trị bệnh tay-chân-miệng (Quyết định số 1732 /QĐ-BYT ngày 16 tháng năm 2008 Bộ trưởng Bộ Y tế) Sở Y tế Thành phố Hồ Chí Minh (2008) Tài liệu tập huấn chẩn đoán điều trị bệnh tay-chân-miệng Nguyễn Văn Kính, Nguyễn Kim Thư, Nguyễn Vũ Trung (2015) Đặc điểm lâm sàng bệnh Tay Chân Miệng doEV - A71 Việt Nam năm 2011-2012 Y học thực hành 2015 (954), 87-91 Chen Tsan-Chi (2006) Combining Multiplex Reverse Transcription-PCR and a Diagnostic Microarray To Detect and Differentiate Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16 J Clin Microbiol 2212–2219 Miao Lynn Yihong et al (2009) Monoclonal Antibodies to VP1 Recognize a Broad Range of Enteroviruses J Clin Microbiol,: p 3108–3113 WHO (2010) A Guide to Clinical Management and Public Health Response for Hand, Foot and Mouth Disease 10 Singh Sunita et al (2002) Direct detection of enterovirus 71 (EV-A71) in clinical specimens from a hand, foot and mouth disease outbreak in Singapore by reverse transcription-PCR with universal enterovirus andEV - A71-specific primers J Clin Microbiol 40 (8), 2823 – 2827 11 Chen W Yu H, Chang H et al (2010) Genetic analysis of the VP1 region of enterovirus 71 reveals the emergence of genotype A in central China in 2008 (Virus Genes 2010) 41,1-4 12 McMinn P (2002) An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance FEMS Microbiol Rev,2002 26, 91-107 13 Hsu YW Huang SW, Smith DJ et al (2009) Reemergence of enterovirus 71 in 2008 in Taiwan: dynamics of genetic and antigenic evolution from 1998 to 2008 J Clin Microbiol 47: p 3653-3662 14 Koopmans M Van der sanden S, Uslu G et al (2009) Epidemiology of enterovirus 71 in The Netherlands, 1963 to 2008 J Clin Microbiol 2009 47, 2826-2833 15 Perera D Cardosa MJ, Brown BA et al (2004) Molecular epidemiology of human enterovirus 71 strains and recent outbreaks in the Asia-Pacific region: comparative analysis of the VP1 and VP4 genes Emerg Infect Dis 9, 461-468 16 Ya-Qing He Long Chen, Jun Meng et al (2016) Full-Genome Sequences of Seven Fatal Enterovirus 71 Strains Isolated in Shenzhen, China, in 2014 American Society for Microbiology 2016 17 Qinghua Zou Renqing Li , Lijuan Chen et al (2011) Molecular Analysis of Virulent Determinants of Enterovirus 71 Reasearch article 18 Phuektes P Kok CC, Bek E, McMinn P (2012) Modification of the untranslated regions attenuates the growth of human enterovirus 71 in cell culture J Virol 2012 86, 542-552 19 B.H Chua P Phuektes, S Sanders et al (2011) Mapping genetic determinants of the cell-culture growth phenotype of enterovirus 71 J Gen Virol, (2011) 96, 1380-1390 20 E Giombini and G Rozera M R Capobianchi (2013) Nextgeneration sequencing technology in clinical virology Clin Microbiol Infect 2013 19, 15-22 21 Shahriar R Varghese V, Rhee SY et al (2009) Minority variants associated with transmitted and acquired HIV-1 nonnucleoside reverse transcriptase inhibitor resistance: implications for the use of secondgeneration nonnucleoside reverse transcriptase inhibitors J Acquir Immune Defic Syndr Nov 52(3), 309-15 22 Pachter L Eriksson N, Mitsuya Y, Rhee SY et al (2008) Viral population estimation using pyrosequencing PLoS Comput Biol 4(4) 23 Burwitz BJ Bimber BN, O'Connor S, Detmer A et al (2009) Ultradeep pyrosequencing detects complex patterns of CD8+ T-lymphocyte escape in simian immunodeficiency virus-infected macaques J Virol (2009) 83(16), 8247-53 24 O’Connor S Hughes A L., Dudley D et al (2010) Dynamics of haplotype frequency change in a CD8+TL epitope of simian immunodeficiency virus Infect Genet Evol 10, 555–560 25 Nguyen Thi Kim Tuyen, Le Van Tan, Tran Tan Thanh et al (2015) A generic assay for whole-genome amplification and deep sequencingof enterovirus A71 Journal of Virological Methods 30–36, 215–216 26 Chia-Pei Lin, Jiung-Liang Liu, Lung-Yuan Chen et al (2015) Complete Genome Sequence of Human Enterovirus Strain 71 (EVA71/Taipei/3118/2011), Isolated from a Patient in Taiwan Genone Announcements 3(1) 27 Sompong Vongpunsawad John Mauleekoonphairoj, Jiratchaya Puenpa (2015) Complete genome sequence analysis of enterovirus 71 isolated from children with hand, foot, and mouth disease in Thailand, 2012– 2014 (Virus Genes DOI 10.1007/s11262-015-1239-0) 28 L Chen, He,Y.Q., Meng et al (2016) Full-Genome Sequences of Seven Fatal Enterovirus 71 Strain Isolated in Shenzhen, China, in 2014 Genome Announc 4(2) 29 D Perera, Apandi,M., Cardosa,M.J (2014) Human enterovirus 71 isolate 03-KOR-00, complete genome (Universiti Malaysia Sarawak, Institute of Health and Community Medicine, Kota Samarahan, Sarawak 94300, Malaysia) 30 D Perera, Apandi,M and Cardosa,M.J (2014) Human enterovirus 71 isolate 1M-AUS-12-00, complete genome (Universiti Malaysia Sarawak, Institute of Health and Community Medicine, Kota Samarahan, Sarawak 94300, Malaysia) 31 K Miyamura, Nishimura,Y, Abo,M et al (2011) Adaptive mutations in the genomes of enterovirus 71 strains following infection of mouse cells expressing human P-selectin glycoprotein ligand-1 J Gen Virol 92 2, 287-29 32 Enjin Gou et al (2015) Analysis on the sequence of the whole genome of an isolated enterovirus 71 strain Int J Clin Exp Med 2015;8(11):20652-20657 33 Riikka Österback et al (2014) Genome Sequence of Coxsackievirus A6, Isolated during a Hand-Foot-and-Mouth Disease Outbreak in Finland in 2008 Genome Announc 2, 10.1128/genomeA.01004-14 34 M Steven Oberste, Kaija Maher (1999) Molecular Evolution of the Human Enteroviruses: Correlation of Serotype with VP1 Sequence and Application to Picornavirus Classification J Virol, 1999 Mar; 73(3): 1941–1948 Brcr 891 nt 35 Jen-Ren Wang, Yen-Chang Tuan (2002) Change of Major Genotype of Enterovirus 71 in Outbreaks of Hand-Foot-and-Mouth Disease in Taiwan between 1998 and 2000 J Clin Microbiol 2002 Jan; 40(1): 36 Kiener TK (2014) A Novel Universal Neutralizing Monoclonal Antibody against Enterovirus 71 That Targets the Highly Conserved “Knob” Region of VP3 Protein 37 Ying Wang (2014) Complete Genome Sequence of a Human Enterovirus 71 Strain Isolated from a Fatal Case in Shanghai, China, in 2012 Genome Announc 2014 May-Jun; 2(3): e00457-14 38 Yan Zhang (2013) Complete Genome Analysis of the C4 Subgenotype Strains of Enterovirus 71: Predominant Recombination C4 Viruses Persistently Circulating in China for 14 Years PLoS One 2013; 8(2): e56341 39 Le V Tan et al (2015) A Generic Assay for Whole-Genome Amplification and Deep Sequencing of Enterovirus A71 J Virol Methods 215-216, 30-36 2015 10–15 40 Le Phan Kim Thoa, Pai-Shan Chiang (2013) Genetic and Antigenic Characterization of Enterovirus 71 in Ho Chi Minh City, Vietnam, 2011 PLoS One 2013; 8(7): e69895.10.1371/journal.pone.0069895 PubMed: [PMC3726754] [PubMed] 41 Celeste Donato, Le Thi Hoi, Nguyen Thi Hoa (2016) Genetic characterization of Enterovirus 71 strains circulating in Vietnam in 2012 Virology 495 (2016) 1–9 42 Linlin Li (2005) Genetic Characteristics of Human Enterovirus 71 and Coxsackievirus A16 Circulating from 1999 to 2004 in Shenzhen, People's Republic of China J Clin Microbiol 2005 Aug; 43(8): 3835–3839 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOA NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỘ GEN CỦA MỘT SỐ CHỦNG ENTEROVIRUS 71 GÂY BỆNH CHÂN TAY MIỆNG VIỆT NAM NĂM 2011 - 2013 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ HÀ NỘI – 2017 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HOA NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỘ GEN CỦA MỘT SỐ CHỦNG ENTEROVIRUS 71 GÂY BỆNH CHÂN TAY MIỆNG VIỆT NAM NĂM 2011 - 2013 Chuyên ngành: Vi sinh Mã số: NT 62726805 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SĨ NỘI TRÚ Người hướng dẫn khoa học: 1.PGS.TS Nguyễn Vũ Trung 2.TS Lê Thị Hội HÀ NỘI – 2017 LỜI CẢM ƠN Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Trung, Trưởng Bộ môn Vi Sinh trường Đại học Y Hà Nội, TS Lê Thị Hội, BV Nhiệt Đới Trung Ương nhiệt tình dạy bảo và giúp đỡ nhiều trình thực đề tài hoàn thành luận văn này Tôi xin gửi lời cảm ơn thầy giáo, cô giáo Bộ môn Vi Sinh trường Đại học Y Hà Nội, bác sĩ, y tá Bệnh Viện Nhiệt Đới Trung Ương, Ban giám hiệu, Phòng đào tạo, Thư viện và phòng ban trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện cho thực và hoàn thành luận văn này Cảm ơn Gia Đình dành cho điều kiện cần và đủ để yên tâm học tập, cám ơn tất bạn bè giúp đỡ thời gian học tập khoảng thời gian khó khăn sống Hà Nội, ngày tháng năm 2017 Nguyễn Thị Hoa LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyễn Thị Hoa, học viên lớp Bác sĩ nội trú 39, trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Vi sinh xin cam đoan: Đây luận văn thân trực tiếp thực hướng dẫn thầy PGS.TS Nguyễn Vũ Trung thầy TS Lê Thị Hội Công trình không trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hoàn toàn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày 25 tháng năm 2017 Học viên Nguyễn Thị Hoa DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ALP AND ARN ATL BBB BWB cADN CCP CDP CVA CVB DAL ds cDNA ECV ELB EV-A71 FPF FSA HCV HIV IRES LIG NGS ORF PCR PMM PPC PV RBP RFB A dapter ligation plate Acide Deoxyribonucleic Acide Ribonucleic A-Tailing Mix Bead Binding Buffer Bead Washing Buffer Complement DNA (ADN bổ sung) cDNA clean up Plate cDNA plate Coxsackievirus A Coxsackievirus B Diluted Amplicon Library Double strand DNA (sợi DNA bổ sung thứ 2) Echovirus Elution Buffer Enterovirus A71 Fragment, Prime, Finish Mix First Strand Synthesis Act D Mix Hepatitis C virus (Vi rút gây viêm gan C) Human immunodeficiency virus (Vi rút gây suy giảm miễn dịch người) Internal Ribosome Entry Site (Vị trí vào ribosom) Ligation Mix Next generation sequencing Open reading frame (Khung đọc mở) Polymerase chain reaction (Phản ứng khuếch đại chuỗi gen) PCR Master Mix PCR Primer Cocktail Poliovirus (vi rút bại liệt) RNA Bead Plate RNA Fragmentation Plate RPB RSB RSB ARN Purification Beads Resuspension Buffer Resuspension Buffer RSB Resuspension Buffer Reverse transcription – polymerase chain reaction RT-PCR SMM st cDNA STL TCM UTR SIN HCM AUS KOR VNM MY BRU THA (Phản ứng khuếch đại chuỗi gen mã ngược) Second Strand Marking Master Mix Strand DNA (sợi DNA bổ sung thứ nhất) Stop Ligation Buffer Tay chân miệng Untranslated region (Vùng không dịch mã) Singapore Hồ Chí Minh Australia Hàn Quốc Việt Nam Malaysia Brunei Thái Lan MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG DANH MỤC HÌNH DANH MỤC SƠ ĐỒ ... tài Nghiên cứu đặc điểm gen số chủng enterovirus 71 gây bệnh chân tay miệng việt nam năm 2011 – 2013 Với mục tiêu: Xác định trình tự toàn bộ gen số chủng EV - A71 gây bệnh TCM Việt Nam năm 2011. .. thấy chủng EV – A71 nghiên cứu phân lập từ bệnh nhân TCM mức độ nặng độ có 13 chủng, độ có 29 chủng 3.1.3 Phân loại số chủng EV - A71 gây bệnh TCM Việt Nam năm 2011- 2013 Bảng 3.3 Phân loại số chủngEV... 158, ND 171 Chủng ND 114 thuộc C4B, chủng ND 045 thuộc type C5 30 3.1.4 Đặc điểm gen số chủng EV – A71 gây bênh TCM Việt Nam năm 2011 – 2013 3.1.4.1 Kích thước gen số chủng EV - A71 Bảng 3.4