khảo sát một số điều kiện để tạo chế phẩm bột vi khuẩn bacillus subtilis s20

... Khảo sát số điều kiện để tạo chế phẩm bột vi khuẩn Bacillus subtilis S20 thực với mục đích nghiên cứu loại đường để phối trộn, tỉ lệ phối trộn, nhiệt độ sấy điều kiện bảo quản phù hợp để tạo. .. bã mía vi khuẩn) - Sấy khô sản phẩm 40 oC 24h - Đánh giá chế phẩm: + Khảo sát mật số vi khuẩn có chế phẩm Hòa 0,1g chế phẩm vào 10ml nước muối sinh lý, pha loãng đếm mật số + Khảo sát khả tạo vòng... Vì thế, đề tài Khảo sát số điều kiện để tạo chế phẩm bột vi khuẩn Bacillus subtilis S20 tiến hành 1.2 Mục tiêu đề tài Xác định loại đường, nồng độ phối trộn thích hợp, điều kiện sấy nhiệt độ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC --- --- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN ĐỂ TẠO CHẾ PHẨM BỘT VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS S20 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. VÕ VĂN SONG TOÀN NGUYỄN THỊ NHƯ ANH PGs.TS. TRẦN NHÂN DŨNG MSSV: 3103945 LỚP: Vi sinh vật học K36 Cần Thơ, Tháng 12/2013 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC --- --- LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC KHẢO SÁT MỘT SỐ ĐIỀU KIỆN ĐỂ TẠO CHẾ PHẨM BỘT VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS S20 SINH VIÊN THỰC HIỆN NGUYỄN THỊ NHƯ ANH MSSV: 3103945 LỚP: Vi sinh vật học K36 Cần Thơ, Tháng 12/2013 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 1 SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS. Võ Văn Song Toàn Nguyễn Thị Như Anh CÁN BỘ HƯỚNG DẪN 2 PGs. TS. Trần Nhân Dũng XÉT DUYỆT CỦA BỘ MÔN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………. Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Trong suốt quá trình thực hiện đề tài Luận văn tốt nghiệp tại trường Đại học Cần Thơ có không ít khó khăn, trở ngại, nhưng nhờ sự động viên của gia đình, sự giúp đỡ của thầy cô, bạn bè và sự nỗ lực của bản thân đã giúp tôi hoàn thành đề tài nghiên cứu này. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Phó giáo sư – Tiến sĩ Trần Nhân Dũng, Viện trưởng Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, trường Đại học Cần Thơ, Thạc sĩ Võ Văn Song Toàn – người thầy đã cố vấn chuyên môn và truyền đạt cho tôi rất nhiều kinh nghiệm bổ ích cũng như hỗ trợ cho tôi về mặt kiến thức và ứng dụng thực tiễn, đồng thời đã tạo điều kiện thuận lợi nhất để tôi hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này. Xin chân thành cám ơn quý thầy cô của Viện NC&PT Công nghệ Sinh học đã tận tình truyền dạy cho tôi kiến thức giúp tôi có những nền tảng vững chắc về mặt chuyên môn phục vụ cho việc thực hiện đề tài. Xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị, các bạn, các em làm việc tại phòng CNSH Enzyme đã nhiệt tình giúp đỡ và chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu trong suốt thời gian tôi học tập và thực hiện đề tài. Cuối cùng tôi xin dành tình cảm biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, những người đã khích lệ động viên tinh thần cũng như hỗ trợ vật chất giúp tôi vượt qua nhiều khó khăn và thực hiện tốt đề tài nghiên cứu này. Kính chúc quý vị nhiều sức khỏe, hạnh phúc và thành đạt. Xin trân trọng cảm ơn! Cần Thơ, ngày 21 tháng 11 năm 2013 Nguyễn Thị Như Anh Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Đề tài “Khảo sát một số điều kiện để tạo chế phẩm bột vi khuẩn Bacillus subtilis S20” được thực hiện với mục đích nghiên cứu loại đường để phối trộn, tỉ lệ phối trộn, nhiệt độ sấy cũng như điều kiện bảo quản phù hợp để tạo chế phẩm vi sinh phân giải bã mía, hỗ trợ tiêu hóa cho gia súc nhai lại. Vi khuẩn được nuôi tăng sinh sau đó ly tâm loại bỏ dịch và tiến hành các thí nghiệm khảo sát về mật số vi khuẩn, đường kính vòng halo, độ ẩm, khả năng phân giải bã mía, xơ thô nhằm kiểm tra chất lượng của sản phẩm. Kết quả khảo sát từ các loại đường: Galactose, Glucose, Lactose, Mannose, Mannitol, Fructose đã lựa chọn được Lactose để phối trộn với khả năng giữ ẩm tốt, làm tăng độ số sót của vi khuẩn. Lactose được phối trộn với hỗn hợp bã mía và vi khuẩn theo tỉ lệ 67,7% đường trong tổng khối lượng sản phẩm. Nhiệt độ sấy chế phẩm ở 45oC cho hiệu quả tối ưu khi vẫn đảm bảo về mật số cũng như khả năng phân giải bã mía. Kết quả kiểm tra chế phẩm sau 30 ngày và bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 4oC: mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm là 8,87 log CFU/g, đường kính vòng halo phân giải bã mía 19 mm, tỉ lệ tiêu hóa DM, CF lần lượt là 14,81; 19,57 % (m/m). Từ khóa: Bacillus subtilis, bã mía, chế phẩm vi sinh, Lactose, phân giải bã mía Vi sinh vật học K36 i Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT MỤC LỤC TÓM LƯỢC................................................................................................................ i MỤC LỤC ..................................................................................................................ii DANH SÁCH BẢNG ................................................................................................ xi DANH SÁCH HÌNH ...............................................................................................xiii TỪ VIẾT TẮT ........................................................................................................ xiv CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU........................................................................................ 1 1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1 1.2. Mục tiêu đề tài .................................................................................................. 2 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .................................................................. 3 2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................................. 3 2.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại ..................................................................... 3 2.1.2. Đặc điểm sinh thái học và phân bố tự nhiên ................................................. 3 2.1.3. Khả năng sinh bào tử và thích ứng với điều kiện sống ................................. 4 2.1.4. Vi khuẩn Bacillus subtilis S20 ..................................................................... 5 2.2. Vai trò của Bacillus subtilis đối với hệ tiêu hóa của động vật............................. 5 2.3. Tổng quan về bã mía và các thành phần xơ trong bã mía ................................... 6 2.3.1 Tổng quan về bã mía .................................................................................... 6 2.3.2 Các thành phần chính trong bã mía ............................................................... 7 2.3.2.1. Cellulose ............................................................................................................... 8 2.3.2.2. Hemicellulose...................................................................................................... 9 2.3.2.3. Lignin.................................................................................................. 10 2.4. Enzyme cellulase ............................................................................................. 10 2.5. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên khả năng phân giải bã mía của vi khuẩn...................................................................................................................... 11 2.6. Ảnh hưởng của nguồn carbohydrate đến hoạt động của vi khuẩn ..................... 12 Vi sinh vật học K36 ii Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.7. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi. ....................................................................................................................... 15 2.8. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới............................................. 16 2.8.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ............................................................... 16 2.8.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ............................................................. 17 2.9. Một số chế phẩm sinh học tiêu biểu ở nước ta.................................................. 19 2.9.1. Chế phẩm sinh học được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm .................... 19 2.9.2. Chế phẩm sinh học trên thị trường ............................................................. 23 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............... 24 3.1. Phương tiện nghiên cứu ................................................................................... 24 3.1.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, địa điểm ......................................................... 24 3.1.2. Nguyên vật liệu ......................................................................................... 25 3.1.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật .............................................. 25 3.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 26 3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của một số loại đường......................... 26 3.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ đường khi phối trộn ................................ 28 3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát một số điều kiện và nhiệt độ sấy khô sản phẩm .... 30 3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ bảo quản sản phẩm ................................. 31 3.3. Xử lý số liệu .................................................................................................... 31 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 32 4.1. Khảo sát ảnh hưởng của một số loại đường ...................................................... 32 4.1.1. Mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm ..................................................... 32 4.1.2. Đường kính vòng halo của vi khuẩn trong chế phẩm ................................. 34 4.1.3. Kết quả DM của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm .................................... 35 4.1.4. Kết quả CF của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm ..................................... 37 4.1.5. Độ ẩm của chế phẩm ................................................................................. 38 4.2. Khảo sát nồng độ đường khi phối trộn ............................................................ 39 Vi sinh vật học K36 iii Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.2.1. Mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm ..................................................... 39 4.2.2. Đường kính vòng halo của vi khuẩn trong chế phẩm ................................. 40 4.2.3. Kết quả DM của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm .................................... 41 4.2.4. Kết quả CF của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm ..................................... 42 4.2.5. Độ ẩm của sản phẩm.................................................................................. 43 4.3. Khảo sát một số điều kiện nhiệt độ sấy khô sản phẩm ..................................... 44 4.3.1. Mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm ..................................................... 44 4.3.2. Đường kính vòng halo của vi khuẩn trong chế phẩm ................................. 45 4.3.3. Kết quả DM của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm .................................... 46 4.3.4. Kết quả CF của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm ..................................... 47 4.3.5. Độ ẩm của sản phẩm.................................................................................. 48 4.4. Khảo sát điều kiện bảo quản ........................................................................... 49 4.4.1. Mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm ..................................................... 49 4.4.2. Đường kính vòng halo của vi khuẩn có trong chế phẩm............................. 50 4.4.3. Kết quả DM và CF của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm ......................... 51 4.4.4. Độ ẩm của sản phẩm ................................................................................. 52 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................... 53 5.1. Kết luận ........................................................................................................... 53 5.2. Kiến nghị ......................................................................................................... 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 54 Tiếng Việt .............................................................................................................. 50 Tiếng Anh .............................................................................................................. 51 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các phương pháp phân tích Phụ lục 2. Kết quả thí nghiệm Phụ lục 3. Kết quả thống kê Vi sinh vật học K36 iv Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Thành phần hóa học trong bã mía…………………………………………. .... 7 Bảng 2. Một số chế phẩm sinh học trên thị trường ..................................................... 23 Bảng 3. Thành phần môi trường cải tiến (M1) ........................................................... 25 Bảng 4. Thành phần môi trường cải tiến (M2) ........................................................... 26 Bảng 5. Kết quả tỉ lệ phầm trăm độ ẩm của chế phẩm tương ứng với từng loại đường .......................................................................................................................... 38 Bảng 6. Kết quả tỉ lệ phầm trăm độ ẩm của chế phẩm tương ứng với từng nồng độ Lactose .............................................................................................................. 43 Bảng 7. Kết quả độ ẩm của sản với điều kiện sấy khác nhau ...................................... 48 Bảng 8. Mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm ứng với từng thời gian và nhiệt độ bảo quản khác nhau ........................................................................................... 49 Bảng 9. Đường kính vòng halo phân giải BM của chế phẩm bột vi khuẩn tương ứng với từng thời gian và nhiệt độ bảo quản khác nhau ............................................ 50 Bảng 10. DM và CF của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm ứng với thời gian và nhiệt độ bảo quản khác nhau ...................................................................................... 51 Bảng 11. Kết quả độ ẩm của chế phẩm với nhiệt độ và thời gian khác nhau ............... 52 Bảng 12. Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN1.................................. PHỤ LỤC 2 Bảng 13. Đường kính vòng halo (mm) của vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN2 ............. .......................................................................................................... PHỤ LỤC 2 Bảng 14. Kết quả tỉ lệ tiêu hóa DM (%(m/m)) của vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN1 .......................................................................................................... PHỤ LỤC 2 Bảng 15. Kết quả tỉ lệ tiêu hóa CF (%(m/m)) của vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN1 .......................................................................................................... PHỤ LỤC 2 Bảng 16. Kết quả độ ẩm (% (m/m)) của chế phẩm ở TN1 .......................... PHỤ LỤC 2 Bảng 17. Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN2.................................. PHỤ LỤC 2 Bảng 18. Kết quả đường kính vòng halo (mm) của vi khuẩn ở TN2 ........... PHỤ LỤC 2 Bảng 19. Kết quả tỉ lệ tiêu hóa DM (%(m/m)) của vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN2 .......................................................................................................... PHỤ LỤC 2 Vi sinh vật học K36 v Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Bảng 20. Kết quả tỉ lệ tiêu hóa CF (%(m/m)) của vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN2 .......................................................................................................... PHỤ LỤC 2 Bảng 21. Kết quả độ ẩm (% (m/m)) của chế phẩm ở TN2 .......................... PHỤ LỤC 2 Bảng 22. Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN3.................................. PHỤ LỤC 2 Bảng 23. Đường kính vòng halo (mm) của vi khuẩn ở TN3 ....................... PHỤ LỤC 2 Bảng 24. Kết quả tỉ lệ tiêu hóa DM (%(m/m)) của vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN3 .......................................................................................................... PHỤ LỤC 2 Bảng 25. Kết quả tỉ lệ tiêu hóa CF (%(m/m)) của vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN3 .......................................................................................................... PHỤ LỤC 2 Bảng 26. Kết quả độ ẩm (% (m/m)) của chế phẩm ở TN3 .......................... PHỤ LỤC 2 Bảng 27. Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN4.................................. PHỤ LỤC 2 Bảng 28. Đường kính vòng halo (mm) của vi khuẩn ở TN4 ....................... PHỤ LỤC 2 Bảng 29. Kết quả tỉ lệ tiêu hóa DM (%(m/m)) của vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN4 .......................................................................................................... PHỤ LỤC 2 Bảng 30. Kết quả tỉ lệ tiêu hóa CF (%(m/m)) của vi khuẩn có trong chế phẩm ở TN4 .......................................................................................................... PHỤ LỤC 2 Bảng 31. Kết quả độ ẩm (%(m/m)) của chế phẩm ở TN4 ........................... PHỤ LỤC 2 Vi sinh vật học K36 vi Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Cấu trúc phân tử cellulose ............................................................................... 9 Hình 2. Cấu trúc phân tử hemicelluloses .................................................................... 10 Hình 3. Quá trình phân giải và lên men carbohydrate ở dạ cỏ .................................... 13 Hình 4. Một số thiết bị thí nghiệm ............................................................................. 24 Hình 5. Mật số vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng loại đường ................... 32 Hình 6. Đường kính vòng halo phân giải BM của vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng loại đường ........................................................................................... 34 Hình 7. DM của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm ứng với từng loại đường ................................................................................................................ 35 Hình 8. CF của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng loại đường ......................................................................................................... 37 Hình 9. Mật số vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng nồng độ đường ............ 39 Hình 10. Đường kính vòng halo phân giải BM của vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng nồng độ đường .................................................................................... 40 Hình 11. DM của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng nồng độ đường .................................................................................................. 41 Hình 12. CF của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng nồng độ đường .................................................................................................. 42 Hình 13. Mật số vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy ............. 44 Hình 14. Đường kính vòng halo phân giải BM của vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy ....................................................................................... 45 Hình 15. DM của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy ..................................................................................................... 46 Hình 16. CF của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy ..................................................................................................... 47 Vi sinh vật học K36 vii Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT A Ahs (tro) ADF Acid detergent fiber (chỉ số xơ acid) BM Bã mía CF Crude fiber (xơ thô) CFU Colony forming unit CMC Carboxymethyl cellulose DM Dry matter (vật chất khô không đổi) g Gram l Liter ml Mililiter m/m Trọng lượng/trọng lượng mm Milimeter NDF Neutral detergent fiber (chỉ số xơ trung tính) NT Nghiệm thức SP Sản phẩm TN Thí nghiệm µl Microliter vk Vi khuẩn v/v Thể tích/thể tích w/v Trọng lượng/thể tích Vi sinh vật học K36 viii Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Nền nông nghiệp Việt Nam hiện nay khá phát triển. Trong đó, chăn nuôi bò hiện đang phổ biến ở Đồng Bằng Sông Cửu Long (ĐBSCL) do đặc trưng của vùng địa hình này thích hợp. Đặc biệt, giá thành thịt bò trên thị trường nước ta là khá cao và được tiêu thụ mạnh do nhu cầu của người tiêu dùng ngày càng tăng. Tuy nhiên, nước ta nói chung và vùng ĐBSCL nói riêng cũng gặp không ít khó khăn trong chăn nuôi bò do khan hiếm về số lượng và hạn chế về chất lượng của thức ăn chăn nuôi. Mặt khác, sử dụng phụ phẩm làm thức ăn chăn nuôi vẫn chưa được chú trọng tới. Ngoài ra, việc chăm sóc sức khỏe cho vật nuôi vẫn chưa được quan tâm đúng mức. Từ thực tế chăn nuôi tại các địa phương cho thấy việc sử dụng chế phẩm sinh học trong chăn nuôi giải quyết tốt vấn đề phòng bệnh, không gây hại cho vật nuôi, không gây ảnh hưởng đến sức khỏe người tiêu dùng và thân thiện với môi trường (Nguyễn Tấn Lộc, 2012). Theo thống kê, trên thị trường hiện nay có hơn 200 loại chế phẩm sinh học trong chăn nuôi, trong đó có nhiều sản phẩm từ nước ngoài, giá thành cao, không rõ nguồn gốc. Những chế phẩm trong nước tuy giá rẻ nhưng chất lượng không ổn định, gây khó khăn cho người chăn nuôi. Mặt khác, việc nghiên cứu chế phẩm vi sinh có khả năng phân giải chất xơ, hỗ trợ cho hệ tiêu hóa của gia súc nhai lại vẫn còn hạn chế. Bổ sung một lượng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose vào thức ăn gia súc có tác dụng tăng tỷ lệ tiêu hóa, hấp thu thức ăn, tăng giá trị năng lượng thức ăn, tăng sức khỏe ruột, hạn chế tiêu chảy, giảm hiện tượng phân nhão, từ đó làm tăng năng suất và hiệu quả chăn nuôi (Vũ Duy Giảng, 2009). Mặt khác, ta có thể sử dụng vi sinh vật tổng hợp emzyme cellulase hay các chế phẩm sinh học có chứa emzyme cellulase để phân giải bã mía tạo phân bón, tạo ra nguyên liệu sinh học, làm giảm ô nhiễm môi trường và góp phần làm tăng giá trị sử dụng của các phụ phẩm nông nghiệp, tăng thu nhập cho người dân. Đồng thời, có thể mở ra hướng mới nghiên cứu ly trích emzyme từ vi khuẩn phân giải cellulose và sử dụng chúng để sản xuất nhiên liệu sinh học làm tăng hiệu quả kinh tế cũng như góp phần trong công cuộc bảo vệ môi trường. Vi sinh vật học K36 1 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Vì thế, đề tài “Khảo sát một số điều kiện để tạo chế phẩm bột vi khuẩn Bacillus subtilis S20” được tiến hành. 1.2. Mục tiêu đề tài Xác định loại đường, nồng độ phối trộn thích hợp, điều kiện sấy và nhiệt độ bảo quản tối ưu để tạo chế phẩm bột Bacillus subtilis S20. Vi sinh vật học K36 2 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1. Lịch sử phát hiện và phân loại Bacillus subtilis được Christion phát hiện đầu tiên vào năm 1835 và tên của loài vi khuẩn này được đặt là “Vibrio subtilis”. Năm 1872, Ferdimand xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên là Bacillus subtilis. Năm 2004, dựa trên phương pháp phân tích 16S rRNA người ta phân chia loài Bacillus thành nhiều họ và loài vi khuẩn tạo bào tử khác nhau. Về cơ bản theo phân loại của Bergey, B.subtilis thuộc: - Giới (kingdom): Bacteria - Ngành (phylum): Firmicutes - Lớp (class): Bacilli - Bộ (order): Bacillales - Họ (family): Bacillaceae - Chi (genus): Bacillus 2.1.2. Đặc điểm sinh thái học và phân bố tự nhiên Bacillus subtilis là trực khuẩn hình que, Gram dương, kích thước 0,5 - 0,8µm x 1,5 - 3µm, dạng đơn hoặc chuỗi ngắn, vi khuẩn có khả năng di động, sinh bào tử hình bầu dục nhỏ hơn nằm ở giữa hoặc lệch tâm tế bào. Có khả năng tạo bào tử, chịu đựng các điều kiện môi trường khắc nghiệt. Bào tử phát triển bằng cách nẩy mầm, không kháng acid, có khả năng chịu nhiệt, chịu ẩm, áp suất (Nakano và Zuber, 1998). Lên men không sinh hơi các loại đường như glucose, maltose, manitol, sacchraose, xylose và arabinose. Thử nghiệm indol (-). Nitrate (+), H2S (-), NH3 (+), catalase (+), amylase (+), casein (+), citrate (+), có khả năng di động (+) (Holt, 1992) Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy tiện, còn được gọi là trực khuẩn cỏ khô hoặc trực khuẩn cỏ vì đa số chúng sống trong rơm rạ hoặc cỏ khô. Cũng có nhiều bằng chứng cho thấy Bacillus subtilis tồn tại trong ruột Vi sinh vật học K36 3 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT người, động vật. Nghiên cứu gần đây so sánh số lượng bào tử được tìm thấy trong đất là khoảng 10 6 bào tử/g và mức được tìm thấy trong phân người là 104 bào tử/g (Hong và Khaneja, 2009). Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng đất sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm. Ngoài ra, chúng còn được tìm thấy trong một số loại thực phẩm như bột gạo, bột mì, … 2.1.3. Khả năng sinh bào tử và thích ứng với điều kiện sống Bacillus subtilis có tập tính tiêu diệt đồng loại, chúng dùng phương pháp này như một cách đơn giản để thoát khỏi những trường hợp có đời sống giới hạn như dinh dưỡng cạn kiệt hay điều kiện khắc nghiệt. Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng bất lợi từ môi trường chúng thường tạo ra bào tử, nhưng cách này khá tiêu hao năng lượng (Richard et al., 1993). Quá trình hình thành bào tử (Nguyễn Lân Dũng, 2003): - Hình thành những búi chất nhiễm sắc - Tạo tiền bào tử - Tiền bào tử hình thành hai lớp mảng, tăng cao tính bức xạ - Tổng hợp các lớp vỏ bào tử - Giải phóng bào tử - Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm, phát triển thành tế bào sinh dưỡng mới. Vi khuẩn chủng Bacillus subtilis và các chất chiết xuất từ vi sinh vật này được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), cơ quan An toàn Thực phẩm châu Âu (EFSA) đánh giá là an toàn khi sử dụng bổ sung vào thực phẩm và mang lại lợi ích kinh tế cao. B. subtilis có thể phân chia đối xứng để tạo thành hai tế bào con (nhị phân phân hạch), hoặc không đối xứng, tạo bào tử trong điều kiện môi trường bất lợi như hạn hán, độ mặn, bức xạ cực cao, pH và dung môi không phù hợp, môi trường nghèo dinh dưỡng. Trong môi trường sống khắc nghiệt, trước giai đoạn hình thành bào tử, các tế bào vi khuẩn có thể tự tạo ra các chất đề kháng (kháng sinh), gây ức chế hoặc giết Vi sinh vật học K36 4 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT những loài vi sinh vật khác để tìm kiếm dinh dưỡng. Tính ổn định cao của B. subtilis trong điều kiện môi trường khắc nghiệt làm cho nó trở thành một trong những loài vi sinh vật được ứng dụng làm chế phẩm sinh học nhiều nhất hiện nay. Theo Nakano và Zuber (1998) thì Bacillus subtilis là vi khuẩn hình que, gram dương. Bacillus subtilis được phân lập từ dạ cỏ trâu bò (Mikrobiol, 1999) và cũng được Ray et al. (2007) phân lập từ ruột cá và tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp cellulase. Ngoài ra, Immanuel et al. (2006) nghiên cứu được rằng dòng vi khuẩn họ Bacillus sinh tổng hợp enzyme cellulase tối ưu ở pH trung tính. Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở 40oC (Mohamed et al., 2010). 2.1.4. Vi khuẩn Bacillus subtilis S20 Dòng vi khuẩn Bacillus subtilis S20 đã được Đỗ Thị Cẩm Hường (2012) phân lập từ dạ cỏ bò cũng như khảo sát các đặc điểm và khả năng phân giải cellulose. Theo kết quả phân lập dòng vi khuẩn Bacillus subtilis S20, kí hiệu là BM21, có hình dạng khuẩn lạc không đều, độ nổi lài, dạng bìa răng cưa và có màu trắng đục. Hình dạng vi khuẩn là hình que, gram dương, có hoạt tính catalase, có kích thước (µm) 1,48 x 0,59. Dòng vi khuẩn BM21 có kết quả khảo sát trung bình (3 lần lặp lại) đường kính vòng halo trên cơ chất CMC là 22,3mm, trên cơ chất bã mía là 29,7mm. Kết quả hiệu suất phân giải bã mía (trung bình 3 lần lặp lại): - Mẫu bã mía: 0.9387 (g) - KL mẫu (sau sấy 105oC): 0.5969 (g) - Hàm lượng tro: 0.0078 % - Hàm lượng xơ thô: 62.7549 % - Hiệu suất phân giải: 7.1798 % 2.2. Vai trò của Bacillus subtilis đối với hệ tiêu hóa của động vật Từ lâu, người ta đã biết đến khả năng kháng khuẩn của B. subtilis, những người nông dân của nhiều nước từ xa xưa, một cách vô tình họ đã dùng nước ngâm rơm rạ cho trâu bò uống để chữa bệnh viêm ruột. Chính sự có mặt của B. subtilis là nguyên nhân chữa được bệnh này. Vi sinh vật học K36 5 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Năm 1949-1950 Henry và Albot đã phân lập thành công B. subtilis thuần khiết. Sau đó, B. subtilis mới dùng để điều trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh hoặc do loạn khuẩn gây ra với tên gọi là “Subtilis therapie” (điều trị bằng subtilis). B. subtilis có vai trò lớn trong việc giữ ổn định hệ vi sinh đường ruột bằng cơ chế cạnh tranh sinh tồn và khả năng gây ức chế các vi khuẩn gây bệnh ở đường ruột do tác dụng bởi những sản phẩm tiết của nó. B. subtilis có hệ thống men tương đối hoàn chỉnh có khả năng thủy phân glucid, lipid, protid, enzym cellulase biến đổi chất xơ thành các loại đường dễ tiêu, lecitinase thủy phân các chất béo phức hợp, enzym phân giải gelatin, enzym phân giải fibrin và một loại enzym giống lysozym gây tác dụng trực tiếp dung giải một số type vi khuẩn Proteus gây bệnh trong đường ruột (Miller et al., 1959). B. subtilis còn được đánh giá là một trong những loại vi khuẩn an toàn và hiệu quả nhất để sử dụng trong ngành công nghệ sinh học sản xuất các acid amin quan trọng như: lysine, valine, tyrozine, proline, threonine, isoleusine, aspastic… Ngoài ra, B. subtilis còn có khả năng tổng hợp một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác, tác dụng lên cả vi khuẩn gram âm lẫn gram dương, nấm gây bệnh như: Bacitracin, Bacilysin, Baxilomicin, Bacillopectin, Mycobacillin, Prolimicin… Nhờ các kháng sinh này mà B. subtilis có khả năng cạnh tranh tốt với các vi khuẩn. B. subtilis còn có khả năng đồng hóa một số vitamin như B2 (Riboflavin) đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của cơ thể động thực vật, có mặt trong tất cả các tế bào, tham gia vào các quá trình dinh dưỡng và hô hấp của sinh vật. Trong 1 gam sinh khối khô Bacillus có 7,8 µg riboflavin. Nhiều nước trên thế giới đã dùng B. subtilis như là một chế phẩm trợ sinh hay còn gọi là probiotic, chứa các vi sinh vật sống có tác dụng làm cải thiện hệ vi sinh vật ở cơ thể vật chủ. Bào tử của B. subtilis có thể qua được rào chắn tiêu hóa, một phần bào tử nảy mầm trong ruột non và sinh sôi trong đường ruột. Ngoài ra một số tác dụng lâm sàng của B. subtilis đã được biết như là tác nhân kích thích miễn dịch, nhờ tác dụng kích thích tiết IgA, một loại globulin tiết có trên bề mặt tế bào biểu mô niêm mạc có khả năng ức chế, ngăn chặn vi sinh vật gây bệnh xâm nhập vào cơ thể. Vi sinh vật học K36 6 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.3. Tổng quan về bã mía và các thành phần xơ trong bã mía 2.3.1 Tổng quan về bã mía Bã mía được xem là nguồn phế phẩm từ ngành công nghiệp sản xuất mía. Hiện nay, bã mía có thể dùng làm nguyên liệu đốt lò, hoặc làm bột giấy, ép thành ván dùng trong kiến trúc, cao hơn là làm ra Furfural là nguyên liệu cho ngành sợi tổng hợp. Tuy nhiên việc sử dụng bã mía ở nước ta chưa thực sự hiệu quả do nhiều nguyên nhân khách quan. Ngoài ra, bã mía là một loại thức ăn có hàm lượng xơ rất cao trong đó khoảng hơn 20% là lignin. Theo Kamstra et al. (1958) hàm lượng lignin trong thực vật càng cao càng làm giảm tỷ lệ tiêu hóa cellulose do lignin rất bền vững đối với acid mạnh và enzyme của vi khuẩn. Mà cấu trúc thành tế bào thực vật thường được tạo thành từ các phức chất lignin – cellulose gây khó khăn cho việc phân giải cellulose của vi khuẩn (Lê Đức Ngoan, 2005). Thực vật càng trưởng thành số lượng lignin càng tăng nên mức độ tiêu hóa cellulose càng giảm (Trần Cừ, 1979). Chính vì thế, gia súc nhai lại gặp trở ngại trong việc tiêu hóa bã mía (Lê Đức Ngoan, 2005). 2.3.2 Các thành phần chính trong bã mía Bã mía có giá trị dinh dưỡng thấp, chứa nhiều xơ khoảng 40%, 24% hemicellulose và 25% lignin (Lee và Koo, 2003). So sánh kết quả với Chu Thị Thơm et al. (2010) có sự tương đồng cao. Bảng 1. Thành phần hóa học trong bã mía Thành phần % Cellulose 46,0 Hemicellulose 24,5 Lignin 20,0 Chất béo 3,4 Tro 2,4 Silic 2,0 (*Nguồn: Chu Thị Thơm, 2006) Vi sinh vật học K36 7 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.3.2.1. Cellulose Cellulose là thành phần chủ yếu trong tế bào thực vật, chiếm tới 50% tổng số hydrocarbon trên trái đất. Trong vách tế bào thực vật, cellulose tồn tại trong mối liên kết chặt với các polysaccharide khác: hemicellulose, pectin và lignin tạo thành liên kết bền vững. Cellulose cũng là hợp chất hữu cơ nhiều nhất trong sinh quyển, hàng năm thực vật tổng hợp được khoảng 1011 tấn cellulose (trong gỗ, cellulose chiếm khoảng 50% và trong bông chiếm khoảng 90%). Cellulose là hợp chất cao phân tử được cấu tạo từ các liên kết các mắt xích β-DGlucose, có công thức cấu tạo là (C6H10O5)n hay [C6H7O2(OH)3]n trong đó n có thể nằm trong khoảng 5000-14000, là thành phần chủ yếu cấu tạo nên vách tế bào thực vật. Trong gỗ lá kim, cellulose chiếm khoảng 41-49%, trong gỗ lá rộng nó chiếm 4352% thể tích. Là thành phần chính tạo nên lớp màng tế bào thực vật, giúp cho các mô thực vật có độ bền cơ học và tính đàn hồi. Cellulose có nhiều trong bông (95-98%), đay, gai, tre, nứa, gỗ... (Cellulose chiếm khoảng 40-45% trong gỗ). Cellulose do các mắt xích β-D-Glucose liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 Glucocid do vậy liên kết này thường không bền trong các phản ứng phân giải. Đun nóng lâu cellulose với dung dịch acid sunfuric, các liên kết β-glicozit bị đứt tạo thành sản phẩm cuối cùng là glucose: (C6H10O5)n + nH2O → nC6H12O6 (xúc tác H +, to) Phản ứng này áp dụng trong sản xuất ancol etylic công nghiệp, xuất phát từ nguyên liệu chứa cellulose (vỏ bào, mùn cưa, tre, nứa, v.v...). Phản ứng phân giải cellulose có thể xảy ra nhờ tác dụng xúc tác của enzyme cellulase có trong cơ thể động vật nhai lại (trâu, bò...). Cơ thể người không có enzyme này nên không thể tiêu hóa được cellulose. Vi sinh vật học K36 8 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 1. Cấu trúc phân tử cellulose (*Nguồn:http://dwb4.unl.edu/Chem/CHEM869E/CHEM869ELinks/qlink.queensu.ca/~6jrt/che m210/Page5.html ngày 27/11/2013) 2.3.2.2. Hemicellulose Hemicellulose cũng là một phần polysaccharide thường gặp trong vách tế bào thực vật với hàm lượng lớn sau cellulose. Hemicellulose không tan trong nước, tan trong dung dịch kiềm và phân giải bằng acid dễ hơn cellulose. Khi bị phân giải hemicellulose tạo thành một hỗn hợp gồm các hexose và pentose hay chỉ có hexose. Khác với cellulose, phân tử hemicellulose nhỏ hơn nhiều, thông thường không quá 150 gốc đường được nối với nhau không chỉ bằng liên kết β-1,4 mà còn bằng liên kết β-1,3 và β-1,6 glycoside tạo ra mạch ngắn và phân nhánh. Vì độ polymer thấp, phân nhánh và hỗn hợp nhiều đường nên hemicellulose không có cấu trúc chặt chẽ như ở cellulose và độ bền hóa lý cũng thấp hơn. Hemicellulose bao gồm xylan, glucuronoxylan, arabinoxylan, glucomannan và xyloglucan. Những polysaccharide chứa nhiều monome đường khác nhau. Ngược lại, cellulose chỉ chứa glucose khan. Ví dụ, bên cạnh glucose, monome đường trong hemicellulose có thể bao gồm xylose, mannose, galactose, rhamnoza, và arabinose. Hemicelluloses chứa hầu hết các đường pentose D-, và đôi khi một lượng nhỏ của đường L-. Xylose luôn luôn là monome đường hiện diện trong số lượng lớn nhất, nhưng mannuronic acid và acid galacturonic cũng có xu hướng có mặt (http://en.wikipedia.org/wiki/Hemicellulose). Vi sinh vật học K36 9 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Hình 2. Cấu trúc phân tử hemicelluloses (*Nguồn: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Hemicellulose.png ngày 27/11/2013) 2.3.2.3. Lignin Lignin hoặc lignen là một phức hợp chất hóa học phổ biến nhất có nguồn gốc từ gỗ và là một phần không thể thiếu của thành tế bào thứ cấp của thực vật và một số tảo. Thuật ngữ này được giới thiệu vào năm 1819 bởi de Candolle và có nguồn gốc từ tiếng Latin từ lignum, có nghĩa là gỗ. Đây là một trong những polyme hữu cơ phong phú trên trái đất sử dụng 30% cacbon hữu cơ không hóa thạch, và cấu thành từ quý 1/3 khối lượng khô của gỗ. Là một polyme sinh học, lignin là không bình thường vì tính không đồng nhất của nó và thiếu của một cấu trúc chính được xác định. Chức năng của nó thường lưu ý nhất là sự hỗ trợ thông qua việc tăng cường gỗ (tế bào xylem) trên cây. Các thành phần polysaccharide của vách tế bào thực vật rất ưa nước do đó thấm nước trong khi lignin là thành phần kỵ nước. Các liên kết của polysaccharide bằng lignin là một trở ngại cho sự hấp thụ nước vào thành tế bào. 2.4. Enzyme cellulase Cellulase là enzyme đa cấu tử xúc tác quá trình chuyển hóa cellulose thành glucose. Nó là enzyme cảm ứng được tổng hợp bởi vi sinh vật trong suốt quá trình sinh trưởng và phát triển trên nguồn nguyên liệu cellulose (Lee và Koo, 2001). Hệ vi sinh vật phân giải cellulose có thể lên men hiếu khí hoặc kỵ khí, bình nhiệt hoặc ái nhiệt bao gồm nấm, vi khuẩn và xạ khuẩn. Trong tự nhiên có rất nhiều loại vi sinh vật có khả năng tổng hợp cellulase như: nấm, vi khuẩn, động vật nguyên sinh,… khi được nuôi dưỡng trong môi trường có cellulose. Vi sinh vật học K36 10 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Để phân giải hoàn toàn nguyên liệu cellulose thành glucose cần có sự phối hợp của các loại cellulase khác nhau: endoglucanase, β-glucosidase (Yi et al., 1999). - Exoglucanases: có tên khoa học khác như cellobiohydrolase (CBH), exoglucanase, cellobiosidase, enzyme C1 hoặc avicellase, 1,4 β-glucan cellobiohydrolase, exocellulase (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Enzyme cắt đầu không khử của chuỗi cellulose để tạo thành cellobiose và giải phóng từng đơn vị glucose (glucanohydrolases) hoặc cellulobiose (cellobiohydrolase) (Teeri, 1997). Để xác định hoạt tính hệ enzyme exoglucanase, ủ dịch enzyme cellulase với cơ chất cellulose (LiJung et al., 2010). Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất hóa lý của chúng, giúp cho endocellulase phân giải chúng tốt hơn. - Endoglucanase (tên gọi khác: 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase, endo 1,4β-glucanase, CMCase, enzyme Cx, C-cellulase), chúng tham gia phân giải một cách ngẫu nhiên các liên kết β-1,4-glycoside trong phân tử cellulose để tạo ra các đoạn oligosaccharide có chiều dài khác nhau (Bhat và Bhat, 1997; Nguyễn Đức Lượng, 2004). Hoạt tính của endo 1,4-β-glucanase được xác định khi ủ với 900 μl cơ chất CMC 1% trong 20 mM dung dịch đệm phosphate (Li-Jung et al., 2010). Sản phẩm của quá trình phân giải là cellodextrin, cellobiose, và glucose. - β-glucosidase: còn có tên là cellobiase và β-D glucoside glucohydrolase (Nguyễn Đức Lượng, 2004). Enzyme này tham gia phân giải cellobiose, tạo thành glucose, không có khả năng phân CMC. 2.5. Ảnh hưởng của điều kiện môi trường lên khả năng phân giải bã mía của vi khuẩn Trong tự nhiên đa số các loài vi sinh vật sống hoại sinh, phân giải các nguồn hợp chất hữu cơ có sẵn trong môi trường thành các chất cần thiết cho quá trình sinh trưởng và phát triển của mình. Khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như khả năng sinh tổng hợp các enzyme chịu sự tác động của nhiều yếu tố môi trường như: nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, , nguồn nitrogen,… Nhiệt độ ảnh hưởng mạnh tới quá trình sống của vi sinh vật nói chung và của vi khuẩn nói riêng. Căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ sinh trưởng, các loài vi sinh vật Vi sinh vật học K36 11 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT được chia làm 3 nhóm: các loài ưa lạnh và chịu lạnh, các loài ưa ấm và các loài chịu nhiệt. Các loài ưa lạnh có khả năng sinh trưởng trong điều kiện dưới 15oC, các loài ưa ấm thường sinh trưởng phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ 20 - 40oC; còn các loài chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt ở nhiệt độ cao trên 50oC. Nghiên cứu của Nguyễn Lan Hương và Hoàng Đình Hòa (2003) cũng cho thấy, các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn ưa nhiệt sinh tổng hợp cellulase cao nhất ở nhiệt độ 50oC. Dòng vi khuẩn Bacillus subtillis có khả năng sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở nhiệt độ 40oC (Mohamed et al., 2010). Theo Tang et al. (2004) khi nghiên cứu các chủng vi sinh vật endo-β-1,4-glucanase cho thấy, ở chủng vi khuẩn B. subtilis nhiệt độ thích hợp cho tổng hợp enzyme là 37oC. pH môi trường là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của các chủng vi sinh vật. Tùy thuộc vào từng loài, từng chủng mà môi trường pH thích hợp là acid, trung tính hay kiềm. Các chủng vi khuẩn và xạ khuẩn chịu nhiệt sinh tổng hợp cellulase thích hợp với môi trường pH là 6; còn dòng vi khuẩn họ Cellumonas, Bacillus, Micrococcus sinh tổng hợp enzyme tối ưu ở pH trung tính (Immanuel et al., 2006). Các loài vi sinh vật có nhu cầu khác nhau đối với nguồn nitrogen. Nhìn chung, các loài đều có khả năng sử dụng cả nguồn nitrogen vô cơ và hữu cơ nhưng mức độ đồng hóa còn tùy thuộc vào từng loài. Nghiên cứu của Taled et al. (2009) cho thấy, 2 dòng vi khuẩn họ Bacilli có thể sử dụng nhiều nguồn nitrogen khác nhau như: yeast extract, urea, peptone, ammonium nitrate. Trong đó yeast extract là nguồn nitrogen tốt nhất cho khả năng sinh tổng hợp cellulase của 2 dòng vi khuẩn này. Ngoài những yếu tố trên, tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh tổng hợp các loài enzyme của các vi sinh vật còn chịu sự tác động của nhiều yếu tố khác như: thời gian nuôi cấy, chỉ số CO2 trong nuôi cấy, mật số vi sinh vật được chủng vào ban đầu,... 2.6. Ảnh hưởng của nguồn carbohydrate đến hoạt động của vi khuẩn Các loài vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase có thể sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau tùy thuộc vào đặc điểm của từng loài. Có loài chỉ thích hợp với một hoặc một số ít nguồn carbon, có loài không đòi hỏi nghiêm ngặt mà có khả năng sử dụng Vi sinh vật học K36 12 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT nhiều nguồn carbon khác nhau. Nguồn carbon có thể đơn giản như các loại đường đơn, đường đôi hoặc phức tạp như glucan, tinh bột, cellulose. Vi sinh vật có những hệ enzyme khác nhau để có thể sử dụng các nguồn carbohydrate một cách hiệu nhất, enzyme của vi sinh vật phân cắt các dạng carbohydrate phức tạp thành đơn giản để chuyển hóa thành năng lượng ATP cung cấp cho tế bào. Hình 3. Quá trình phân giải và lên men carbohydrate ở dạ cỏ (*Nguồn: Nguyễn Xuân Trạch, 2007) Các vi sinh vật bám vào các tiểu phần thức ăn và phân giải từng phần cellulose và hemicellulose nhờ enzyme cellulase. Xơ được tiêu hoá thành các sản phẩm đơn giản cùng với đường, tinh bột được lên men tạo thành các loại đường, acid béo bay hơi, CO2 và CH4. Sản phẩm đường lại trở thành các sản phẩm trung gian và được lên men bởi các sinh vật trong dạ cỏ. Các acid béo bay hơi được hấp thu vào máu qua thành dạ cỏ và tham gia vào quá trình trao đổi chất. Các chất có nitrogen được phân giải thành NH3 và được vi sinh vật sử dụng để tổng hợp thành protein cho cơ thể chúng và đây cũng là nguồn protein cung cấp cho cơ thể gia súc (Nguyễn Xuân Trạch, 2007). Quá trình phân giải vách tế bào đòi hỏi các enzyme tiết ra từ vi sinh vật xâm nhập vào bên trong cấu trúc xơ của vách tế bào. Thế nhưng, các loại thức ăn của gia súc có vách tế bào bị lignin hoá cao với những cấu trúc rất phức tạp. Đặc biệt trong Vi sinh vật học K36 13 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT môi trường acid nhẹ của dạ cỏ, các liên kết hoá học trong các phức hợp lignin rất bền. Đây là rào cản ngăn chặn quá trình enzyme cellulase tiếp xúc với vách tế bào (Nguyễn Xuân Trạch, 2007). Theo Van Kessel and Rusell (1997), sự tiêu hóa ở dạ cỏ gia súc nhai lại khi có sự hòa lẫn vi khuẩn ở gia súc nhai lại bị đói trong thí nghiệm in vitro 24 giờ, tế bào ATP giảm, nhưng có sự suy thoái trong tế bào protein. Vi khuẩn ở gia súc nhai lại bị đói sử dụng nucleic acid (RNA gốc), nhưng suy thoái trong ATP thì có mối liên hệ gần hơn với sự giảm polysaccharide. Bởi vì polysaccharide thoái hóa đầu tiên ở tỉ lệ 23%, nó có khả năng đánh giá tỉ lệ trao đổi nội sinh ở những giai đoạn của sự đói khác nhau. Vi khuẩn lúc đầu có khả năng lên men carbohydrate hòa tan cao sau đó giảm dần và bị chết sau 24 giờ tiêu hóa. Vi khuẩn có thể phân giải được 80% cellulose khi thức ăn vào dạ cỏ, theo quá trình sau: Cellulose Polysaccharid Depolimerase, vsv Glucosidasse, vsv Hemicellulose Cellulobiose vsv Polysaccharid Cellulobiose Cellulobiose + sản phẩm khác Cellobias 2glucose Glucose được các sinh vật hấp thụ trực tiếp qua màng tế bào. Bên trong tế bào vi sinh vật, glucose được phân giải tiếp thành CO2 và H2O trong điều kiện hiếu khí. Còn trong điều kiện yếm khí, glucose được phân giải cho ra acid hữu cơ và cồn ethanol. Riêng cồn sẽ được các loại vi khuẩn methan-hoá phân giải thành methan. Các loại acid hữu cơ sinh ra trong quá trình phân giải trong điều kiện yếm khí có khác nhau tuỳ loại vi sinh vật phân giải như: acetic acid, lactic acid, formic acid, butyric acid, succinic acid... So với sự phân giải trong điều kiện hiếu khí, quá trình phân giải cellulose trong điều kiện yếm khí ít bị ảnh hưởng bởi hàm lượng nitơ. Có lẽ do trong điều kiện yếm khí, sự đồng hoá chất hữu cơ của vi sinh vật không lớn nên không cần nhiều nitơ. Vi sinh vật học K36 14 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.7. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe của vật nuôi. Bên cạnh sự hấp thụ các chất dinh dưỡng, đường tiêu hóa còn đóng vai trò quan trọng như là cơ quan miễn dịch lớn nhất trong cơ thể. Do đó, nó là hệ thống bảo vệ và là hàng rào quan trọng chống lại các tác nhân gây bệnh xâm nhiễm. Thêm vào các cơ chế bảo vệ nói chung, hệ thống miễn dịch, với các phản ứng đặc hiệu và không đặc hiệu, giúp chống lại các vi sinh vật gây bệnh. Khu hệ vi sinh vật đường ruột cũng được coi là một trong các yếu tố chống lại các tác nhân gây bệnh. Khi còn ở trong bào thai, đường tiêu hoá của vật nuôi ở trạng thái vô trùng, nhưng chỉ vài giờ sau khi sinh các vi sinh vật đã bắt đầu cư trú và trở thành những “cư dân” bình thường trong đường tiêu hoá (WHO, 2001). Theo thời gian, do tiếp xúc trực tiếp với môi trường, đặc biệt là qua thức ăn và nước uống, số lượng và tính đa dạng sinh học của các vi sinh vật cộng sinh không ngừng tăng lên. Số lượng tế bào vi sinh vật cư trú trong đường tiêu hóa của vật nuôi có thể cao gấp mười lần số lượng tế bào cấu tạo nên cơ thể chúng (Fonty, 1995). Số lượng loài có thể lên tới từ 400-500 (Tannock, 1999). Tuy nhiên, mật độ vi sinh vật ở các phân đoạn khác nhau của đường tiêu hóa (dạ dày; tá tràng; ruột non và ruột già) ở loài động vật dạ dày đơn rất khác nhau (khoảng 101-10 3; 101-104; 105-108 và 109-1012 CFU/ml chất chứa tương ứng) (Jans, 2005). Sức khỏe của vật nuôi phụ thuộc vào 3 yếu tố chính: trạng thái sinh lý của vật chủ, khẩu phần thức ăn và hệ vi sinh vật. Các yếu tố này chịu tác động của môi trường, của các stress và tác động qua lại lẫn nhau. Trong số các nhân tố trên, hệ vi sinh vật đường tiêu hóa đóng vai trò trung tâm, chỉ một biến động bất lợi của một trong hai yếu tố còn lại cũng ảnh hưởng xấu tới hệ vi sinh vật (Conway, 1994). Sự cộng sinh của các loài vi sinh vật trong đường tiêu hoá của vật nuôi (chủ yếu là trong ruột) tạo nên một hệ sinh thái mở và mối cân bằng của quần thể vi sinh vật được xác lập chỉ một thời gian rất ngắn sau khi sinh (Jans, 2005). Có nhiều quan điểm khác nhau về mối tương quan cân bằng của hệ vi sinh vật ruột. Theo Jans (2005), để đánh giá trạng thái cân bằng, các vi sinh vật ruột được chia thành 3 nhóm (1) nhóm chủ yếu (main flora) gồm các loài vi khuẩn kị khí (Clostridium; Lactobacillus; Bifidobacteria; Bacteroides, Eubacteria); (2) nhóm vệ tinh (Satellite flora), gồm chủ yếu là Enterococcus và E. coli, và (3) nhóm còn lại (Residual flora) gồm các vi sinh vật có hại như Proteus, Staphylococcus và Pseudomonas… Một quần thể vi sinh vật được coi là cân bằng khi tỷ lệ của các nhóm dao động trong khoảng 90; Vi sinh vật học K36 15 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 1,0 và 0,01% tương ứng. Trạng thái mà các nhóm này hình thành một tỷ lệ 90:1:0,01 được gọi là trạng thái “eubiosis” (tiếng Hy Lạp có nghĩa là sự chung sống có lợi giữa các vi khuẩn với nhau và với vật chủ). Ở trạng thái “eubiosis”, vật chủ cung cấp các điều kiện sống lý tưởng như nhiệt độ ổn định, pH trung tính, dinh dưỡng và sự đào thải các chất chuyển hóa. Đổi lại, hệ vi sinh vật sẽ mang lại lợi ích cho vật chủ thông qua tăng cường tiêu hóa các chất dinh dưỡng, giải độc, tổng hợp các vitamin nhóm B và vitamin K, loại trừ các vi sinh vật có hại, tăng cường đáp ứng miễn dịch của vật chủ. Sự cân bằng của hệ vi sinh vật trong đường tiêu hóa bị tác động bởi một số nhân tố vô sinh và hữu sinh như: sinh lý vật chủ, khẩu phần thức ăn và cơ cấu nội tại của bản thân hệ vi sinh vật. Thức ăn là nền dinh dưỡng cơ bản của vi sinh vật, bởi vậy sự thay đổi thành phần khẩu phần, thức ăn không đảm bảo vệ sinh, phương pháp cho ăn không hợp lý... đều làm tổn hại đến trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật ruột. Tương tự như vậy, các chất bài tiết của hệ tiêu hóa (dịch mật, các enzym, chất đệm và chất nhầy...) cũng như kiểu và tần số nhu động ruột cũng tác động trực tiếp đến hệ vi sinh vật. Kiểu và tần số nhu động ruột bị tác động rất lớn bởi các stress (sinh đẻ, cai sữa, dồn chuồng, vận chuyển...). Khi quan hệ cân bằng của hệ vi sinh vật ruột bị phá vỡ sẽ tạo nên trạng thái “dysbiosis” (trạng thái “chung sống có hại”). Biểu hiện của trạng thái “dysbiosis” ở vật chủ thường là thể tạng kém, sinh trưởng chậm và mắc các bệnh đường tiêu hóa như tiêu chảy, viêm ruột hoại tử. 2.8. Tình hình nghiên cứu trong nước và trên thế giới 2.8.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh phục vụ cho đời sống dân sinh nói chung và chăn nuôi nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây. Lê Thanh Bình (1999) đã sản xuất chế phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi thử nghiệm trên gà Broiler cho thấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay đổi theo chiều hướng tích cực, các vi khuẩn lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm gà được ăn thức ăn có thức ăn bổ sung chế phẩm PRO99. Khối lượng cơ thể lúc 50 ngày tuổi của gà ở nhóm được ăn thức ăn có bổ sung PRO99 cao hơn so với đối chứng 10,6%. Vi sinh vật học K36 16 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Phạm Ngọc Lan (2003) đã phân lập được hai trong số 789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà. Bằng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã xác định được các chủng CH123 và CH156 có những tính chất chế phẩm vi sinh gần với Lactobacillus agillis và Lactobacillus salivarius (có khả năng đề kháng được với 40% acid mật; sinh trưởng được ở môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với Salmonella, E.coli) có khả năng sử dụng như nguồn chế phẩm vi sinh ứng dụng trong chăn nuôi. Nguyễn Thị Hồng Hà (2003) đã sử dụng hai chủng vi khuẩn Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm vi sinh, bước đầu đã nghiên cứu được công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun. Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức 10 6 CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella. Nguyễn Thùy Châu (2003) thông báo đã lựa chọn được chủng nấm men Candida ultilis CM125 cho sinh khối cao trên môi trường rỉ mật, bước đầu đã đưa ra quy trình công nghệ sản xuất sinh khối loại nấm men này. Nguyễn La Anh (2003) đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từ nước bắp cải muối chua và đã xác định được rằng chủng vi khuẩn này có tính chất chế phẩm vi sinh và có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng dung dịch (từ vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 108 CFU/ml có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi tôm, cá. Lê Tấn Hưng và Võ Thị Hồng Hạnh (2003) đã nghiên cứu sản xuất hai chế phẩm chế phẩm vi sinh BIO I và BIO II. Chế phẩm BIO II gồm các nhóm vi khuẩn Lactobacillus, Bacillus và nấm men Sacharomyces phối hợp với các enzyme amylase và protease dùng trong xử lý môi trường nước nuôi tôm, cá và chế phẩm BIO I dùng trong chăn nuôi. Hiện nay chế phẩm BIO II đã được ứng dụng rộng rãi nhưng chế phẩm BIO I hiệu quả sử dụng chưa cao. 2.8.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Ray et al. (2007) tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp cellulase bởi 2 dòng vi khuẩn phân lập từ ruột cá Bacillus subtillis và Bacillius circulans. Taled et al. (2009) nghiên cứu các yếu tố sinh dưỡng và môi trường sinh dưỡng lên quá trình sinh tổng Vi sinh vật học K36 17 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT hợp cellulase của 2 dòng vi khuẩn Bacillus alcalophillus S39 và Bacillus amyloliquefaciens C2. Kết quả khảo sát cho thấy CMC 1% và yeast extract 0,7% được dùng như nguồn carbon và nitrogen hiệu quả nhất. pH 7 ở nhiệt độ 30 và 45oC là tối ưu cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của 2 dòng vi khuẩn này. Abou-Taleb et al. (2009), khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố sinh dưỡng và môi trường đến sản xuất cellulose của 2 dòng vi khuẩn Bacillus alcalophilus S39 và Bacillus amyloliquefaciens C23 phân giải cellulose. Xác định được rằng 1% CMC và 0.7% yeast là hàm lượng cung cấp carbon, nitơ và 3% vi khuẩn chủng vào ở điều kiện pH 7 là thích hợp nhất đê sản xuất cellulase của 2 dòng vi khuẩn này. Oyeleke và Okusanmi (2008), đã tiến hành phân lập và khảo sát hoạt tính phân giải cellulose của vi sinh vật từ dạ cỏ động vật nhai lại như bò, cừu và dê. Kết quả phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose như P. eruginosa, Streptococcus, Bacillus, Penicillin, Aspergillus, Mucor và Fusarium. Việc sử dụng thực phẩm có chế phẩm vi sinh (hoặc như 1 thành phần tự nhiên của thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từ lâu, nhưng việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng chế phẩm vi sinh mới thực sự phát triển từ những năm 80 của thế kỷ 20 (Patterson et al., 2003). Những nghiên cứu phân loại và đặc điểm của quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật được tiến hành bởi Savage (1987); Vahjen et al. (1998); Apajalahti et al. (1998); Vander Wielen et al. (2000) đã cho thấy nếu như trong ruột non của người Bacteroides và Bifidobacterium chiếm ưu thế thì ở gà là Ruminococcus và Streptococcus. Bằng kỹ thuật phân tử, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 đến 50% số loài vi sinh vật đường ruột ở động vật được phân lập, nuôi cấy như nguồn chế phẩm vi sinh (Patterson et al., 2003). Zhu et al. (2002) đã sử dụng kỹ thuật phân tử để nghiên cứu sự thay đổi cấu trúc quần thể và đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ở động vật dưới tác động của chế phẩm vi sinh. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên một hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ (Patterson et al., 2003). Vi sinh vật học K36 18 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Đã có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của chế phẩm vi sinh đối với đời sống động vật như tác động của chế phẩm vi sinh đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc ruột (Schat và Myer, 1991); Hersbberg Mayer, (2000); đối với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi (McCracken and Lorenz, 2001). Những ảnh hưởng có lợi của chế phẩm vi sinh thể hiện ở nhiều khía cạnh khác nhau nhưng những hiểu biết của con người về cơ chế tác động của chúng còn rất hạn chế. Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của chế phẩm vi sinh trong việc ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các acid béo bay hơi, các chất giống kháng sinh...), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột (Fuller, 1989; Gibson và Fuller, 2000; Rolfe, 2009). Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nhờ ứng dụng những tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự acid nucleic trong nghiên cứu phân loại và định danh các chủng vi sinh vật, công nghệ sản xuất các sản phẩm chế phẩm vi sinh phục vụ chăn nuôi ngày càng trở nên dễ dàng và phổ biến hơn ở nhiều nước trên thế giới. 2.9. Một số chế phẩm sinh học tiêu biểu ở nước ta 2.9.1. Chế phẩm sinh học được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm. BIO-I (dùng trong chăn nuôi), thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/g, Bacillus spp. 108 CFU/g, Sacchromyces spp. 107 CFU/g, amylase 300 UI/g, protease 40 UI/g. Tác dụng: Kích thích tiêu hóa cho gia súc, gia cầm, giúp tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn. Giảm các chứng rối loạn tiêu hóa và tiêu chảy. BIO-SUPER (dùng trong chăn nuôi), thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/g, Bacillus spp. 109 CFU/g, Sacchromyces spp. 10 7 CFU/g. Tác dụng: Kích thích tiêu hóa cho gia súc, gia cầm. Giúp tăng trọng nhanh và giảm tiêu tốn thức ăn. Phòng và trị các chứng rối loạn tiêu hoá, các chứng tiêu chảy do sử dụng kháng sinh lâu dài. VEM-K (dùng trong chăn nuôi), và VEM (nuôi trồng thuỷ sản (NTTS)). Thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/ml, Bacillus spp. 10 6 CFU/ ml, Sacchromyces Vi sinh vật học K36 19 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT spp. 107 CFU/ ml, khoáng dễ tiêu. Tác dụng: Kích thích tiêu hóa, giảm tiêu tốn thức ăn, giảm mùi hôi của phân, xử lý các chất thải hữu cơ và các khí độc trong môi trường ao nuôi, cạnh tranh, ức chế vi khuẩn gây bệnh cho tôm, cá. BIO-HR (dùng trong chăn nuôi), thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/ml, Bacillus spp. 10 6 CFU/ ml, Nấm men 10 7 CFU/ ml. Tác dụng: Kích thích tiêu hóa, giảm tiêu tốn thức ăn, giảm mùi hôi của phân. BIO-T (dùng trong chăn nuôi và NTTS) bao gồm Bacillus subtilis 107 CFU/g, đạm thô 25%, protease 50 UI/g. Tác dụng: Kích thích sự thèm ăn. Giúp tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn. Giảm tỷ lệ bệnh heo, gà, tôm, cá. BIO-G (dùng trong chăn nuôi và NTTS), thành phần gồm β-Glucan 10%, Bacillus spp. 108 CFU/g, đạm tổng 25 %, Protease 40 UI/g, chất dẫn dụ. Kích sự thèm ăn. Giảm tiêu hao thức ăn. Giảm tỷ lệ bệnh cho heo, gà, tôm, cá. BIO-II (dùng trong nuôi trồng thuỷ sản) thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/g, Bacillus spp. 108 CFU/g, Sacchromyces spp. 107 CFU/g, amylase 300 UI/g, protease 50 UI/g. Có tác dụng: phân hủy thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao, ổn định màu nước. Ổn định pH của nước ao. Kích thích tiêu hoá. Kìm hãm sự tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh như các vi khuẩn nhóm Vibrio BIO-HH (dùng trong nuôi trồng thuỷ sản) thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/g, Bacillus spp. 108 CFU/g, Sacchromyces spp. 107 CFU/g, Nitrosomonas sp.10 8 CFU/g, Nitrobacter sp.108 CFU/g, amylase 800 UI/g, protease 100 UI/g. Có tác dụng: phân hủy nhanh thức ăn thừa và các khí thải ở đáy ao, ổn định màu, pH nước ao, kích thích tiêu hóa và ức chế vi sinh vật gây bệnh tôm, cá. BIO-III (dùng trong nuôi trồng thuỷ sản) thành phần gồm Bacillus spp. 107 CFU/g, β-glucan 15%. Tác dụng: Kích thích hệ miễn dịch, tăng sức đề kháng của tôm, cá, phân hủy các chất hữu cơ dư thừa. Ức chế các vi sinh vật gây bệnh. PB (dùng trong NTTS) bao gồm Rhodopseudomonas và Rhodospirillum 109 CFU/ml. Tác dụng: Phân giải thức ăn dư thừa, khí độc H2S, NH3 trong ao nuôi tôm, cá. Giúp cân bằng sinh thái, giảm tỉ lệ bệnh cho tôm. Vi sinh vật học K36 20 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT BIO-H (dùng trong NTTS) Nitrosomonas sp.10 9 CFU/g, Nitrobacter sp.109 CFU/g, Bacillus spp. 108 CFU/g. Tác dụng: Làm giảm nồng độ NH3, nitrite, phân giải thức ăn dư thừa ở đáy ao, tạo môi trường nước sạch cho sự phát triển của thủy sản. BIO-MN (dùng trong NTTS) bao gồm Bacillus spp. 107 CFU/g, Nitrosomonas sp. 10 7 CFU/g, Nitrobacter sp. 107 CFU/g, xạ khuẩn 10 5 CFU/g, hữu cơ 50 %, P205 1,8-2,2 %, K20 1,0-1,5 %, Mg 0,3 %. Tác dụng: Kích thích tảo phiêu sinh có lợi, gây màu nước. Cân bằng hệ sinh thái trong ao, ổn định màu nước. Giúp cho thủy sản phát triển tốt. BIO-F (dùng trong trồng trọt) bao gồm Trichoderma spp. 108 CFU/g, Streptomyces spp. 108 CFU/g, Bacillus spp. 10 8 CFU/g. Phòng nấm bệnh cây trồng. Phân giải các chất hữu cơ làm tăng độ mùn và độ phì nhiêu của đất. Sản xuất phân hữu cơ vi sinh từ than bùn, mùn mía, vỏ cà phê, phân chuồng, rác thải hữu cơ. BIO-AB (dùng trong trồng trọt) bao gồm Azotobacter sp. 109 CFU/g, Pseudomonas sp. 109 CFU/g. Cố định Nitơ tự do tạo thành các hợp chất chứa nitơ, làm giàu cho đất, giảm phân bón hóa học. Phân giải các hợp chất lân không tan thành dễ tan, giúp cây dễ dàng hấp thu. Cải tạo, làm tăng độ phì nhiêu của đất. BIO-FA (dùng trong trồng trọt) bao gồm Trichoderma spp. 108 CFU/g. Streptomyces spp. 106 CFU/g. Bacillus sp. 108 CFU/g. Azotobacter sp. 107 CFU/g. Pseudomonas sp. 10 8 CFU/g. Tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất, cải tạo đất, thúc đẩy quá trình phân giải chất hữu cơ, cellulose, tăng độ mùn, chống thoái hóa đất. Phòng trị các nấm bệnh hại cây trồng. Cố định nitơ tự do tạo thành các hợp chất nitơ hòa tan, làm giàu nitơ cho đất. Phân giải các hợp chất lân khó tiêu thành dễ tiêu. Sản xuất phân hữu cơ vi sinh từ than bùn, mùn mía, vỏ cà phê, phân chuồng, rác thải hữu cơ. BIO-BM (dùng trong trồng trọt) bao gồm Beauveria bassiana ≥ 108 CFU/g. Metarhizium anisopliae ≥ 108 CFU/g. Đặc trị các loại sâu bệnh và côn trùng gây hại trên cây trồng như: sâu xanh, sâu tơ, sâu cuốn lá,… (thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera); rầy nâu (thuộc bộ cánh đều Homoptera), bọ trĩ, ve sầu,… BIO-BL (dùng trong trồng trọt) bao gồm đạm thô 25%, Bacillus sp. 108 CFU/g, Azotobacter sp. 107 CFU/g, Pseudomonas sp. 10 7 CFU/g. Cố định Nitơ tự do Vi sinh vật học K36 21 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT tạo thành các hợp chất chứa nitơ, làm giàu cho đất, giảm phân bón hóa học. Phân giải các hợp chất lân không tan thành dễ tan, giúp cây dễ dàng hấp thu. Cải tạo, làm tăng độ phì nhiêu của đất. BIO-HK (dùng trong xử lý môi trường) bao gồm Nitrosomonas sp.108 CFU/g, Nitrobacter sp.108 CFU/g, Bacillus spp. 108 CFU/g, Streptomyces spp. 107 CFU/g. Xử lý chất thải trong điều kiện hiếu khí, phân hủy các chất hữu cơ trong nước thải sinh hoạt, công nghiệp. BIO-YK (dùng trong xử lý môi trường) bao gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/ml, Bacillus spp. 107 CFU/ ml, Sacchromyces spp. 107 CFU/ ml, vi khuẩn quang dưỡng 105. Xử lý chất thải trong điều kiện yếm khí, phân hủy các chất hữu cơ trong nước thải sinh hoạt, công nghiệp. BIO-D (Bột thông cầu và xử lý môi trường) bao gồm: tổng VSV phân giải chất hữu cơ (cellulose, tinh bột, protein,…): 109 CFU/g. Phòng chống tắc nghẽn hầm cầu. Xử lý chất thải hữu cơ ở đáy ao nuôi tôm, cá. Phân hủy các chất hữu cơ trong nước thải. Giảm mùi hôi. Vi sinh vật học K36 22 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 2.9.2. Chế phẩm sinh học trên thị trường. Bảng 2. Các chế phẩm sinh học trên thị trường Đối tượng Công ty sản xuất Navet- Biozym BIO-I, BIO-II, BIO-III Heo, gà, tôm, cá Cty thuốc thú y Trung 2 Sonasubtyl BIO-I Gia súc, gia cầm Cty thuốc thú y Sài Gòn 3 Biozym BIO-I Heo, cá STT Tên sản phẩm 1 Nguồn gốc Ương Cty THNH thuốc thú y Long An 4 Lactizym NPV BIO-Super Gia súc, gia cầm CtyTNHH-TMSX 5 Prozym NPV BIO-I Gia súc, gia cầm Thuốc thú y NAPHA 6 Thức ăn gia BIO-G, BIO-T Heo sau cai sữa Cty SX TĂGS Kim Long Heo, gà, tôm, cá TT UDKHKT các tỉnh súc Cám 351 7 EM VEM gốc phía nam 8 9 Mebi-lactyl Mebi-Antibio Bio-super Vitazym Enzym-ANV Glucan-Biotic BIO - Super BIO I BIO-III Heo, gà Cty TNHH Thuốc thú y MEBIPHA Heo, gà Heo, gà Heo, gà CtyTNHH Anvet (*Nguồn:http://www.agroviet.gov.vn/Pages/statisticreport.aspx?TabId=thongke, 24/11/2013) Vi sinh vật học K36 23 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Phương tiện nghiên cứu 3.1.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, địa điểm Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật , tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), kính hiển vi olympus CHT (Nhật), máy đo OD, nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủ sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), cân điện tử Satorius (Đức), lò vi sóng Panasonic (Thái lan), máy ly tâm, tủ lạnh -4 oC Akira (Việt Nam), hệ thống phân tích xơ VELP (Ý), máy tro hóa Nabertherm (Đức), máy chụp ảnh kỹ thuật số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu. Dụng cụ: Tủ cấy vi sinh vật, tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủ sấy EHRET (Đức), cân điện tử Satorius (Đức), lò vi sóng Panasonic (Thái lan), máy ly tâm, tủ lạnh -20 oC và tủ lạnh 4oC Akira (Việt Nam), máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu. Eppendorf entrifuge 5417 (Đức), bộ micropipette (Bio-Rad) P10, P20, P200, P1000 (Đức), đĩa petri, bình Erlenmeyer 500 ml, ống nghiệm 15ml (Đức) và một số dụng cụ khác như: que cấy, que thủy tinh,, cốc đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, đèn cồn,… Hóa chất: Ethanol 95%, agar, H2SO4 đậm đặc, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, n-octanol (C8H18O) octilic alcohol, acetone, Sodium hidroxide (NaOH), acetate buffer,… Địa điểm: được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh Hóa và Công nghệ Enzyme, Hóa sinh Thực phẩm, Vi Sinh Thực phẩm và Vi sinh vật thuộc Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Trong khoảng thời gian: từ tháng 07/2013 đến tháng 11/2013. Hình 4. Một số thiết bị thí nghiệm Vi sinh vật học K36 24 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 3.1.2. Nguyên vật liệu Bã mía: thu bã mía thô từ nhà máy đường Hậu Giang, sấy bã mía ở 70oC trong 30 - 45 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích thước lỗ lưới 0,1mm. Sau đó tiến hành rửa và lọc bột bã mía bằng nước lọc qua nhiều lần để loại bỏ đường cũng như một số tạp chất. Mẫu vi khuẩn: dòng vi khuẩn dạ cỏ bò BM21 cho kết quả đồng hình với dòng vi khuẩn Bacillus subtilis S20 (do phòng thí nghiệm CNSH Enzyme cung cấp). 3.1.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật Bảng 3. Thành phần môi trường cải tiến (M1) Tên hóa chất Khối lượng/Thể tích Đơn vị Bột bã mía 10 gram (NH4)2SO4 1 gram KH2PO4 1 gram K2HPO4 1 gram 0,5 gram NaCl 0,001 gram Agar 20 gram Nước 1000 ml MgSO4.7H2O (* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh, 2010) Vi sinh vật học K36 25 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Môi trường lỏng Ryckeboer ( 2003) cải tiến Bảng 4. Thành phần môi trường cải tiến (M2) Tên hóa chất Khối lượng/ Thể tích Đơn vị Bột bã mía 10 gram (NH4)2SO4 1 gram KH2PO4 1 gram K2HPO4 1 gram 0,5 gram NaCl 0,001 gram Nước 1000 ml MgSO4.7H2O (* Nguồn : Ryckeboer et al., 2003 cải tiến bởi Bùi Thị Thiên Thanh, 2010) 3.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của một số loại đường khi phối trộn Mục đích thí nghiệm: khảo sát sự ảnh hưởng của một loại đường khi phối trộn để làm chế phẩm bột vi khuẩn. Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, với là 6 loại đường: Galactose, Glucose, Lactose, Mannose, Mannitol, Fructose với nghiệm thức đối chứng, 3 lần lặp lại. Tổng số đơn vị thí nghiệm là 21 nghiệm thức (NT) Tiến hành thí nghiệm: - Giống: vi khuẩn BM21. - Tạo sinh khối vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn (108 tb/ml) vào 200 ml môi trường lỏng, ủ trong bình kỵ khí ở 38oC trong 3 ngày để đạt được mật số 108 tb/ml (Nguyễn Thanh Son, 2013). - Thu sinh khối: Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ dịch trong để thu lấy phần cặn gồm vi khuẩn và bã mía. Vi sinh vật học K36 26 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT - Phối trộn: Cho 1 gram đường vào phần cặn đã thu được, trộn đều (tỉ lệ 50% đường + 50% hỗn hợp bã mía và vi khuẩn). - Sấy khô sản phẩm ở 40 oC trong 24h - Đánh giá chế phẩm: + Khảo sát mật số vi khuẩn có trong chế phẩm. Hòa 0,1g chế phẩm vào 10ml nước muối sinh lý, pha loãng và đếm mật số. + Khảo sát khả năng tạo vòng halo của của chế phẩm: Nguyên tắc: Congo Red có khả năng tạo liên kết với cầu nối β 1-4 glucosid trên cellulose tạo màu đỏ trên bề mặt môi trường sau khi nhuộm. Tiến hành: Sử dụng phần dịch hòa tan chế phẩm để đếm mật số. Rút 15µl cho vào mỗi lỗ đục (đường kính 5mm) trên môi trường đĩa thạch với cơ chất là bã mía. Phần còn lại sử dụng cho các thí nghiệm phân tích xơ (DM, CF). Đem mẫu đĩa thạch ủ sau 48 tiếng nhuộm với Congo Red 1% (w/v). Đường kính phân giải bã mía được tính: Đường kính phân giải bã mía = Đường kính vòng halo – đường kính đục lỗ + Khảo sát khả năng phân giải bã mía của chế phẩm dựa vào phần trăm vật chất khô (DM). Mẫu thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Nguyên tắc: sấy khô mẫu ở 70 oC cho lượng nước mất đi, phần còn lại là chất khô hoàn toàn của mẫu. Tiến hành: Sấy bã mía ở 70 oC trong 48 giờ, làm nguội mẫu trong bình hút ẩm về nhiệt độ thấp hơn (40oC). Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích. + Khảo sát khả năng phân giải bã mía của chế phẩm dựa vào phần trăm xơ thô (CF). Mẫu thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Nguyên tắc: Bột bã mía xử lý lần lượt bằng dung dịch acid sulfuric và hydroxide loãng. Acid sulfuric phân giải các chất hòa tan trong acid như cacbohydrat thành đường đơn và một phần protein hòa tan. Ngoài ra, acid và kiềm có thể hòa tan được một phần chất khoáng. Sau khi xử lý đem nung ở nhiệt độ cao trọng lượng mất đi là khối lượng xơ thô. Vi sinh vật học K36 27 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Tiến hành: Bã mía sau khi xử lý bằng dung dịch H2SO4 1,25% (v/v) và NaOH 1,25% (v/v); sau đó được tro hóa ở 600oC trong 3 giờ. Phần trăm xơ thô (CF) được tính theo công thức sau: + Kiểm tra độ ẩm của chế phẩm bằng cách cân 0,5g chế phẩm bằng cân phân tích, sau đó sấy đến trọng lượng không đổi ở 70oC, cân trọng lượng sau để tính ra % độ ẩm. Chỉ tiêu theo dõi:  Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm.  Định tính khả năng phân giải bã mía của chế phẩm bằng phương pháp đo đường kính vòng halo.  Phần trăm vật chất khô (DM) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích hàm lượng vật chất khô.  Hàm lượng xơ thô (CF) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích xơ thô.  Phần trăm ẩm độ của chế phẩm. 3.2.2.Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ đường Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ đường tối ưu để làm chế phẩm đạt được hiệu quả tốt nhất. Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, 6 nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mẫu đường thu được từ thí nghiệm 1. Nguyên liệu: + Loại đường phù hợp được tuyển chọn từ TN1. + Giống: vi khuẩn BM21. Vi sinh vật học K36 28 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Tiến hành thí nghiệm: + Tạo sinh khối vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn (108 tb/ml) vào 200 ml môi trường lỏng, ủ trong bình kỵ khí ở 38oC trong 3 ngày để đạt được mật số 108 tb/ml (Nguyễn Thanh Son, 2013). + Ly tâm dịch nuôi cấy (7000 vòng/phút trong 20 phút). Phối trộn đường với cặn ly tâm bao gồm vi khuẩn và bã mía (đơn vị m/m) theo tỉ lệ lần lượt là:  100% bã mía và vi khuẩn  75% bã mía và vi khuẩn + 25% Lactose (tỉ lệ 3-1)  67,7% bã mía và vi khuẩn + 33,3% Lactose (tỉ lệ 2-1)  50% bã mía và vi khuẩn + 50% Lactose (tỉ lệ 1-1)  33,3% bã mía và vi khuẩn + 67,7% Lactose (tỉ lệ 1-2)  25% bã mía và vi khuẩn + 75% Lactose (tỉ lệ 1-3) + Sấy khô sản phẩm ở 40oC cho đến khi mẫu được đông khô thành dạng bột. Chỉ tiêu theo dõi:  Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm.  Định tính khả năng phân giải bã mía của chế phẩm bằng phương pháp đo đường kính vòng halo.  Phần trăm vật chất khô (DM) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích hàm lượng vật chất khô.  Hàm lượng xơ thô (CF) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích xơ thô.  Phần trăm ẩm độ của chế phẩm Vi sinh vật học K36 29 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát một số điều kiện nhiệt độ sấy khô sản phẩm Mục đích thí nghiệm: Khảo sát điều kiện và nhiệt độ phù hợp để sấy khô sản phẩm đạt hiệu quả và ít tốn kém nhất. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại. Nguyên liệu: Bột vi khuẩn. Tiến hành thí nghiệm: - Tạo sinh khối vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn (108 tb/ml) vào 100 ml môi trường lỏng, ủ trong bình kỵ khí ở 38oC trong 3 ngày để đạt được mật số 108 tb/ml. - Thu sinh khối: Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ dịch trong để thu lấy phần cặn gồm hỗn hợp vi khuẩn và bã mía. - Phối trộn: Loại đường được tuyển chọn từ TN1. Theo nồng độ có kết quả khảo sát tốt nhất ở TN2. - Sấy khô sản phẩm ở 40 oC cho đến khi mẫu được đông khô thành dạng bột. - Trữ mẫu trong túi nhựa PP. - Sử dụng những phương pháp sấy khác nhau như để ở nhiệt độ phòng (30oC), sấy bằng nhiệt (40, 45, 50, 60oC), sấy đông khô để tiếp tục kiểm tra các chỉ tiêu. Chỉ tiêu theo dõi:  Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm.  Định tính khả năng phân giải bã mía của chế phẩm bằng phương pháp đo đường kính vòng halo.  Phần trăm vật chất khô (DM) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích hàm lượng vật chất khô.  Hàm lượng xơ thô (CF) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích xơ thô.  Phần trăm ẩm độ của chế phẩm. Vi sinh vật học K36 30 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ bảo quản sản phẩm Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nhiệt độ phù hợp để bảo quản chế phẩm tốt nhất theo thời gian. Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 nghiệm thức (-20 oC, 0oC, 4oC, nhiệt độ phòng (30oC)), 3 lần lặp lại. Nguyên liệu: Bột vi khuẩn Tiến hành thí nghiệm: - Tạo sinh khối, thu sinh khối và phối trộn như các thí nghiệm 3. Sấy mẫu bằng phương pháp và nhiệt độ tối ưu ở thí nghiệm 3. Trữ mẫu trong túi nhựa PP. - Lấy bột vi khuẩn bảo quản ở nhiệt độ: -20oC, 0oC, 4oC, nhiệt độ phòng sau đó kiểm tra định kỳ Chỉ tiêu theo dõi:  Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm.  Định tính khả năng phân giải bã mía của chế phẩm bằng phương pháp đo đường kính vòng halo.  Phần trăm vật chất khô (DM) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích hàm lượng vật chất khô.  Hàm lượng xơ thô (CF) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích xơ thô.  Phần trăm ẩm độ của chế phẩm. 3.3. Xử lý số liệu Số liệu thô được xỷ lý bằng bảng Microsoft Execl 2003 và phân tích phương sai (ANOVA) bằng phần mềm Statgraphics XV.02 Vi sinh vật học K36 31 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1. Ảnh hưởng của một số loại đường 4.1.1. Mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm Hình 5. Mật số vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng loại đường NT1: ĐC (không trộn đường), NT2: Galactose, NT3: Glucose, NT4: Lactose, NT5: Mannose, NT6: Mannitol, NT7: Fructose Ghi chú: Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. % CV = 3,66 % Khảo sát mật số của vi khuẩn BM21 trong chế phẩm với các nghiệm thức ứng với từng loại đường khác nhau lần lượt là Galactose, Glucose, Lactose, Mannose, Mannitol, Fructose và nghiệm thức đối chứng không phối trộn đường. Kết quả cho thấy mật số đạt cao nhất khi phối trộn với Lactose và Mannitol (NT4, NT6), mật số giảm khi phối trộn với Galactose và Glucose (NT2, NT3), trong khi đó sử dụng Mannose và Fructose (NT5, NT7) cho mật số khá thấp 6,45-6,15 log(CFU/g) và riêng Fructose (NT7) cho kết quả thấp gần với đối chứng (NT1) 5,69 log(CFU/g) . Sử dụng Fructose không hiệu quả cho việc tạo chế phẩm vì Fructose có cấu trúc tinh thể khá to, tương tự như vậy với đường Mannose tuy không có cấu trúc tinh thể to như Fructose nhưng lại dễ bị chảy, hai loại đường này có chung đặc điểm là rất dễ bị chảy và khó tạo sự đồng nhất với hỗn hợp bã mía và vi khuẩn, các loại đường còn lại Vi sinh vật học K36 32 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT có cấu trúc dạng bột mịn, đường Lactose và Mannitol cho kết quả cao nhất, hai loại đường này có chung đặc điểm là có tính hút ẩm tốt khi đó khả năng đảm bảo cho vi khuẩn sống sót trong chế phẩm khá cao, cả hai đều tạo kết dính tốt với hỗn hợp bã mía và vi khuẩn, khi phối trộn dễ tạo thành hỗn hợp đồng nhất. Cả hai đều cho kết quả cao tương đương nhau 8,52-8,53 log (CFU/g) và cao khác biệt hơn hai loại đường Galactose và Glucose 7,29-6,64 log (CFU/g). Chế phẩm Bioche dạng dung dịch của Nguyễn La Anh (2003) đạt mật số vi khuẩn là 108 CFU/ml, một số chế phẩm dạng dung dịch khác như VEM-K, BIO-HR thành phần bao gồm Bacillus ssp mật số tối đa là 106 CFU/ml, trong khi đó mật số của vi khuẩn sau thí nghiệm của NT4 và NT6 đều cao hơn 108 CFU/g chứng tỏ sử dụng đường (Lactose, Mannitol) mang lại hiệu quả tốt trong việc bảo đảm mật số vi khuẩn sau thành phẩm. Kết quả mật số của vi khuẩn BM21 thấp hơn so với Nguyễn Thanh Son (2013) làm trong điều kiện in vitro, điều này có thể lý giải do trong quá trình ly tâm, thu sinh khối, phối trộn đường đã làm thay đổi môi trường của vi khuẩn do đó mật số giảm đi một phần. Theo Nguyễn Lân Dũng (2007) có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Khi vi sinh vật có đủ điều kiện dinh dưỡng để sinh trưởng mạnh mẽ thì cũng đồng thời sinh ra các chất thải có hại và làm hạn chế sự sinh trưởng của chúng. Vi sinh vật học K36 33 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.1.2. Đường kính vòng halo của vi khuẩn trong chế phẩm Hình 6. Đường kính vòng halo phân giải BM của vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng loại đường NT1: ĐC (không trộn đường), NT2: Galactose, NT3: Glucose, NT4: Lactose, NT5: Mannose, NT6: Mannitol, NT7: Fructose Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 3,72% Kết quả khảo sát định tính khả năng phân giải bã mía bằng phương pháp đo đường kính vòng halo trên đĩa thạch, có cơ chất là bã mía của chế phẩm vi khuẩn với những loại đường khác nhau, đối chứng không có vi khuẩn (Hình 6). Biểu đồ cho thấy khả năng phân giải bã mía của vi khuẩn khi được phối trộn với Mannitol, Lactose, Galactose (NT6, NT4, NT2) là tương đương nhau 19,7-19,2-18,4 (mm) và cao hơn so với các nghiệm thức còn lại, trong đó kết quả sử dụng Galactose tương đồng với sử dụng Glucose (NT3) 17,8 (mm). Sử dụng đường Mannose (NT5) cho kết quả tương đồng như khi sử dụng Glucose và Fructose (NT7). Trong khi đó, sử dụng Fructose kết quả đạt thấp nhất trong các nghiệm thức có sử dụng đường và gần bằng với nghiệm thức đối chứng (NT1) 16mm. Theo Lj-Jung et al. (2010) ủ dịch enzyme cellulase với cơ chất cellulose là cách để xác định hoạt tính enzyme exoglucanases trong phức hệ enzyme cellulase. Các nghiệm thức sử dụng đường phối trộn cho kết quả khác biệt Vi sinh vật học K36 34 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT không cao, điều này có thể giải thích là các loại đường trên khi sử dụng làm chất mang không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính enzyme exoglucanases của vi khuẩn. 4.1.3. Kết quả DM của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm Hình 7. DM của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng loại đường NT1: ĐC (không trộn đường), NT2: Galactose, NT3: Glucose, NT4: Lactose, NT5: Mannose, NT6: Mannitol, NT7: Fructose Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 1,45% Ở NT1 (ĐC) sử dụng vi khuẩn nhưng không phối trộn đường kết quả thấp hơn các nghiệm thức có phối trộn đường vì vi khuẩn khi sấy khô làm sản phẩm gặp môi trường thay đổi bất lợi mật số giảm đi dẫn đến khả năng phân giải bã mía giảm. Khi sử dụng Fructose (NT7) có kết quả tỉ lệ %DM giảm đi là 7,89%, thấp nhất trong các nghiệm thức sử dụng đường khác, Fructose ở dạng tinh thể hạt to, dễ bị chảy làm thay đổi hình dạng ban đầu vì vậy khi gặp vi khuẩn và bã mía sau khi ly tâm bỏ dịch vẫn còn độ ẩm tương đối cao làm cho đường chảy ra, khi sấy khô đường lại bị vón cục không đồng nhất với hỗn hợp bã mía, vi khuẩn vì thế khả năng bảo quản sản phẩm kém. Các nghiệm thức sử dụng Glucose (NT3), Mannose (NT5) cũng cho kết quả Vi sinh vật học K36 35 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT không cao (NT3) 9,27%, (NT5) 9,35%, tuy cả hai ở dạng tinh thể dạng hạt nhỏ nhưng với tính chất dễ bị chảy khi gặp ẩm khi sấy khô không giữ được trạng thái ban đầu, không tạo được hỗn hợp đồng nhất nên tính bảo quản kém làm mật số vi khuẩn thấp, khả năng phân giải bã mía và lượng xơ thô thấp. Kết quả khi sử dụng Lactose (NT4) và Mannitol (NT6) đạt kết quả cao nhất, tỉ lệ DM giảm đi khá cao (NT4) 13,41%, (NT6) 13,56%, chứng tỏ hai loại đường này có khả năng bảo quản chế phẩm tốt. Cả hai loại đường này đều có dạng bột mịn, có khả năng giữ ẩm, dễ hấp thu nước, khi sấy cùng nhiệt độ với các nghiệm thức sử dụng các loại đường khác không dễ bị làm khô, mặt khác đường Galactose (NT2) cũng có những tính chất như dạng bột mịn, dễ hấp thu nước và giữ ẩm, nhưng khi sấy lại dễ bị làm khô bởi nhiệt, làm sản phẩm bị khô cứng lại. Tỉ lệ phân giải DM là chỉ tiêu quan trọng để dánh giá khả năng phân giải bã mía của vi khuẩn. Kết quả DM trong thí nghiệm cao phù hợp với yêu cầu về mặt chất lượng của sản phẩm. Tuy nhiên, loại bã mía cũng ảnh hưởng đến kết quả DM, trong thí nghiệm này, bã mía được sử dụng là bã mía mịn (đường kính < 0,1mm) có thể làm chỉ số DM giảm đi cao, vì thế cần kết hợp những yếu tố khác để chọn ra loại đường phù hợp nhất để phối trộn. Như vậy cả hai loại đường Lactose và Mannitose đều có thể sử dụng để phối trộn phù hợp cho chế phẩm bột vi khuẩn trong điều kiện thí nghiệm trên. Vi sinh vật học K36 36 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.1.4. Kết quả CF của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm Sau khi kiểm tra DM 0,5g bã mía được sử dụng tiếp để kiểm tra tỉ lệ tiêu hóa CF bằng dung dịch acid và hydroxit loãng. Hình 8. CF của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng loại đường NT1: ĐC (không trộn đường), NT2: Galactose, NT3: Glucose, NT4: Lactose, NT5: Mannose, NT6: Mannitol, NT7: Fructose Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 2,14% Các nghiệm thức (NT) NT4 (17,16%) và NT6 (17,70%) cho kết quả phân giải xơ thô cao nhất, không khác về mặt ý nghĩa thống kê và tốt hơn các NT còn lại. Xơ thô là thành phần khó phân giải trong bã mía, nhưng kết quả cho thấy các NT4 và NT6 đạt kết quả khá cao, chứng tỏ vi khuẩn có trong thành phẩm vẫn giữ được hoạt tính cellulase khi sử dụng loại đường phù hợp để phối trộn. Để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo cần xác định được loại đường nào phù hợp để làm chế phẩm, kết quả cho thấy cả hai loại đường Lactose và Mannitol đều đáp ứng được yêu cầu, chúng tôi chọn đường Lactose để tiếp tục tiến hành các khảo sát khác vì xét về mặt thương mại, đường Lactose có dạng sản xuất công nghiệp có giá thành thấp hơn nhiều so với đường Mannitol. Giá đường Lactose và Mannitol trên thị trường lần lượt là 0,6393$/lb; 18,9$/lb (* Nguồn: USDA Agricultural Marketing Service, 25/11/2013) Vi sinh vật học K36 37 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.1.5. Độ ẩm của chế phẩm Bảng 5. Kết quả tỉ lệ phầm trăm độ ẩm của chế phẩm tương ứng với từng loại đường Đường Độ ẩm (%) Galactose 9,40 b Glucose 8,58 b Lactose 13,24 a Mannose 6,26 c Mannitol 12,88 a Fructose 6,04 c Các trị trung bình trong cùng một hàng có các chữ theo sau giống nhau thì khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Số liệu trong bảng là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 7,5% Kết quả thống kê có thể chia khả năng giữ ẩm của các loại đường thành ba mức độ khác nhau: tốt, trung bình và kém. Nhóm cho kết quả tốt là sản phẩm sử dụng Lactose và Mannitol, cả hai đều có kết quả không khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê và cao hơn sản phẩm chứa các loại đường còn lại. Nhóm có kết quả trung bình bao gồm sản phẩm sử dụng Galactose và Glucose. Nhóm giữ ẩm kém gồm sản phẩm chứa Mannose và Fructose. Nhìn chung, những loại đường có khả năng giữ ẩm tốt khi phối trộn và đem sấy khô sẽ cho kết quả cao, giúp bảo quản và giữ ổn định sản phẩm tốt hơn. Kết hợp những chỉ tiêu khảo sát, đường Lactose cho kết quả tốt nhất được sử dụng để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Vi sinh vật học K36 38 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.2. Khảo sát nồng độ đường 4.2.1. Mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm Hình 9. Mật số vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng nồng độ đường NT1: 100% (m/m) bã mía và vi khuẩn, NT2: 75% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 25% (m/m) Lactose, NT3: 67,7% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 33,3% (m/m) Lactose, NT4: 50% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 50% (m/m) Lactose, NT5: 33,3% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 67,7% (m/m) Lactose, NT6: 25% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 75% (m/m) Lactose Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 2,91% Khảo sát mật số của vi khuẩn BM21 có trong chế phẩm ứng với từng nồng độ đường Lactose khác nhau. Phối trộn Lactose với nồng độ thấp NT2 (25% m/m) 6,30 log (CFU/g) và NT3 (33,3% m/m) 6,89 log (CFU/g) cho kết quả mật số thấp vì khi đó lượng Lactose không đủ để hút hết lượng nước còn sót của hỗn hợp sau ly tâm. Ở NT5 và NT6 cho kết quả cao nhất và tương đương nhau và cao hơn NT4 với tỉ lệ phối trộn Lactose là NT5 (67,7% m/m) 9,09 log (CFU/g) , NT6 (75% m/m) 9,30 log (CFU/g), NT4 (50% m/m) 8,57 log (CFU/g). Nồng độ đường càng chiếm tỉ lệ cao sẽ giúp bảo quản chế phẩm tốt hơn, mật số được bảo đảm vì đường tạo được lớp màng bao quanh vi khuẩn, không những giúp vi khuẩn tránh được những bất lợi từ môi trường bên ngoài mà còn giúp chúng gắn kết với nhau khi đó sự chống chịu của vi khuẩn với môi trường bất lợi sẽ tốt hơn. Các chế phẩm bột vi khuẩn Bacillus BIO-T, BIO-G sử dụng Vi sinh vật học K36 39 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT đạm thô phối trộn mật số vi khuẩn đạt tối đa 10 8 CFU/g. Trong khi đó mật số vi khuẩn trong thí nghiệm đạt đến 10 9 CFU/g chứng tỏ phối trộn nồng độ đường hợp lí sẽ làm tăng độ sống sót của vi khuẩn. 4.2.2. Đường kính vòng halo của vi khuẩn trong chế phẩm Hình 10. Đường kính vòng halo phân giải BM của vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng nồng độ đường NT1: 100% (m/m) bã mía và vi khuẩn, NT2: 75% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 25% (m/m) Lactose, NT3: 67,7% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 33,3% (m/m) Lactose, NT4: 50% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 50% (m/m) Lactose, NT5: 33,3% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 67,7% (m/m) Lactose, NT6: 25% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 75% (m/m) Lactose Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 2,91% Khảo sát khả năng tạo vòng halo của vi khuẩn có trong chế phẩm với những nồng độ Lactose khác nhau. Các NT4 (19,3 mm), NT5 (19,7 mm), NT6 (20 mm) cho kết quả đường tròn vòng halo cao (khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê), và tốt hơn các nghiệm thức còn lại. Trong đó, NT4 có kết quả tương đồng với NT3 (18 mm) và cao hơn với kết quả khác biệt có ý nghĩa thống kê với NT2, NT1, mặc khác, NT2 và NT3 có kết quả tương đồng nhau. Hiệu quả tạo vòng halo trên cơ chất bã mía mang tính chất định tính về khả năng sinh enzyme cellulase để phân giải bã mía của vi khuẩn, vì vậy kết hợp thêm những chỉ tiêu khác để khẳng định nồng độ đường thích hợp. Vi sinh vật học K36 40 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.2.3. Kết quả DM của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm Hình 11. DM của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng nồng độ đường NT1: 100% (m/m) bã mía và vi khuẩn, NT2: 75% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 25% (m/m) Lactose, NT3: 67,7% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 33,3% (m/m) Lactose, NT4: 50% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 50% (m/m) Lactose, NT5: 33,3% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 67,7% (m/m) Lactose, NT6: 25% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 75% (m/m) Lactose Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 3,77% Phần trăm tỉ lệ tiêu hóa DM ở các nghiệm thức (NT) NT4, NT3, NT2, có kết quả tỉ lệ % DM giảm đi lần lượt giảm dần theo tỉ lệ thuận với nồng độ Lactose giảm, Các NT khác điều có khả năng phân giải bã mía cao hơn các NT thức đối chứng. Nên tập trung vào những NT có khác biệt có ý nghĩa lớn nhất với các NT đối chứng, ở nghiệm thức 5 (NT5) và nghiệm thức 6 (NT6) có kết quả cao nhất với các giá trị là (NT5) 15,24%; (NT6) 15,79%, cả hai đều cho kết quả khác không có ý nghĩa thống kê. Xác định tỉ lệ tiêu hóa DM phần nào phản ánh hiệu quả phân giải bã mía của vi khuẩn. Kết quả khảo sát cho thấy có mối tương quan cao giữa nồng độ đường và tỉ lệ % DM giảm đi, với nồng độ đường cao đạt ngưỡng nhất định sẽ giúp bảo quản chế phẩm tốt nhất, làm tăng khả năng sống sót của vi khuẩn cũng như tăng hiệu quả tiêu hóa bã mía, bảo đảm cho sản phẩm đạt yêu cầu về chất lượng. Vi sinh vật học K36 41 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.2.4. Kết quả CF của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm Hình 12. CF của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng nồng độ đường NT1: 100% (m/m) bã mía và vi khuẩn, NT2: 75% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 25% (m/m) Lactose, NT3: 67,7% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 33,3% (m/m) Lactose, NT4: 50% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 50% (m/m) Lactose, NT5: 33,3% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 67,7% (m/m) Lactose, NT6: 25% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 75% (m/m) Lactose Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 4,42% Kết quả khảo sát cho thấy NT5 (20,20%) và NT6 (20,98%) có kết quả cao nhất và không khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê, cả hai đều cao hơn các nghiệm thức (NT) còn lại lần lượt là NT4, NT3, NT2, NT1. Trong đó, NT2 (11,59%) và NT1(10,46%) có kết quả % CF giảm đi là thấp nhất và cả hai không khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê. Nồng độ đường càng cao khả năng bảo vệ sản phẩm vi khuẩn càng tốt, làm giảm sự hao hụt mật số cũng như giúp vi khuẩn giữ được hoạt tính enzyme cellulase, làm tăng khả năng tiêu hóa xơ thô, đảm bảo chất lượng của sản phẩm. Như vậy, phối trộn đường theo tỉ lệ 33,3% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 67,7% (m/m) Lactose (NT5) và 25% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 75% (m/m) Lactose (NT6) mang lại hiệu quả tiêu hóa DM và CF cao nhất. Mặt khác, xét về giá trị kinh tế khi tạo thành phẩm thì NT5 là tốt nhất về mặt nguyên liệu và kết quả. Vi sinh vật học K36 42 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.2.5. Độ ẩm của sản phẩm Bảng 6. Kết quả tỉ lệ phầm trăm độ ẩm của chế phẩm tương ứng từng nồng độ Lactose Tỉ lệ % Lactose (m/m) 0 25% 33,3% 50% 67,7% 75% Độ ẩm (%) 4,28 d 10,71c 11,29 c 13,56b 14,33ab 14,75a Các trị trung bình trong cùng một hàng có các chữ theo sau giống nhau thì khác biệt không ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Số liệu trong bảng là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 4,2% Khảo sát độ ẩm của sản phẩm theo từng nồng độ Lactose cho thấy tỉ lệ Lactose 75% và 67,7% (m/m) trong tổng lượng sản phẩm cho kết quả cao nhất, không khác biệt về ý nghĩa thống kê. Trong đó, tỉ lệ độ ẩm trong chế phẩm khi phối trộn Lactose 67,7% và 50% (m/m) có kết quả tương đồng. Kết quả thấp nhất khi không sử dụng đường phối trộn. Kết hợp với với các khảo sát khác, tỉ lệ phối trộn 33,3% (m/m) bã mía và vi khuẩn + 67,7% (m/m) Lactose trong tổng lượng sản phẩm được chọn để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Vi sinh vật học K36 43 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.3. Khảo sát điều kiện nhiệt độ sấy khô sản phẩm 4.3.1. Mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm Hình 13. Mật số vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy NT1: 30o C, NT2: 40oC, NT3: 45oC, NT4: 50oC, NT5:60oC, NT6: sấy đông khô Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 3,16% Khảo sát mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm với điều kiện sấy khác nhau lần lượt là sấy ở nhiệt độ 30, 40, 45, 50, 60oC và sấy đông khô. Kết quả cho thấy nghiệm thức 5 (NT5) sấy ở 60oC cho kết quả thấp nhất 6,64 log(CFU/g), kế tiếp là NT1 sấy ở 30oC 7,72 log (CFU/g). Trong khi đó, NT3 sấy ở 45 oC và NT5 sấy đông khô đạt kết quả cao nhất, không khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê 9,24-9,31 log (CFU/g) và cao hơn hai nghiệm thức 2 (NT2), nghiệm thức 4 (NT4). NT2 sấy ở 40 oC 8,54 log (CFU/g); NT4 sấy ở 50 oC 8,38 log (CFU/g). Vi khuẩn cần độ ẩm nhất định để tiếp tục duy trì sự phát triển, khi sấy ở nhiệt độ quá cao sẽ làm mất đi lượng nước đáng kể đồng thời tiêu diệt vi khuẩn, đường không thể giúp bảo vệ vi khuẩn nếu nhiệt độ vượt quá cao. Ngược lại, khi trong sản phẩm lượng nước còn nhiều sẽ làm vi khuẩn tiếp tục sinh sản và trao đổi chất, khi đó sẽ dẫn đến giai đoạn chết làm giảm mật số, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Theo Nguyễn Lân Dũng (2007) có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Khi vi sinh vật có đủ điều kiện dinh dưỡng để sinh trưởng mạnh mẽ thì cũng đồng thời sinh ra các chất thải có Vi sinh vật học K36 44 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT hại và làm hạn chế sự sinh trưởng của chúng. Vì vậy, ở nhiệt độ sấy thích hợp sẽ giúp đảm bảo mật số của vi khuẩn cũng như tạo điều kiện để đường giúp bảo quản chế phẩm tốt hơn. Sấy đông khô và sấy ở 45oC đều mang lại kết quả tốt nhất khi kiểm tra mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm, cần kết hợp với những khảo sát khác để chọn phương pháp phù hợp nhất. 4.3.2. Đường kính vòng halo của vi khuẩn trong chế phẩm Hình 14. Đường kính vòng halo phân giải BM của vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy NT1: 30o C, NT2: 40oC, NT3: 45oC, NT4: 50oC, NT5: 60oC, NT6: sấy đông khô Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 1,6% Ở nghiệm thức 3, nghiệm thức 6 cho kết quả tốt nhất, NT3: 20,67 mm; NT6 20,83mm, không khác biệt ý nghĩa về mặt thống kê và cao hơn các nghiệm thức còn lại. Trong đó, NT3 có kết quả tương đồng với NT2 (20,17mm) và cao hơn NT1 (19,50mm). Nghiệm thức 5 sấy ở 60oC cho kết quả thấp nhất với (17,50mm). Đường kính vòng halo phản ánh định tính khả năng sinh enzyme cellulase để phân giải bã mía của vi khuẩn, điều kiện nhiệt độ sấy thích hợp cụ thể là sấy ở 45 oC và sấy bằng phương pháp đông khô không gây ảnh hưởng đến quá trình sản sinh enzyme cellulase của vi khuẩn. Ở những điều kiện không phù hợp sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình bảo quản thành phẩm cũng như không đảm bảo được chất lượng sản phẩm. Vi sinh vật học K36 45 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.3.3. Kết quả DM của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm Hình 15. DM của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy NT1: 30o C, NT2: 40oC, NT3: 45oC, NT4: 50oC, NT5: 60oC, NT6: sấy đông khô Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 3,04% Khảo sát tỉ lệ tiêu hóa DM của vi khuẩn trong chế phẩm với từng điều kiện nhiệt độ sấy khác nhau. Ở nghiệm thức 3 (15,74%) và nghiệm thức 6 (16,07% ) đạt kết quả cao nhất không khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê và cao hơn các nghiệm thức còn lại lần lượt là nghiệm thức (NT) NT2, NT4, NT1, NT5. Trong đó, NT3 (15,74%) có kết quả tỉ lệ tiêu hóa DM tương đồng với NT2 15,07%. Khi sấy ở nhiệt độ cao sẽ làm mất đi độ ẩm của chế phẩm dẫn đến giảm mật số đồng thời ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme cellulase của vi khuẩn. Ngược lại nếu độ ẩm quá cao dẫn đến khả năng vi khuẩn tiếp tục sinh sản và phát triển sau đó đến sau giai đoạn ổn định vi khuẩn sẽ tự sản sinh ra chất ức chế gây chết tế bào. Ray et al., (2007) đã chỉ ra rằng thời gian vi khuẩn sinh trưởng càng dài, hoạt tính cellulase có xu hướng giảm dần. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Melo et al. (2007), điều này được lý giải rằng do sự mất ẩm độ trong môi trường sẽ gây biến tính của enzyme hoặc sự thay đổi của pH trong môi trường sẽ làm ảnh hưởng đến khả năng sinh enzyme của vi khuẩn. Singh et al., (2009) giải thích thêm một nguyên nhân cho sự suy giảm hoạt tính của enzyme là do Vi sinh vật học K36 46 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT sự tích lũy của các phân tử cellobiose có thể tạo ra những hợp chất vòng thơm hấp thụ nước ngăn chặn hoạt động phân giải cellulose của enzyme. Trong thí nghiệm này, ở điều kiện sấy đông khô và sấy ở 45oC cho kết quả tốt nhất về tỉ lệ tiêu hóa DM của vi khuẩn có trong chế phẩm. 4.3.4. Kết quả CF của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm Hình 16. CF của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy NT1: 30o C, NT2: 40oC, NT3: 45oC, NT4: 50oC, NT5: 60oC, NT6: sấy đông khô Các giá trị thu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 2,62% Tập trung vào phân tích các nghiệm thức (NT) có kết quả tỉ lệ tiêu hóa CF cao nhất. Kết quả phân tích tỉ lệ tiêu hóa CF của vi khuẩn cho thấy NT3 (18,99%) và NT6 (19,56%) là tốt nhất không khác biệt về mặt ý nghĩa thống kê và cao hơn các NT còn lại. Phân tích tỉ lệ tiêu hóa DM và CF để xác định khả năng phân giải bã mía và xơ thô của vi khuẩn. Xơ thô là thành phần khó bị phân giải, nhưng trong thí nghiệm này, tỉ lệ phân giải xơ thô khá cao, chứng tỏ phương pháp sấy phù hợp sẽ giúp sản phẩm đạt chất lượng hơn. Vi sinh vật học K36 47 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.3.5. Độ ẩm của sản phẩm Bảng 7. Kết quả độ ẩm của sản phẩm với điều kiện sấy khác nhau Điều kiện sấy Độ ẩm (%) 30oC 23,30 a 40 oC 14,26 b 45 oC 13,46 b 50 oC 10,85 c Đông khô 13,71 b Các trị trung bình trong cùng một hàng có các chữ theo sau giống nhau thì khác biệt không ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Số liệu trong bảng là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 3,48% Chế phẩm cần có độ ẩm phù hợp nhất định để có thể bảo quản được thời gian lâu nhất. Chế phẩm vi sinh dạng bột khô thông thường có độ ẩm từ 11-15%. Đa số các phương pháp sấy đều cho kết quả tốt, chỉ trừ sấy ở 30oC. Kết quả cho thấy sự tương đồng ở 3 điều kiện sấy đó là sấy ở 40oC, 45 oC và sấy đông khô. Độ ẩm cao nhất khi sấy ở 30 oC, do nhiệt độ không đủ khả năng làm thoát hơi nước trong sản phẩm sau quá trình ly tâm và phối trộn. Khi sấy ở 50oC sản phẩm có độ ẩm thấp nhất. Enzyme cellulase bị tác động bởi nhiệt, khi nhiệt độ càng cao hoạt tính enzyme càng giảm, vì vậy nhiệt độ sấy phun phải đảm bảo được khả năng làm khô nhanh chế phẩm cũng như không quá cao gây ảnh hưởng đến chất lượng của sản phẩm. Trong thí nghiệm này, kết hợp với kết quả mật khảo sát mật số và đường kính vòng halo, tỉ lệ tiêu hóa DM, CF, nghiệm thức sấy ở 45oC được chọn vì lí do sử dụng thiết bị không phức tạp, ít tốn kém về chi phí, cũng như đơn giản hóa giai đoạn tạo thành phẩm. Vi sinh vật học K36 48 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.4. Khảo sát điều kiện bảo quản 4.4.1. Mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm Bảng 8. Mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm ứng với từng thời gian và nhiệt độ bảo quản khác nhau Nhiệt độ (oC) -20 0 4 30 CV% Ngày 1 5,29 c 7,83 b 9,28 a 9,19 a 1,07% Ngày 10 0,91 c 6,36 b 9,14 a 8,79 a 6,4% Ngày 20 0,00 d 4,38 c 9,08 a 7,49 b 5,3% Ngày 30 0,00 d 1,88 c 8,87 a 6,61 b 6,6% Các trị trung bình trong cùng một cột có các chữ theo sau giống nhau thì khác biệt không ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Đơn vị Log (CFU/g) Mật số vi khuẩn giảm theo số ngày tăng, trong đó giảm nhanh nhất khi giữ sản phẩm ở -20oC. Ở nhiệt độ lạnh khi đem ra ngoài nhiệt độ bình thường để sử dụng, nhiệt độ thay đổi đột ngột gây sốc nhiệt làm vỡ tế bào vi khuẩn, tương tự như vậy ở 0oC, trong 10 ngày đầu, sản phẩm giữ ở -20 oC đã giảm mật số một cách rõ rệt, giảm nhanh và nhiều hơn so với sản phẩm giữ ở 0oC. Sản phẩm bảo quản ở 4oC và 30oC cho kết quả mật số tốt trong 10 ngày đầu sau đó ở nhiệt độ 30 oC mật số vi khuẩn có dấu hiệu giảm dần, không đạt hiệu quả như 4oC. Sau 30 ngày kiểm tra, mật số vi khuẩn khi bảo quản ở 4 oC là 8,87 log (CFU/g), ở 30oC là 6,61 log (CFU/g). Vi khuẩn khi ở nhiệt độ bình thường sẽ tiếp tục phát triển vì thế theo thời gian mật số sẽ giảm dần, cùng với một số yếu tố khách quan như sản phẩm không được giữ ở điều kiện hút chân không, điều kiện bảo quản không tốt,… dẫn đến sự thay đổi mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm. Giữ sản phẩm ở nhiệt độ 4 oC là điều kiện bảo quản tốt nhất, sản phẩm đảm bảo về mật số sau 30 ngày kiểm tra. Vi sinh vật học K36 49 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.4.2. Đường kính vòng halo của vi khuẩn có trong chế phẩm Bảng 9. Đường kính vòng halo phân giải BM của chế phẩm bột VK tương ứng với từng thời gian và nhiệt độ bảo quản khác nhau Nhiệt độ (oC) -20 0 4 30 CV% Ngày 1 17,17 c 19,00 b 20,83 a 20,50 a 2,1% Ngày 10 0,00 c 16,50 b 20,17 a 19,50 a 2,7% Ngày 20 0,00 c 0,00 c 19,83 a 18,83 b 4,2% Ngày 30 0,00 c 0,00 c 19,00 a 18,17 b 1,6% Các trị trung bình trong cùng một cột có các chữ theo sau giống nhau thì khác biệt không ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Đơn vị %. Kết quả cho thấy ở nhiệt độ -20oC sau 10 ngày sản phẩm đem thử khả năng tạo vòng halo đã không cho kết quả. Đối với với nhiệt độ 0oC, sau 20 ngày sản phẩm cũng không có khả năng tạo vòng halo. Trong khi đó, sản phẩm giữ ở 4oC và 30 oC vẫn cho khả năng tạo vòng halo tốt ở 10 ngày đầu và sau 20 ngày. Khi giữ sản phẩm ở 30oC và 4oC sau 30 ngày, đường kính vòng halo giảm theo thời gian nhưng không khác biệt đáng kể, với khả năng tạo vòng halo lần lượt là 18,17; 19 mm. Hiệu quả tạo vòng halo trên cơ chất bã mía mang tính chất định tính về khả năng sinh enzyme cellulase để phân giải bã mía của vi khuẩn, vì vậy cần kết hợp thêm những chỉ tiêu khác để khẳng định nhiệt độ bảo quản phù hợp nhất. Vi sinh vật học K36 50 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.4.3. Kết quả DM và CF của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm Bảng 10. DM và CF bã mía sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng thời gian và nhiệt độ bảo quản khác nhau. Ngày 1 Nhiệt độ -20 0 4 BT CV% Ngày 10 Ngày 20 Ngày 30 DM CF DM CF DM CF DM CF 5,37 c 11,72 b 16,15 a 15,90 a 1,5% 10,51 d 16,77 c 21,42 a 20,83 b 1,1% 1,98 d 8,44 c 15,86 a 12,18 b 2,6% 7,10 d 13,78 c 21,19 a 17,25 b 2,9% 1,49 d 4,77 c 15,30 a 10,62 b 3,3% 5,52 d 10,20 c 20,24 a 16,19 b 2,3% 1,31 d 2,11 c 14,81a 7,64 b 1,3% 6,13 d 7,24 c 19,57 a 12,94 b 1,8% Các trị trung bình trong cùng một cột có các chữ theo sau giống nhau thì khác biệt không ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Đơn vị % Kết quả khảo sát tỉ lệ tiêu hóa DM và CF cho thấy chế phẩm bảo quản ở -20 oC cho kết quả thấp vào ngày đầu kiểm tra, tiếp đến là 0oC. Cao nhất là sản phẩm giữ ở 4oC và 30 oC. Sau 10 ngày, kết quả ở -20 oC và 0oC giảm rõ rệt, và ở 30 oC tỉ lệ tiêu hóa DM và CF cũng bắt đầu giảm. Ở 4 oC vẫn cho kết quả tốt nhất và duy trì đến 20 ngày, 30 ngày. Trong khi đó sản phẩm giữ ở các mức nhiệt khác vẫn liên tục giảm. Khi giữ ở nhiệt độ quá thấp, tế bào vi khuẩn bị đông lại, lượng nước trong tế bào tăng lên, khi sản phẩm đem ra nhiệt độ bình thường và cho vào môi trường nuôi cấy để khảo sát, môi trường thay đổi làm cho vách tế bào bị vỡ ra, ảnh hưởng đến mật số cũng như làm giảm khả năng phân hủy bã mía, xơ thô. Khi giữ sản phẩm ở nhiệt độ bình thường nếu điều kiện bảo quản không tốt cũng gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm. Bảo quản ở 4oC là nhiệt độ thích hợp nhất để giữ sản phẩm đạt chất lượng tốt trong điều kiện thí nghiệm là 30 ngày, với kết quả tỉ lệ DM giảm đi 14,8% (m/m) và CF giảm đi là 19,57% (m/m). Thí nghiệm khảo sát nhiệt độ bảo quản sản phẩm xác định điều kiện phù hợp để giữ chất lượng sản phẩm được hiệu quả nhất, nhưng với những yếu tố khách quan vẫn xưa xác định được một cách rõ ràng nhất các nhiệt độ cũng như điều kiện bảo quản khác nhau, một trong những yếu tố đó là tác động của nhiệt độ môi trường sử dụng để kiểm tra chế phẩm, vật liệu sử dụng để chứa đựng, thường xuyên lấy sản phẩm kiểm tra, mất điện khi trong quá trình giữ lạnh,… Vì vậy, kết quả chỉ phù hợp trong điều kiện thí nghiệm, cần có những kiểm tra khác cũng như cải tiến phương pháp để có thể giữ sản phẩm trong điều kiện bình thường, đỡ tốn kém về chi phí cho việc bảo quản mà vẫn giữ được chất lượng sản phẩm. Vi sinh vật học K36 51 Viện NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT 4.4.4. Độ ẩm của sản phẩm Bảng 11. Kết quả độ ẩm của chế phẩm bột vi khuẩn với nhiệt độ và thời gian khác nhau Nhiệt độ (oC) -20 0 4 30 CV% Ngày 1 15,76 a 15,96 a 15,87 a 14,17 b 3,07% Ngày 10 15,99 a 16,47 a 15,99 a 14,37 b 3,24% Ngày 20 16,11 a 16,26 a 16,05 a 15,28 b 2,29% Ngày 30 16,09 a 16,34 a 16,12 a 16,41 a 2,16% Các trị trung bình trong cùng một cột có các chữ theo sau giống nhau thì khác biệt không ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Đơn vị % Nhìn chung, độ ẩm của sản phẩm ứng với thời gian và nhiệt độ bảo quản khác nhau giữ ổn định ở mức [...]... Hình 13 Mật số vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy 44 Hình 14 Đường kính vòng halo phân giải BM của vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy 45 Hình 15 DM của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy 46 Hình 16 CF của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng điều kiện sấy ... cứu ly trích emzyme từ vi khuẩn phân giải cellulose và sử dụng chúng để sản xuất nhiên liệu sinh học làm tăng hiệu quả kinh tế cũng như góp phần trong công cuộc bảo vệ môi trường Vi sinh vật học K36 1 Vi n NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Vì thế, đề tài Khảo sát một số điều kiện để tạo chế phẩm bột vi khuẩn Bacillus subtilis S20 được tiến hành 1.2... thích hợp, điều kiện sấy và nhiệt độ bảo quản tối ưu để tạo chế phẩm bột Bacillus subtilis S20 Vi sinh vật học K36 2 Vi n NC & PT Công nghệ sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về vi khuẩn Bacillus subtilis 2.1.1 Lịch sử phát hiện và phân loại Bacillus subtilis được Christion phát hiện đầu tiên vào năm 1835 và tên của loài vi khuẩn này... hóa điều kiện sinh tổng hợp cellulase Ngoài ra, Immanuel et al (2006) nghiên cứu được rằng dòng vi khuẩn họ Bacillus sinh tổng hợp enzyme cellulase tối ưu ở pH trung tính Bacillus subtilis có khả năng sinh tổng hợp cellulase tối ưu ở 40oC (Mohamed et al., 2010) 2.1.4 Vi khuẩn Bacillus subtilis S20 Dòng vi khuẩn Bacillus subtilis S20 đã được Đỗ Thị Cẩm Hường (2012) phân lập từ dạ cỏ bò cũng như khảo sát. .. khả năng sử dụng như nguồn chế phẩm vi sinh ứng dụng trong chăn nuôi Nguyễn Thị Hồng Hà (2003) đã sử dụng hai chủng vi khuẩn Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm vi sinh, bước đầu đã nghiên cứu được công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức 10 6 CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella Nguyễn Thùy... được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từ nước bắp cải muối chua và đã xác định được rằng chủng vi khuẩn này có tính chất chế phẩm vi sinh và có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng dung dịch (từ vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 108 CFU/ml có tác dụng cải thiện môi trường nước nuôi tôm, cá Lê Tấn Hưng và Võ Thị Hồng Hạnh (2003) đã nghiên cứu sản xuất hai chế phẩm chế phẩm vi sinh... phân lập thành công B subtilis thuần khiết Sau đó, B subtilis mới dùng để điều trị các chứng vi m ruột, vi m đại tràng, chống tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh hoặc do loạn khuẩn gây ra với tên gọi là Subtilis therapie” (điều trị bằng subtilis) B subtilis có vai trò lớn trong vi c giữ ổn định hệ vi sinh đường ruột bằng cơ chế cạnh tranh sinh tồn và khả năng gây ức chế các vi khuẩn gây bệnh ở đường... Hình 4 Một số thiết bị thí nghiệm 24 Hình 5 Mật số vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng loại đường 32 Hình 6 Đường kính vòng halo phân giải BM của vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng loại đường 34 Hình 7 DM của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm ứng với từng loại đường 35 Hình 8 CF của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương... Đại học khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT những loài vi sinh vật khác để tìm kiếm dinh dưỡng Tính ổn định cao của B subtilis trong điều kiện môi trường khắc nghiệt làm cho nó trở thành một trong những loài vi sinh vật được ứng dụng làm chế phẩm sinh học nhiều nhất hiện nay Theo Nakano và Zuber (1998) thì Bacillus subtilis là vi khuẩn hình que, gram dương Bacillus subtilis được phân lập từ dạ cỏ trâu bò (Mikrobiol,... tiến hành phân lập và khảo sát hoạt tính phân giải cellulose của vi sinh vật từ dạ cỏ động vật nhai lại như bò, cừu và dê Kết quả phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải cellulose như P eruginosa, Streptococcus, Bacillus, Penicillin, Aspergillus, Mucor và Fusarium Vi c sử dụng thực phẩm có chế phẩm vi sinh (hoặc như 1 thành phần tự nhiên của thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được