trộn
Mục đích thí nghiệm: khảo sát sựảnh hưởng của một loại đường khi phối trộn
để làm chế phẩm bột vi khuẩn.
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, với là 6 loại đường: Galactose, Glucose, Lactose, Mannose, Mannitol, Fructose với nghiệm thức đối chứng, 3 lần lặp lại. Tổng sốđơn vị thí nghiệm là 21 nghiệm thức (NT)
Tiến hành thí nghiệm:
- Giống: vi khuẩn BM21.
- Tạo sinh khối vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn (108 tb/ml) vào 200 ml môi
trường lỏng, ủ trong bình kỵ khí ở 38oC trong 3 ngày để đạt được mật số 108 tb/ml (Nguyễn Thanh Son, 2013).
- Thu sinh khối: Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ
- Phối trộn: Cho 1 gram đường vào phần cặn đã thu được, trộn đều (tỉ lệ 50%
đường + 50% hỗn hợp bã mía và vi khuẩn).
- Sấy khô sản phẩm ở 40oC trong 24h - Đánh giá chế phẩm:
+ Khảo sát mật số vi khuẩn có trong chế phẩm. Hòa 0,1g chế phẩm vào 10ml
nước muối sinh lý, pha loãng và đếm mật số.
+ Khảo sát khảnăng tạo vòng halo của của chế phẩm:
Nguyên tắc: Congo Red có khả năng tạo liên kết với cầu nối β 1-4 glucosid trên cellulose tạo màu đỏ trên bề mặt môi trường sau khi nhuộm.
Tiến hành: Sử dụng phần dịch hòa tan chế phẩm đểđếm mật số. Rút 15µl cho vào mỗi lỗ đục (đường kính 5mm) trên môi trường đĩa thạch với cơ chất là bã mía. Phần còn lại sử dụng cho các thí nghiệm phân tích xơ (DM, CF). Đem mẫu đĩa thạch ủ
sau 48 tiếng nhuộm với Congo Red 1% (w/v). Đường kínhphân giải bã mía được tính:
Đường kínhphân giải bã mía = Đường kính vòng halo – đường kính đục lỗ
+ Khảo sát khả năng phân giải bã mía của chế phẩm dựa vào phần trăm vật chất khô (DM). Mẫu thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Nguyên tắc: sấy khô mẫu ở 70oC cho lượng nước mất đi, phần còn lại là chất khô hoàn toàn của mẫu.
Tiến hành: Sấy bã mía ở 70oC trong 48 giờ, làm nguội mẫu trong bình hút ẩm về nhiệt độ thấp hơn (40oC). Cân trọng lượng nguyên liệu bằng cân phân tích.
+ Khảo sát khảnăng phân giải bã mía của chế phẩm dựa vào phần trăm xơ thô
(CF). Mẫu thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
Nguyên tắc: Bột bã mía xử lý lần lượt bằng dung dịch acid sulfuric và hydroxide loãng. Acid sulfuric phân giải các chất hòa tan trong acid như cacbohydrat
thành đường đơn và một phần protein hòa tan. Ngoài ra, acid và kiềm có thể hòa tan
được một phần chất khoáng. Sau khi xửlý đem nung ở nhiệt độ cao trọng lượng mất đi
Tiến hành: Bã mía sau khi xử lý bằng dung dịch H2SO4 1,25% (v/v) và NaOH
1,25% (v/v); sau đó được tro hóa ở 600oC trong 3 giờ. Phần trăm xơ thô (CF) được
tính theo công thức sau:
+ Kiểm tra độ ẩm của chế phẩm bằng cách cân 0,5g chế phẩm bằng cân phân
tích, sau đó sấy đến trọng lượng không đổi ở 70oC, cân trọng lượng sau để tính ra %
độ ẩm.
Chỉ tiêu theo dõi:
Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm.
Định tính khả năng phân giải bã mía của chế phẩm bằng phương pháp đo đường kính vòng halo.
Phần trăm vật chất khô (DM) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích hàm lượng vật chất khô.
Hàm lượng xơ thô (CF) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng
phương pháp phân tích xơ thô.
Phần trăm ẩm độ của chế phẩm.
3.2.2.Thí nghiệm 2: Khảo sát nồng độ đường
Mục đích thí nghiệm: Xác định nồng độ đường tối ưu để làm chế phẩm đạt
được hiệu quả tốt nhất.
Bố trí thí nghiệm: Hoàn toàn ngẫu nhiên, 6 nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mẫu
đường thu được từ thí nghiệm 1.
Nguyên liệu:
+ Loại đường phù hợp được tuyển chọn từ TN1.
Tiến hành thí nghiệm:
+ Tạo sinh khối vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn (108 tb/ml) vào 200 ml môi
trường lỏng, ủ trong bình kỵ khí ở 38oC trong 3 ngày để đạt được mật số 108 tb/ml (Nguyễn Thanh Son, 2013).
+ Ly tâm dịch nuôi cấy (7000 vòng/phút trong 20 phút).
Phối trộn đường với cặn ly tâm bao gồm vi khuẩn và bã mía (đơn vị m/m) theo tỉ lệ lần lượt là:
100% bã mía và vi khuẩn
75% bã mía và vi khuẩn + 25% Lactose (tỉ lệ 3-1)
67,7% bã mía và vi khuẩn + 33,3% Lactose (tỉ lệ 2-1)
50% bã mía và vi khuẩn + 50% Lactose (tỉ lệ 1-1)
33,3% bã mía và vi khuẩn + 67,7% Lactose (tỉ lệ 1-2)
25% bã mía và vi khuẩn + 75% Lactose (tỉ lệ 1-3)
+ Sấy khô sản phẩm ở 40oC cho đến khi mẫu được đông khô thành dạng bột.
Chỉ tiêu theo dõi:
Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm.
Định tính khả năng phân giải bã mía của chế phẩm bằng phương pháp đo đường kính vòng halo.
Phần trăm vật chất khô (DM) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích hàm lượng vật chất khô.
Hàm lượng xơ thô (CF) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng
phương pháp phân tích xơ thô.
3.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát một sốđiều kiện nhiệt độ sấy khô sản phẩm Mục đích thí nghiệm: Khảo sát điều kiện và nhiệt độ phù hợp để sấy khô sản phẩm đạt hiệu quả và ít tốn kém nhất.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 3 lần lặp lại.
Nguyên liệu: Bột vi khuẩn.
Tiến hành thí nghiệm:
- Tạo sinh khối vi khuẩn: Chủng 1% dịch vi khuẩn (108 tb/ml) vào 100 ml môi
trường lỏng, ủ trong bình kỵ khí ở 38oC trong 3 ngày đểđạt được mật số 108 tb/ml. - Thu sinh khối: Ly tâm dịch vi khuẩn 7000 vòng/phút trong 20 phút, loại bỏ
dịch trong để thu lấy phần cặn gồm hỗn hợp vi khuẩn và bã mía.
- Phối trộn: Loại đường được tuyển chọn từ TN1. Theo nồng độ có kết quả khảo sát tốt nhất ở TN2.
- Sấy khô sản phẩm ở 40oC cho đến khi mẫu được đông khô thành dạng bột. - Trữ mẫu trong túi nhựa PP.
- Sử dụng những phương pháp sấy khác nhau như đểở nhiệt độ phòng (30oC), sấy bằng nhiệt (40, 45, 50, 60oC), sấy đông khôđể tiếp tục kiểm tra các chỉ tiêu.
Chỉ tiêu theo dõi:
Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm.
Định tính khả năng phân giải bã mía của chế phẩm bằng phương pháp đo đường kính vòng halo.
Phần trăm vật chất khô (DM) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích hàm lượng vật chất khô.
Hàm lượng xơ thô (CF) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng
phương pháp phân tích xơ thô.
3.2.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát nhiệt độ bảo quản sản phẩm
Mục đích thí nghiệm: Khảo sát nhiệt độ phù hợp để bảo quản chế phẩm tốt nhất theo thời gian.
Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 nghiệm thức (-20oC, 0oC, 4oC, nhiệt độ phòng (30oC)), 3 lần lặp lại.
Nguyên liệu: Bột vi khuẩn
Tiến hành thí nghiệm:
- Tạo sinh khối, thu sinh khối và phối trộn như các thí nghiệm 3. Sấy mẫu bằng
phương pháp và nhiệt độ tối ưu ở thí nghiệm 3. Trữ mẫu trong túi nhựa PP.
- Lấy bột vi khuẩn bảo quản ở nhiệt độ: -20oC, 0oC, 4oC, nhiệt độ phòng sau đó
kiểm tra định kỳ
Chỉ tiêu theo dõi:
Mật số vi khuẩn có trong chế phẩm.
Định tính khả năng phân giải bã mía của chế phẩm bằng phương pháp đo đường kính vòng halo.
Phần trăm vật chất khô (DM) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng phương pháp phân tích hàm lượng vật chất khô.
Hàm lượng xơ thô (CF) trong mẫu bã mía có sử sụng chế phẩm bằng
phương pháp phân tích xơ thô.
Phần trăm ẩm độ của chế phẩm.
3.3. Xử lý số liệu
Số liệu thô được xỷ lý bằng bảng Microsoft Execl 2003 và phân tích phương sai
CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN
4.1. Ảnh hưởng của một số loạiđường
4.1.1. Mật số của vi khuẩn có trong chế phẩm
Hình 5. Mật số vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng loại đường
NT1: ĐC (không trộn đường), NT2: Galactose, NT3: Glucose, NT4: Lactose, NT5: Mannose, NT6: Mannitol, NT7: Fructose
Ghi chú: Các giá trịthu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. % CV = 3,66 %
Khảo sát mật số của vi khuẩn BM21 trong chế phẩm với các nghiệm thức ứng với từng loại đường khác nhau lần lượt là Galactose, Glucose, Lactose, Mannose, Mannitol, Fructose và nghiệm thức đối chứng không phối trộn đường. Kết quả cho thấy mật số đạt cao nhất khi phối trộn với Lactose và Mannitol (NT4, NT6), mật số
giảm khi phối trộn với Galactose và Glucose (NT2, NT3), trong khi đó sử dụng Mannose và Fructose (NT5, NT7) cho mật số khá thấp 6,45-6,15 log(CFU/g) và riêng Fructose (NT7) cho kết quả thấp gần với đối chứng (NT1) 5,69 log(CFU/g) .
Sử dụng Fructose không hiệu quả cho việc tạo chế phẩm vì Fructose có cấu trúc tinh thểkhá to, tương tựnhư vậy với đường Mannose tuy không có cấu trúc tinh thể to
như Fructose nhưng lại dễ bị chảy, hai loại đường này có chung đặc điểm là rất dễ bị
có cấu trúc dạng bột mịn, đường Lactose và Mannitol cho kết quả cao nhất, hai loại
đường này có chung đặc điểm là có tính hút ẩm tốt khi đó khả năng đảm bảo cho vi khuẩn sống sót trong chế phẩm khá cao, cảhai đều tạo kết dính tốt với hỗn hợp bã mía và vi khuẩn, khi phối trộn dễ tạo thành hỗn hợp đồng nhất. Cảhai đều cho kết quả cao
tương đương nhau 8,52-8,53 log (CFU/g) và cao khác biệt hơn hai loại đường Galactose và Glucose 7,29-6,64 log (CFU/g).
Chế phẩm Bioche dạng dung dịch của Nguyễn La Anh (2003) đạt mật số vi khuẩn là 108 CFU/ml, một số chế phẩm dạng dung dịch khác như VEM-K, BIO-HR thành phần bao gồm Bacillus ssp mật số tối đa là 106 CFU/ml, trong khi đó mật số của vi khuẩn sau thí nghiệm của NT4 và NT6 đều cao hơn 108 CFU/g chứng tỏ sử dụng
đường (Lactose, Mannitol) mang lại hiệu quả tốt trong việc bảo đảm mật số vi khuẩn sau thành phẩm.
Kết quả mật số của vi khuẩn BM21 thấp hơn so với Nguyễn Thanh Son (2013)
làm trong điều kiện in vitro, điều này có thể lý giải do trong quá trình ly tâm, thu sinh khối, phối trộn đường đã làm thay đổi môi trường của vi khuẩn do đó mật số giảm đi
một phần. Theo Nguyễn Lân Dũng (2007) có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến sự sinh
trưởng và phát triển của vi sinh vật. Khi vi sinh vật có đủđiều kiện dinh dưỡng để sinh
trưởng mạnh mẽ thì cũng đồng thời sinh ra các chất thải có hại và làm hạn chế sự sinh
4.1.2. Đường kính vòng halo của vi khuẩn trong chế phẩm
Hình 6. Đường kính vòng halo phân giải BM của vi khuẩn trong chế phẩm tương ứng với từng loại đường
NT1: ĐC (không trộn đường), NT2: Galactose, NT3: Glucose, NT4: Lactose, NT5: Mannose, NT6: Mannitol, NT7: Fructose
Các giá trịthu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 3,72%
Kết quả khảo sát định tính khả năng phân giải bã mía bằng phương pháp đo đường kính vòng halo trên đĩa thạch, có cơ chất là bã mía của chế phẩm vi khuẩn với những loại đường khác nhau, đối chứng không có vi khuẩn (Hình 6). Biểu đồ cho thấy khả năng phân giải bã mía của vi khuẩn khi được phối trộn với Mannitol, Lactose, Galactose (NT6, NT4, NT2) là tương đương nhau 19,7-19,2-18,4 (mm) và cao hơn so
với các nghiệm thức còn lại, trong đó kết quả sử dụng Galactose tương đồng với sử
dụng Glucose (NT3) 17,8 (mm). Sử dụng đường Mannose (NT5) cho kết quả tương đồng như khi sử dụng Glucose và Fructose (NT7). Trong khi đó, sử dụng Fructose kết quả đạt thấp nhất trong các nghiệm thức có sử dụng đường và gần bằng với nghiệm thức đối chứng (NT1) 16mm. Theo Lj-Jung et al. (2010) ủ dịch enzyme cellulase với
cơ chất cellulose là cách để xác định hoạt tính enzyme exoglucanases trong phức hệ
không cao, điều này có thể giải thích là các loại đường trên khi sử dụng làm chất mang không ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính enzyme exoglucanases của vi khuẩn.
4.1.3. Kết quả DM của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm
Hình 7. DM của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng loại đường
NT1: ĐC (không trộn đường), NT2: Galactose, NT3: Glucose, NT4: Lactose, NT5: Mannose, NT6: Mannitol, NT7: Fructose
Các giá trịthu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 1,45%
Ở NT1 (ĐC) sử dụng vi khuẩn nhưng không phối trộn đường kết quả thấp hơn
các nghiệm thức có phối trộn đường vì vi khuẩn khi sấy khô làm sản phẩm gặp môi
trường thay đổi bất lợi mật số giảm đi dẫn đến khảnăng phân giải bã mía giảm. Khi sử
dụng Fructose (NT7) có kết quả tỉ lệ %DM giảm đi là 7,89%, thấp nhất trong các nghiệm thức sử dụng đường khác, Fructose ở dạng tinh thể hạt to, dễ bị chảy làm thay
đổi hình dạng ban đầu vì vậy khi gặp vi khuẩn và bã mía sau khi ly tâm bỏ dịch vẫn còn độ ẩm tương đối cao làm cho đường chảy ra, khi sấy khô đường lại bị vón cục
không đồng nhất với hỗn hợp bã mía, vi khuẩn vì thế khả năng bảo quản sản phẩm kém. Các nghiệm thức sử dụng Glucose (NT3), Mannose (NT5) cũng cho kết quả
không cao (NT3) 9,27%, (NT5) 9,35%, tuy cả hai ở dạng tinh thể dạng hạt nhỏnhưng
với tính chất dễ bị chảy khi gặp ẩm khi sấy khô không giữ được trạng thái ban đầu, không tạo được hỗn hợp đồng nhất nên tính bảo quản kém làm mật số vi khuẩn thấp, khảnăng phân giải bã mía và lượng xơ thô thấp. Kết quả khi sử dụng Lactose (NT4) và Mannitol (NT6) đạt kết quả cao nhất, tỉ lệ DM giảm đi khá cao (NT4) 13,41%, (NT6) 13,56%, chứng tỏ hai loại đường này có khả năng bảo quản chế phẩm tốt. Cả
hai loại đường này đều có dạng bột mịn, có khảnăng giữẩm, dễ hấp thu nước, khi sấy cùng nhiệt độ với các nghiệm thức sử dụng các loại đường khác không dễ bị làm khô, mặt khác đường Galactose (NT2) cũng có những tính chất như dạng bột mịn, dễ hấp
thu nước và giữ ẩm, nhưng khi sấy lại dễ bị làm khô bởi nhiệt, làm sản phẩm bị khô cứng lại.
Tỉ lệ phân giải DM là chỉ tiêu quan trọng để dánh giá khảnăng phân giải bã mía của vi khuẩn. Kết quả DM trong thí nghiệm cao phù hợp với yêu cầu về mặt chất
lượng của sản phẩm. Tuy nhiên, loại bã mía cũng ảnh hưởng đến kết quả DM, trong thí nghiệm này, bã mía được sử dụng là bã mía mịn (đường kính < 0,1mm) có thể làm chỉ số DM giảm đi cao, vì thế cần kết hợp những yếu tố khác để chọn ra loại đường phù hợp nhất để phối trộn.
Như vậy cả hai loại đường Lactose và Mannitose đều có thể sử dụng để phối trộn phù hợp cho chế phẩm bột vi khuẩn trong điều kiện thí nghiệm trên.
4.1.4. Kết quả CF của bã mía sau khi sử dụng chế phẩm
Sau khi kiểm tra DM 0,5g bã mía được sử dụng tiếp để kiểm tra tỉ lệ tiêu hóa CF bằng dung dịch acid và hydroxit loãng.
Hình 8. CF của bã mía được phân giải sau khi sử dụng chế phẩm tương ứng với từng loại đường
NT1: ĐC (không trộn đường), NT2: Galactose, NT3: Glucose, NT4: Lactose, NT5: Mannose, NT6: Mannitol, NT7: Fructose
Các giá trịthu được đều được xử lý thống kê để xem sự khác biệt có ý nghĩa với mức độ tin cậy 95%. Số liệu trong biểu đồ là giá trị của 3 lần lặp lại. % CV = 2,14%
Các nghiệm thức (NT) NT4 (17,16%) và NT6 (17,70%) cho kết quả phân giải
xơ thô cao nhất, không khác về mặt ý nghĩa thống kê và tốt hơn các NT còn lại. Xơ thô