Bước đầu nghiên cứu đặc điểm bộ gen của một số chủng enterococus faecium kháng kháng sinh

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ MỸ LINH BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỘ GEN CỦA MỘT SỐ CHỦNG Enterococcus faecium KHÁNG KHÁNG SINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2020 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VŨ THỊ MỸ LINH MÃ SINH VIÊN: 1501292 BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM BỘ GEN CỦA MỘT SỐ CHỦNG Enterococcus faecium KHÁNG KHÁNG SINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS Lê Thị Hội PGS.TS Phùng Thanh Hương Nơi thực hiện: Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương Bộ mơn Hóa sinh Trường ĐH Dược Hà Nội HÀ NỘI – 2020 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin chân thành cám ơn giúp đỡ PGS.TS Phùng Thanh Hương, Bộ mơn Hóa Sinh, Đại học Dược Hà Nội, người cô giáo nhiệt huyết, bên hỗ trợ định hướng cho nhiều kiến thức, phương pháp nghiên cứu cách trình bày đề tài Tơi xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Trung, Phó giám đốc Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương, tạo điều kiện cho thực nghiên cứu Tiếp theo, muốn gửi lời cảm ơn tới TS Lê Thị Hội, Trưởng phòng Nghiên cứu phát triển, Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương, người giúp đỡ nhiều kiến thức chuyên môn, kinh nghiệm thực nghiệm đồng hành tơi vượt qua khó khăn suốt q trình thực đề tài Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS.BS Nguyễn Thị Hoa, Khoa xét nghiệm, Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương ThS.BS Doãn Thế Hà, Bác sỹ Nội trú, Đại học Y Hà Nội giúp đỡ nhiều cho lời khuyên quý báu suốt trình nghiên cứu Bệnh viện Tôi xin cảm ơn Khoa Xét nghiệm-Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương hỗ trợ, tạo điều kiện thuận lợi cho học tập tiến hành thực nghiệm Trân trọng cảm ơn tới thầy cô Bộ mơn Hóa sinh, phịng Đào Tạo Trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành khóa luận Cuối cùng, tơi muốn gửi lời cảm ơn tới gia đình bạn bè động viên bên cạnh ủng hộ Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Vũ Thị Mỹ Linh MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ ĐẶT VẤN ĐỀ Chương 1: 1.1 TỔNG QUAN Đại cương vi khuẩn Enterococcus faecium 1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn học 1.1.2 Dịch tễ khả gây bệnh 1.1.3 Cơ chế kháng kháng sinh vi khuẩn Enterococcus faecium 1.1.4 Dịch tễ học vi khuẩn Enterococcus faecium đa kháng 1.2 Phương pháp giải trình tự gen hệ (NGS) giải trình tự tồn bộ gen (WGS) 11 1.2.1 Khái niệm NGS WGS 11 1.2.2 Ứng dụng NGS WGS nghiên cứu vi khuẩn đa kháng 12 1.2.3 Các công cụ xử lý liệu NGS 12 1.3 Các nghiên cứu đặc điểm gen vi khuẩn Enterococcus faecium 14 1.3.1 Nghiên cứu giới 14 1.3.2 Nghiên cứu Việt Nam 16 Chương 2: 2.1 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 Đối tượng, nguyên liệu nghiên cứu 17 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 17 2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị 17 2.2 Nội dung nghiên cứu 17 2.2.1 Quy trình nghiên cứu 17 2.2.2 Các tiêu nghiên cứu 19 2.3 Phương pháp nghiên cứu 19 2.3.1 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn 19 2.3.2 Định danh vi khuẩn 19 2.3.3 Đánh giá độ nhạy với kháng sinh 20 2.3.4 Phương pháp phân tích liệu, số liệu 21 2.4 Vấn đề đạo đức nghiên cứu 22 Chương 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 23 3.1 Đặc điểm cấu trúc gen chủng Enterococcus faecium 23 3.2 Kết đánh giá độ nhạy với kháng sinh chủng Enterococcus faecium 24 3.3 Kết gen kháng kháng sinh chủng Enterococcus faecium 27 3.4 Sự phù hợp kiểu gen kiểu hình kháng kháng sinh 29 Chương 4: BÀN LUẬN 32 4.1 Đặc điểm cấu trúc gen chủng Enterococcus faecium 32 4.2 Kết đánh giá độ nhạy với kháng sinh chủng Enterococcus faecium 33 4.3 Gen kháng kháng sinh phù hợp kiểu gen kiểu hình kháng kháng sinh 34 KẾT LUẬN 38 KIẾN NGHỊ 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT Từ viết đầy đủ Ký hiệu Chú giải Tiếng Việt ADN Acid deoxyribonucleic bp base pair Cặp base CC Clonal complex Phức hệ dòng CDC Centers for Disease Control and Trung tâm Kiểm sốt Phịng Prevention CLSI ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ Clinical and Laboratory Standards Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng Xét Institute nghiệm Hoa Kỳ Cs Cộng EU/EEA European Union (EU) / European Liên minh Châu Âu Economic Area (EEA) ICU Intensive care unit Khoa hồi sức tích cực MDRO MuLti-Drug Resistant Organisms Vi khuẩn đa kháng thuốc MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu MLST Multilocus sequence typing Giải trình tự đa locus NGS Next generation sequencing Giải trình tự gen hệ NST Nhiễm sắc thể PCR Polymerase chain reaction ST Sequence type VRE Vancomycin resistant Enterococci Phản ứng khuếch đại chuỗi Cầu khuẩn ruột kháng faecium kháng Vancomycin VREfm Vancomycin resistant Enterocuccus Enterocuccus faecium VSE Vancomycin Vancomycin susceptible Cầu khuẩn ruột nhạy Vancomycin Enterococci VSEfm WGS Vancomycin susceptible Enterococcus faecium Enterococcus faecium Vancomycin Whole genome sequencing Giải trình tự tồn bộ gen nhạy DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Phân loại kháng kháng sinh nhóm Glycopeptid họ Enterococci Bảng 1.2 Các công cụ xử lý liệu NGS 13 Bảng 3.1 Đặc điểm gen chủng E faecium nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Kết đánh giá độ nhạy với kháng sinh chủng E faecium nghiên cứu 25 Bảng 3.3 Kết gen kháng kháng sinh chủng E faecium nghiên cứu 28 Bảng 3.4 Sự phù hợp kiểu gen kiểu hình kháng kháng sinh 30 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình 1.1 Cấu trúc cụm gen vanA, vanB Hình 1.2 Tần suất Enterococci kháng vancomycin (VanA VanB) theo thời gian theo khu vực địa lý, chương trình giám sát kháng sinh SENTRY, 1997-2016 10 Hình 2.1 Nội dung nghiên cứu 18 Hình 3.1 Tỷ lệ kháng kháng sinh chủng E faecium nghiên cứu 26 ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn Enterococcus faecium nguyên nhân thường gặp gây nhiễm khuẩn bệnh viện [9], [30] Chúng vi sinh vật cư trú đường tiêu hóa người, động vật gây nhiễm khuẩn mô mềm vết thương, nhiễm khuẩn huyết, viêm nội tâm mạc nhiễm khuẩn đường tiết niệu vật chủ gặp yếu tố nguy [23] Kháng sinh vancomycin lựa chọn đầu tay để điều trị nhiễm khuẩn E faecium, đặc biệt trường hợp E faecium kháng ampicillin [43] Tuy nhiên, sau lần đầu phát châu Âu vào cuối năm 1980, tình trạng E faecium kháng vancomycin ngày lan rộng toàn giới [74] Mỗi năm, Hoa Kỳ, vi khuẩn E faecium gây 10.000 đến 25.000 ca tử vong E faecium kháng vancomycin chiếm tới 80% chủng E faecium phân lập số bệnh viện [37] Bệnh nhân nhiễm khuẩn Enterococci kháng vancomycin (VRE) tăng tỷ lệ tử vong gấp 2,5 lần so với nhiễm khuẩn Enterococci nhạy vancomycin (VSE) [17] Năm 2017, Tổ chức Y tế giới (WHO) công bố danh sách 12 vi khuẩn kháng thuốc cần ưu tiên có kháng sinh E faecium kháng vancomycin xếp vào loại ưu tiên cao [76] E faecium lên phát triển kháng đa kháng sinh tiến hóa đa dạng hóa nhanh chóng [13] Để kiểm sốt tình trạng kháng kháng sinh, phát triển kháng sinh hay xác định đường lây truyền chủng E faecium thơng tin đặc điểm gen chúng cần thiết [40], [46] Nhờ ưu điểm hiệu suất, cơng nghệ giải trình tự gen hệ dần thay cho phương pháp giải trình tự Sanger giải trình tự đồng thời nhiều mẫu nhiều gen mục tiêu, chí giải mã tồn bộ gen (WGS) [39] Với cơng nghệ giải trình tự gen hệ mới, có thơng tin chi tiết cấu trúc gen, từ tạo điều kiện cho việc giám sát nhiễm khuẩn biện pháp chẩn đoán kiểm sốt thích hợp [34] Hiện nay, chưa có nhiều liệu E faecium kháng vancomycin nước Đơng Nam Á nói chung Việt Nam nói riêng [10], [73] Cho đến nay, hầu hết liệu giải trình tự tồn bộ gen vi khuẩn liên quan đến tình trạng kháng kháng sinh tập trung vào vi khuẩn Gram âm, có nghiên cứu vi khuẩn Gram dương, đặc biệt E faecium [56], [68] Tại Việt Nam, chưa có nghiên cứu dựa WGS để xác định phù hợp kiểu gen kiểu hình kháng kháng sinh chủng E faecium Xuất phát từ thực tế trên, thực đề tài: “Bước đầu nghiên cứu đặc điểm gen số chủng Enterococcus faecium kháng kháng sinh” với mục tiêu sau: Mô tả đặc điểm cấu trúc gen chủng Enterococcus faecium kháng kháng sinh phân lập Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương Xác định gen kháng kháng sinh, phù hợp kiểu gen kiểu hình kháng kháng sinh chủng Enterococcus faecium phân lập Bệnh viện Bệnh Nhiệt Đới Trung ương TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Anh 10 11 12 13 Abdelbary Mohamed H H., Senn Laurence, et al (2019), "Whole-genome sequencing revealed independent emergence of vancomycin-resistant Enterococcus faecium causing sequential outbreaks over years in a tertiary care hospital", European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases, 38(6), pp 1163-1170 Ali Amjad (2013), "Microbial Comparative Genomics: An Overview of Tools and Insights Into The Genus Corynebacterium", Journal of Bacteriology & Parasitology, 04(02), pp 25-39 Arias Cesar A., Murray Barbara E (2012), "The rise of the Enterococcus: beyond vancomycin resistance", Nature Reviews Microbiology, 10(4), pp 266-278 Bender Jennifer K., Cattoir Vincent, et al (2018), "Update on prevalence and mechanisms of resistance to linezolid, tigecycline and daptomycin in enterococci in Europe: Towards a common nomenclature", Drug Resistance Updates, 40, pp 25-39 Boolchandani Manish, D’Souza Alaric W., et al (2019), "Sequencing-based methods and resources to study antimicrobial resistance", Nature Reviews Genetics, 20(6), pp 356-370 Cattoir Vincent, Leclercq Roland (2012), "Twenty-five years of shared life with vancomycin-resistant enterococci: is it time to divorce?", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 68(4), pp 731-742 Choe Hyun-Sop, Lee Seung-Ju, et al (2018), "Aspects of urinary tract infections and antimicrobial resistance in hospitalized urology patients in Asia: 10-Year results of the Global Prevalence Study of Infections in Urology (GPIU)", Journal of Infection and Chemotherapy, 24(4), pp 278-283 Courvalin Patrice (2006), "Vancomycin Resistance in Gram-Positive Cocci", Clinical Infectious Diseases, 42(Supplement_1), pp S25-S34 Da Silva Leila Priscilla Pinheiro, Pitondo-Silva André, et al (2012), "Genetic features and molecular epidemiology of Enterococcus faecium isolated in two university hospitals in Brazil", Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 74(3), pp 267-271 Daniel Diane Sunira, Lee Sui Mae, et al (2015), "Public Health Risks of Multiple-Drug-Resistant Enterococcus spp in Southeast Asia", Applied and environmental microbiology, 81(18), pp 6090-6097 Das Arghya, Banerjee Tuhina, et al (2019), "Susceptibility of Nitrofurantoin and Fosfomycin Against Outpatient Urinary Isolates of Multidrug-Resistant Enterococci over a Period of 10 Years from India", Microbial Drug Resistance, pp Diab Manal, Salem Dalia, et al (2019), "Detection of high level aminoglycoside resistance genes among clinical isolates of Enterococcus species", Egyptian Journal of Medical Human Genetics, 20(1), pp 28 Dubin Krista A., Mathur Deepti, et al (2019), "Diversification and Evolution of Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium during Intestinal Domination", 87(7), pp e00102-19 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Edwards David J., Holt Kathryn E (2013), "Beginner’s guide to comparative bacterial genome analysis using next-generation sequence data", Microbial Informatics and Experimentation, 3(1), pp Estée Török Ed Moran, Fiona Cooke (2009), Oxford Handbook of Infectious Diseases and Microbiology 2nd edition, pp 245-247 Eyre David W., Babakhani Farah, et al (2013), "Whole-Genome Sequencing Demonstrates That Fidaxomicin Is Superior to Vancomycin for Preventing Reinfection and Relapse of Infection With Clostridium difficile", The Journal of Infectious Diseases, 209(9), pp 1446-1451 Faron Matthew L., Ledeboer Nathan A., et al (2016), "Resistance Mechanisms, Epidemiology, and Approaches to Screening for Vancomycin-Resistant Enterococcus in the Health Care Setting", Journal of Clinical Microbiology, 54(10), pp 2436 Fisher Katie, Phillips Carol (2009), "The ecology, epidemiology and virulence of Enterococcus", Microbiology, 155(6), pp 1749-1757 Ford Christopher B., Shah Rupal R., et al (2013), "Mycobacterium tuberculosis mutation rate estimates from different lineages predict substantial differences in the emergence of drug-resistant tuberculosis", Nature genetics, 45(7), pp 784790 Fritz Brian, Raczniak Gregory A (2002), "Bacterial Genomics", BioDrugs, 16(5), pp 331-337 Gao Wei, Howden Benjamin P., et al (2018), "Evolution of virulence in Enterococcus faecium, a hospital-adapted opportunistic pathogen", Current Opinion in Microbiology, 41, pp 76-82 Garneau-Tsodikova Sylvie, Labby Kristin J (2016), "Mechanisms of Resistance to Aminoglycoside Antibiotics: Overview and Perspectives", MedChemComm, 7(1), pp 11-27 Golob Majda, Pate Mateja, et al (2019), "Antimicrobial Resistance and Virulence Genes in Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis from Humans and Retail Red Meat", BioMed Research International, 2019, pp 12 Gordon N C., Price J R., et al (2014), "Prediction of Staphylococcus aureus Antimicrobial Resistance by Whole-Genome Sequencing", 52(4), pp 11821191 Gorrie Claire, Higgs Charlie, et al (2019), "Genomics of vancomycin-resistant Enterococcus faecium", Microbial genomics, 5(7), pp e000283 Gutmann L, Billot-Klein D, et al (1992), "Inducible carboxypeptidase activity in vancomycin-resistant enterococci", 36(1), pp 77-80 Hasman Henrik, Saputra Dhany, et al (2014), "Rapid Whole-Genome Sequencing for Detection and Characterization of Microorganisms Directly from Clinical Samples", Journal of Clinical Microbiology, 52, pp 3136-3136 Hollenbeck Brian L., Rice Louis B (2012), "Intrinsic and acquired resistance mechanisms in enterococcus", Virulence, 3(5), pp 421-569 J Pevsner (2015), Bioinformatics and Functional Genomics, 3rd Ed Wiley Blackwell, pp 25-31 Jabbari Shiadeh Seyedeh Marzieh, Pormohammad Ali, et al (2019), "Global prevalence of antibiotic resistance in blood-isolated Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium: a systematic review and meta-analysis", Infection and drug resistance, 12, pp 2713-2725 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 John E Bennett MD Raphael Dolin MD Martin J Blaser (2014), MD Mandell, Douglas, and Bennett's Principles and Practice of Infectious Diseases_ 2Volume Set, 8e-Saunders pp 140-148 K Kulski Jerzy (2016), "Next-Generation Sequencing — An Overview of the History, Tools, and “Omic” Applications," Next Generation Sequencing Advances, Applications and Challenges", pp Kim Dokyun, Ahn Ji Young, et al (2017), "Increasing Resistance to ExtendedSpectrum Cephalosporins, Fluoroquinolone, and Carbapenem in Gram-Negative Bacilli and the Emergence of Carbapenem Non-Susceptibility in Klebsiella pneumoniae: Analysis of Korean Antimicrobial Resistance Monitoring System (KARMS) Data From 2013 to 2015", Ann Lab Med, 37(3), pp 231-239 Köser Claudio U., Ellington Matthew J., et al (2014), "Whole-genome sequencing to control antimicrobial resistance", Trends in Genetics, 30(9), pp 401-407 Lam Margaret M C., Seemann Torsten, et al (2012), "Comparative analysis of the first complete Enterococcus faecium genome", Journal of bacteriology, 194(9), pp 2334-2341 Lam Margaret M C., Seemann Torsten, et al (2013), "Comparative analysis of the complete genome of an epidemic hospital sequence type 203 clone of vancomycin-resistant Enterococcus faecium", BMC Genomics, 14(1), pp 595 Lebreton Franỗois, van Schaik Willem, et al (2013), "Emergence of epidemic multidrug-resistant Enterococcus faecium from animal and commensal strains", mBio, 4(4), pp e00534-13 Liese Jan, Schüle Leonard, et al (2019), "Expansion of Vancomycin-Resistant Enterococcus faecium in an Academic Tertiary Hospital in Southwest Germany: a Large-Scale Whole-Genome-Based Outbreak Investigation", Antimicrobial agents and chemotherapy, 63(5), pp e01978-18 Liu Lin, Li Yinhu, et al (2012), "Comparison of Next-Generation Sequencing Systems", Journal of Biomedicine and Biotechnology, 2012, pp 251364 López M., et al (2012), "Diversity of Clones and Genotypes Among Vancomycin-Resistant Clinical Enterococcus Isolates Recovered in a Spanish Hospital", 18(5), pp 484-491 Maxam A M, Gilbert W (1977), "A new method for sequencing DNA", 74(2), pp 560-564 McDermott Patrick F., Tyson Gregory H., et al (2016), "Whole-Genome Sequencing for Detecting Antimicrobial Resistance in Nontyphoidal Salmonella", 60(9), pp 5515-5520 MD hD Alan R Hauser (2012), Antibiotic Basics for Clinicians: The ABCs of Choosing the Right Antibacterial Agent Second Edition, pp 113-115 Menzies Dick (2013), "Molecular methods for tuberculosis trials: time for wholegenome sequencing?", The Lancet Respiratory Medicine, 1(10), pp 759-761 Miller William R., Munita Jose M., et al (2014), "Mechanisms of antibiotic resistance in enterococci", Expert Review of Anti-infective Therapy, 12(10), pp 1221-1236 Müller Borna, Borrell Sonia, et al (2013), "The heterogeneous evolution of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis", Trends in Genetics, 29(3), pp 160-169 Murray B E (1990), "The life and times of the Enterococcus", 3(1), pp 46-65 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 Murray Patrick R (2012), "What is new in clinical microbiology-microbial identification by MALDI-TOF mass spectrometry: a paper from the 2011 William Beaumont Hospital Symposium on molecular pathology", The Journal of molecular diagnostics : JMD, 14(5), pp 419-423 Nishioka Toshihiro, Ogawa Wakano, et al (2009), "Gene Cloning and Characterization of EfmA, a Multidrug Efflux Pump, from Enterococcus faecium", Biological and Pharmaceutical Bulletin, 32(3), pp 483-488 Niu Haiying, Yu Hui, et al (2016), "The prevalence of aminoglycosidemodifying enzyme and virulence genes among enterococci with high-level aminoglycoside resistance in Inner Mongolia, China", Brazilian journal of microbiology : [publication of the Brazilian Society for Microbiology], 47(3), pp 691-696 O'Driscoll Tristan, Crank Christopher W (2015), "Vancomycin-resistant enterococcal infections: epidemiology, clinical manifestations, and optimal management", Infection and drug resistance, 8, pp 217-230 Otto Michael (2017), "Next-generation sequencing to monitor the spread of antimicrobial resistance", Genome medicine, 9(1), pp 68-68 Papagiannitsis C C., Malli E., et al (2017), "First description in Europe of the emergence of Enterococcus faecium ST117 carrying both vanA and vanB genes, isolated in Greece", Journal of Global Antimicrobial Resistance, 11, pp 68-70 Pfaller Michael A, Cormican Martin, et al (2019), "Temporal and Geographic Variation in Antimicrobial Susceptibility and Resistance Patterns of Enterococci: Results From the SENTRY Antimicrobial Surveillance Program, 1997–2016", Open Forum Infectious Diseases, 6(Supplement_1), pp S54-S62 Punina N V., Makridakis N M., et al (2015), "Whole-genome sequencing targets drug-resistant bacterial infections", Human Genomics, 9(1), pp 19 Qin Xiang, Galloway-Peña Jessica R., et al (2012), "Complete genome sequence of Enterococcus faecium strain TX16 and comparative genomic analysis of Enterococcus faecium genomes", BMC Microbiology, 12(1), pp 135 Quainoo Scott, Coolen Jordy P M., et al (2017), "Whole-Genome Sequencing of Bacterial Pathogens: the Future of Nosocomial Outbreak Analysis", Clinical Microbiology Reviews, 30(4), pp 1015 Reller L Barth, Weinstein Melvin, et al (2009), "Antimicrobial Susceptibility Testing: A Review of General Principles and Contemporary Practices", Clinical Infectious Diseases, 49(11), pp 1749-1755 Remschmidt Cornelius, Schröder Christin, et al (2018), "Continuous increase of vancomycin resistance in enterococci causing nosocomial infections in Germany − 10 years of surveillance", Antimicrobial Resistance & Infection Control, 7(1), pp 54 Roberts Marilyn C (2005), "Update on acquired tetracycline resistance genes", FEMS Microbiology Letters, 245(2), pp 195-203 Sanger F., Nicklen S., et al (1977), "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors", 74(12), pp 5463-5467 Santona Antonella, Taviani Elisa, et al (2018), "Emergence of unusual vanA/vanB2 genotype in a highly mutated vanB2-vancomycin-resistant hospitalassociated E faecium background in Vietnam", International Journal of Antimicrobial Agents, 52(5), pp 586-592 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 Singh K V., Malathum K., et al (2001), "Disruption of an Enterococcus faecium species-specific gene, a homologue of acquired macrolide resistance genes of staphylococci, is associated with an increase in macrolide susceptibility", Antimicrobial agents and chemotherapy, 45(1), pp 263-266 Suzuki Masashi, Koyano Saho, et al (2014), "Diversity of vancomycin-resistant enterococci in a low endemicity area", Journal of Global Antimicrobial Resistance, 2(2), pp 115-118 Tedim Ana P., Lanza Val F., et al (2017), "Complete Genome Sequences of Isolates of Enterococcus faecium Sequence Type 117, a Globally Disseminated Multidrug-Resistant Clone", 5(13), pp e01553-16 Toprak Erdal, Veres Adrian, et al (2011), "Evolutionary paths to antibiotic resistance under dynamically sustained drug selection", Nature genetics, 44(1), pp 101-105 Török M., Peacock S J (2012), "Rapid whole-genome sequencing of bacterial pathogens in the clinical microbiology laboratory–Pipe dream or reality?", The Journal of antimicrobial chemotherapy, 67, pp 2307-8 Tyson Gregory H, Sabo Jonathan L, et al (2018), "Whole-genome sequencing based characterization of antimicrobial resistance in Enterococcus", Pathogens and Disease, 76(2), pp Tyson Gregory H., McDermott Patrick F., et al (2015), "WGS accurately predicts antimicrobial resistance in Escherichia coli", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 70(10), pp 2763-2769 Valdezate Sylvia, Labayru Cristina, et al (2008), "Large clonal outbreak of multidrug-resistant CC17 ST17 Enterococcus faecium containing Tn5382 in a Spanish hospital", Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 63(1), pp 17-20 Wang Jann-Tay, Chang Shan-Chwen, et al (2013), "High rates of multidrug resistance in Enterococcus faecalis and E faecium isolated from inpatients and outpatients in Taiwan", Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 75(4), pp 406-411 Ward Doyle V., Hoss Andrew G., et al (2019), "Integration of genomic and clinical data augments surveillance of healthcare-acquired infections", Infection Control & Hospital Epidemiology, 40(6), pp 649-655 Weng Poh Leng, Ramli Ramliza, et al (2013), "High genetic diversity of Enterococcus faecium and Enterococcus faecalis clinical isolates by pulsed-field gel electrophoresis and multilocus sequence typing from a hospital in Malaysia", BioMed research international, 2013, pp 938937-938937 Werner Guido, Coque T M., et al., Emergence and spread of vancomycin resistance among enterococci in Europe 2008, Robert Koch-Institut, Infektionskrankheiten / Erreger p pp 19046 Willems Rob J L., Top Janetta, et al (2012), "Restricted Gene Flow among Hospital Subpopulations of Enterococcus faecium", 3(4), pp e00151-12 World Health Organization (2017), WHO publishes list of bacteria for which new antibiotics are urgently needed: Geneva Yang Jia, Yuan Yi, et al (2019), "Phenotypic and genetic characteristics of vancomycin-resistant Enterococcus faecium", Microbial Pathogenesis, 128, pp 131-135 78 Zhanel George, Hoban Daryl, et al (2001), "Nitrofurantoin Is Active against Vancomycin-Resistant Enterococci", Antimicrobial agents and chemotherapy, 45, pp 324-6 Trang web 79 https://card.mcmaster.ca/ 80 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/871 81 https://pubmlst.org/efaecium/ 82 https://rast.nmpdr.org/rast.cgi 83 https://cge.cbs.dtu.dk//services/ResFinder/ PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) 13 kháng sinh với chủng E faecium nghiên cứu Kháng sinh Chủng VAN TEI GEN KAN STR ERY CLI TET Q/D LNZ TGC NIT AMP NHP012 ≥32 ≤0.5 ≥500 ≥1000 < 1000 ≥8 ≥8 ≥16 1 ≤0.12 128 ≥32 NHP226 ≥32 ≤0.5 ≥500 ≥1000 < 1000 ≥8 ≥8 ≥16 ≤0.12 128 ≥32 NHP241 ≥32 ≥32 ≥500 ≥1000 < 1000 ≥8 ≥8 ≥16 0.5 ≤0.12 128 ≥32 NHP265 ≥32 ≥500 ≥1000 < 1000 ≥8 ≥8 ≥16 1 ≤0.12 128 ≥32 NHP306 ≥32 ≤0.5 ≥500 ≥1000 < 1000 ≥8 ≥8 ≥16 ≤0.12 128 ≥32 NHP361 ≥32 ≤0.5 ≥500 ≥1000 < 1000 ≥8 ≥8 ≥16 1 ≤0.12 128 ≥32 NHP903 ≥32 ≥32 ≥500 ≥1000 ≥1000 ≥8 ≥8 ≤1 ≤0.12 32 ≥32 NHP912 ≥32 ≥32 ≥500 ≥1000 ≥1000 ≥8 ≥8 ≥16 0.5 ≤0.12 128 ≥32 NHP959 ≥32 ≥32 ≥500 ≥1000 ≥1000 ≥8 ≥8 ≤1 ≤0.12 ≤16 ≥32 NHP979 ≥32 ≤0.5 ≥500 ≥1000 ≥1000 ≥8 ≥8 ≥16 2 ≤0.12 128 ≥32 NHP1024 ≥32 ≥32 ≥500 ≥1000 ≥1000 ≥8 ≥8 ≥16 0.5 ≤0.12 64 ≥32 NHP1157 ≥32 ≥32 ≥500 ≥1000 ≥1000 ≥8 ≥8 ≥16 0.5 ≤0.12 64 ≥32 NHP1184 ≥32 ≥32 ≥500 ≥1000 ≥1000 ≥8 ≥8 ≤1 2 ≤0.12 32 ≥32 NHP1202 ≥32 ≥32 ≥500 ≥1000 ≥1000 ≥8 ≥8 ≤1 ≤0.12 ≤16 ≥32 NHP1246 ≥32 ≥32 ≥500 ≥1000 ≥1000 ≥8 ≥8 ≥16 0.5 ≤0.12 64 ≥32 NHP1250 ≥32 ≤0.5 ≥500 ≥1000 < 1000 ≥8 ≥8 ≥16 ≤0.12 128 ≥32 Chú thích: MIC (µg/ml) VAN: Vancomycin; TEI: Teicoplanin, GEN: Gentamicin, KAN: Kanamycin, STR: Streptomycin, ERY: Erythromycin, CLI: Clindamycin, TET: Tetracyclin, TGC: Tigecyclin, LNZ: Linezolid, Q/D: Quinupristin / Dalfopristin, NIT: Nitrofurantoin, AMP: Ampicillin Giá trị Mic (Cut-off) 13 kháng sinh đánh giá độ nhạy nghiên cứu, dựa tiêu chuẩn Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng Xét nghiệm Hoa Kỳ (CLSI) Kháng sinh Mic (cut-off) Kháng sinh µg/ml Mic (cut-off) µg/ml Vancomycin 32 Tetracyclin 16 Teicoplanin 32 Tigecyclin 0.12 Gentamicin 500 Linezolid Kanamycin 1000 Quinupristin/dalfopristin Streptomycin 1000 Nitrofurantoin 128 Erythromycin Ampicillin 16 Clindamycin Phụ lục 2: Quy trình phương pháp giải trình tự gen hệ Illumina  Bước 1: Đo chuẩn hóa nồng độ ADN tổng số vi khuẩn Mục đích: đo nồng độ sản phẩm PCR thu pha loãng nồng độ yêu cầu a) cho bước chuẩn bị mẫu cho trình giải trình tự Quy trình: b) Sử dụng thiết bị Qubit fluorimeter (Life Technologies, MD), ống đo chuyên dụng kit: dsADN HS Assay Cách tiến hành: - Pha hóa chất Qubit Working Solution theo tỷ lệ μL QuBit reagent: 199 μL QuBit Buffer - Pha hỗn hợp dung dịch đo nồng độ ADN ống đo chuyên dụng theo bước sau: + Tiêu chuẩn: 10 μL standard 190 μL Qubit working solution; + Mẫu cần đo nồng độ ADN: μL mẫu 198 μL Qubit working solution + Đưa standard mẫu vào máy Qubit đo nồng độ ADN - Pha loãng hỗn hợp đến nồng độ 0,2 ng/μL  Bước 2: Cắt ADN thành đoạn ngắn a) Mục đích: Cắt ADN thành đoạn ngắn b) Chuẩn bị: - Bộ kit Nextera XT sample preparation - Sử dụng protocol chuẩn bị mẫu - Ống PCR 0,2ml Quy trình c) C1: Chuẩn bị hóa chất pha mix - Rã đơng ống ATM (Amplicon Tagment Mix), TD (Tagment DNA Buffer), mẫu ADN, giữ khay đá - Làm ấm ống NT (Neutralize Tagment Buffer) đến nhiệt độ phòng - Chuẩn bị NTA (Nextera XT Tagment Amplicon) - Mix NTA gồm: Hóa chất Thể tích Chú ý TD Buffer 10 μL ADN (0.2ng/μL) μL Pipette nhẹ sau trộn ATM μL Pipette nhẹ sau trộn - Đưa ống NTA vào máy PCR chạy chương trình sau để kích hoạt enzyme - Ngay sau đạt đến 10℃, chuyển sang bước C2: Vô hiệu hóa enzyme ống NTA - Cẩn thận mở nắp ống NTA thêm μL đệm NT vào ống, hút nhả pipet lần để trộn - Đậy nắp ly tâm 280 xg 20°C phút - Ủ ống NTA nhiệt độ phòng phút để đảm bảo enzyme bị bất hoạt hoàn toàn  Bước 3: PCR gắn Index Hóa chất a) - NPM: 15 μL mẫu; - Nextera XT Index Primers (N7XX): μl mẫu; - Nextera XT Index Primers (S5XX) :5 μl mẫu; Quy trình b) Chuẩn bị: Rã đơng hóa chất Nextera XT index - Sắp xếp index (mồi I7 có nắp màu cam) để theo chiều ngang Sắp xếp index (mồi I5 có nắp trắng) theo thứ tự theo chiều dọc - Để tránh ô nhiễm chéo, loại bỏ tất nắp dùng thay nắp cung cấp theo kit thay đầu côn sau lần hút - Đậy nắp ống ly tâm 1000 xg 20°C phút, để đảm bảo hóa chất tập trung đáy ống - Thành phần phản ứng sau: Thành phần Thể tích ADN sau tagmentation (ống NTA) 25 μl Nextera XT Index Primer (N7xx) μl Nextera XT Index Primer (S5xx) μl NPM 15 μl Tổng số 50 μl - Tiến hành phản ứng PCR để gắn index theo chu trình nhiệt sau: 72°C: phút 95°C: 30 giây 12 chu kỳ : 95°C: 10 giây 55°C: 30 giây 72°C: 30 giây 72°C: phút 10°C: ∞ - Lưu ý: chưa sử dụng sản phẩm PCR, bảo quản nhiệt độ – 8°C ngày  Bước 4: Tinh sản phẩm PCR Chuẩn bị: a) - AMPure XP beads 90 μl/ mẫu (đối với mẫu có kích thước 300-500bp) (đưa nhiệt độ thường trước sử dụng) - Pha 80% Ethanol (EtOH) (400 μl mẫu) từ EtOH tuyệt đối - 0.2 ml PCR ống - Giá từ Quy trình b) - Tùy thuộc vào kích thước amplicon mà thể tích AMPure Bead sử dụng khác Kích thước amplicon AMPure XP sử dụng Thể tích AMPure XP < 300 bp 1.8x AMPure XP 90 μl 300-500bp 1.8x AMPure XP 90 μl 0.6x AMPure XP 30 μl > 500 bp - Vortex AMPure XP 30 giây - Thêm 90 μL AMPure XP vào mẫu, hút nhả pipet 10 lần đảm bảo hat bead hồn tồn trộn - Ủ nhiệt độ phịng phút đểADN bám vào hạt bead - Đặt ống giá từ phút, để đảm bảo lực từ giữ chặt hạt bead với ADN bám - Sử dụng pipet hút tồn dich ống - Rửa với ethanol 80% (2 lần) sau: + Thêm 200 µl ethanol 80% vào ống + Để 30 giây + Cẩn thận loại bỏ dịch phía - Giữ nguyên plate giá từ, để khô tự nhiên 15 phút - Nhấc plate khỏi giá từ, - Dùng pipet thêm 52,5 µl RSB (Resuspension Buffer) vào ống mẫu, hút nhả pipet 10 lần - Để nhiệt độ phòng phút - Đặt ống lên giá từ phút, để lực từ hút hết hạt bead xuống - Ký hiệu plate - Dùng pipet, cẩn thận chuyển 50 µl dịch phía từ plate cũ sang plate mới, thay đầu côn sau lần thao tác - Lưu ý: bảo quản mẫu tinh nhiệt độ từ -15 đến -25°C vòng tuần  Bước 5: Chuẩn hóa mẫu, định lượng thư viện Chuẩn bị hóa chất a) - LNA1 (LibraryNormalization Additives 1) - LNB1 (Library Normalization Beads 1) - LNW1 (Library Normalization Wash 1) - LNS1 (Library Normalization Storage Buffer 1) - 0.1 N NaOH - 96-well plate: plate - Ống ống 15 ml: ống b) Đo nồng độ ADN bằng Qubit c) Quy trình chuẩn hóa mẫu c1 Chuẩn bị hóa chất - Rã đông ống LNA1 (Library Normalization Additives 1) làm ấm ống LNB1 (Library Normalization Beads 1) LNW1 (Library Normalization Wash 1) nhiệt độ phòng - Voltex LNB1 phút đảo nghịch liên tục khoảng 15 đến 20 lần - Làm ấm ống LNS1 (Library Normalization Storage Buffer 1) nhiệt độ phòng trước sử dụng c2.Tiến hành - Pha hỗn hợp LNA1/LNB1: (tỷ lệ hóa chất 1.1 : 0.2) thể tích dụa theo số lượng mẫu (45 μL x N) Thành phần Thể tích LNA1 1.1 ml LNB1 200 μL Thao tác kèm theo Trộn ống LNB1 pipet - Chuyển 20 μL dịch phía từ sản phẩm PCR tinh (CAN) sang ống PCR (LNP) - Hút 45 μL hỗn hợp LNA1/LNB1 vào ống LNP chứa sẵn mẫu - Lắc ống LNP vận tốc 1.800 rpm 30 phút để đảm bảo sợi ADN bám vào hạt bead với mật độ đồng - Để ống giá từ phút để lực từ hút hạt bead có gắn ADN xuống đáy ống - Giữ nguyên ống LNP giá từ, cẩn thận loại bỏ 80 μL dịch phía - Nhấc ống LNP khỏi giá từ tiến hành bước rửa với LNW1 sau: (lặp lại lần) + Thêm 45 μL LNW1 ống + Đóng chặt nắp ống + Lắc với vận tốc 1.800 rpm phút + Đặt ống gía từ phút + Cẩn thận loại bỏ dịch phía trên, thay đầu côn sau lần thao tác - Nhấc ống LNP khỏi giá từ, thêm 30 μL NaOH 0.1N vào ống để thơi mẫu - Đóng chặt nắp lắc ống LNP vận tốc 1.800 rpm phút để đảm bảo ADN bị hết khỏi hạt bead - Trong lắc, chuẩn bị ống SGP (StoraGe Plate) (là ống PCR) - Cho 30 μL LNS1 vào ống SGP - Sau phút lắc, kiểm tra, đảm bảo tất mẫu LNP trộn hoàn toàn Nếu thấy mẫu khơng trộn hồn tồn, nhẹ nhàng hút nhả pipet đến lần, lắc thêm phút - Đặt ống LNP giá từ phút để hút toàn hạt bead xuống đáy ống - Chuyển 30 μL dịch phía chứa ADN từ ống LNP sang ống SGP - Ly tâm 1.000 x g phút - Lưu ý: giữ ống nhiệt độ -15 đến -20℃ chưa muốn chạy giải trình tự  Bước 6: Đưa mẫu vào máy, thao tác máy Chuẩn bị: a) - Điều chỉnh Block nhiệt cho ống 1.5ml 96℃ - Rã đơng hóa chất Miseq Reagent để nhiệt độ phòng - Water ice - HT1 - Resuspension Buffer Quy trình b) - Nếu ống SGP bảo quản đông lạnh, làm ấm ống SGP đến nhiệt độ phòng, hút nhả 3-5 lần ống SGP để trộn ADN - Ly tâm ống SGP 1000xg vòng phút 20℃ - Ký hiệu ống eppendorf - PAL (Pool Amplicon Library) - Chuyển 12 μL mẫu ống SGP sang ống PAL - Ký hiệu ống eppendorf - DAL ( Dilluted Amplicon Library) - Thêm 588 μL hóa chất hỗ trợ cho sợi ADN bám vào flowcell HT1 vào ống Dal - Chuyển 24 μL hỗn hợp ADN từ PAL sang DAL có chứa HT1 - Vortex mẫu DAL với tốc độ cao - Biến tính mẫu DAL vào block nhiệt 96℃, ủ phút sốc nhiệt đá phút - Đưa toàn hỗn hợp hộp DAL vào khay Miseq Reagent Cartridge theo vị trí load Samples khay - Đưa vào thao tác máy Miseq ... 3.1 Đặc điểm gen chủng E faecium nghiên cứu 23 Bảng 3.2 Kết đánh giá độ nhạy với kháng sinh chủng E faecium nghiên cứu 25 Bảng 3.3 Kết gen kháng kháng sinh chủng E faecium nghiên. .. hình kháng kháng sinh chủng E faecium Xuất phát từ thực tế trên, thực đề tài: ? ?Bước đầu nghiên cứu đặc điểm gen số chủng Enterococcus faecium kháng kháng sinh? ?? với mục tiêu sau: Mô tả đặc điểm. .. - Các gen kháng kháng sinh phù hợp kiểu gen kiểu hình kháng kháng sinh: Có 13 gen kháng kháng sinh tìm thấy chủng bao gồm: gen kháng nhóm glycopepetid (vanA vanB), gen kháng nhóm kháng sinh aminoglycosid