2.8.1. Tình hình nghiên cứu trong nước
Ở nước ta hiện nay, việc nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh phục vụcho đời sống dân sinh nói chung và chăn nuôi nói riêng còn rất mới mẻ và bắt đầu được quan tâm trong khoảng một thập kỷ gần đây.
Lê Thanh Bình (1999) đã sản xuất chế phẩm PRO99 gồm hai chủng vi khuẩn lactic và nuôi thử nghiệm trên gà Broiler cho thấy quần thể vi sinh vật đường ruột thay
đổi theo chiều hướng tích cực, các vi khuẩn lactic tăng, E.coli giảm rõ rệt ở nhóm gà
được ăn thức ăn có thức ăn bổ sung chế phẩm PRO99. Khối lượng cơ thể lúc 50 ngày tuổi của gà ở nhóm được ăn thức ăn có bổ sung PRO99 cao hơn so với đối chứng 10,6%.
Phạm Ngọc Lan (2003) đã phân lập được hai trong số 789 chủng vi khuẩn lactic trong ruột gà. Bằng các phương pháp nghiên cứu sinh học phân tử, nhóm tác giả đã
xác định được các chủng CH123 và CH156 có những tính chất chế phẩm vi sinh gần với Lactobacillus agillis và Lactobacillus salivarius (có khả năng đềkháng được với 40% acid mật; sinh trưởng được ở môi trường pH = 4,0 và nồng độ NaCl = 6%, có hoạt tính kháng với Salmonella, E.coli) có khả năng sử dụng như nguồn chế phẩm vi sinh ứng dụng trong chăn nuôi.
Nguyễn Thị Hồng Hà (2003) đã sử dụng hai chủng vi khuẩn Bifidobacterium bifidum và Lactobacillus acidophilus để sản xuất chế phẩm vi sinh, bước đầu đã nghiên cứu được công nghệ sản xuất bằng phương pháp sấy phun. Chế phẩm sau 6 tháng vẫn có số tế bào vi khuẩn sống ở mức 106 CFU/g và có khả năng ức chế vi khuẩn Salmonella.
Nguyễn Thùy Châu (2003) thông báo đã lựa chọn được chủng nấm men
Candida ultilis CM125 cho sinh khối cao trên môi trường rỉ mật, bước đầu đã đưa ra
quy trình công nghệ sản xuất sinh khối loại nấm men này.
Nguyễn La Anh (2003) đã phân lập được chủng vi khuẩn lactic BC 5.1 từnước bắp cải muối chua và đã xác định được rằng chủng vi khuẩn này có tính chất chế phẩm vi sinh và có thể sử dụng trong chế biến thực phẩm Biochie dạng dung dịch (từ vi khuẩn Bacillus và Lactobacillus) với mật độ 108 CFU/ml có tác dụng cải thiện môi
trường nước nuôi tôm, cá.
Lê Tấn Hưng và Võ Thị Hồng Hạnh (2003) đã nghiên cứu sản xuất hai chế
phẩm chế phẩm vi sinh BIO I và BIO II. Chế phẩm BIO II gồm các nhóm vi khuẩn
Lactobacillus, Bacillus và nấm men Sacharomyces phối hợp với các enzyme amylase và protease dùng trong xử lý môi trường nước nuôi tôm, cá và chế phẩm BIO I dùng
trong chăn nuôi. Hiện nay chế phẩm BIO II đã được ứng dụng rộng rãi nhưng chế
phẩm BIO I hiệu quả sử dụng chưa cao.
2.8.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Ray et al. (2007) tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp cellulase bởi 2 dòng vi khuẩn phân lập từ ruột cá Bacillus subtillis và Bacillius circulans. Taled et al. (2009) nghiên cứu các yếu tố sinh dưỡng và môi trường sinh dưỡng lên quá trình sinh tổng
hợp cellulase của 2 dòng vi khuẩn Bacillus alcalophillus S39 và Bacillus amyloliquefaciens C2. Kết quả khảo sát cho thấy CMC 1% và yeast extract 0,7% được
dùng như nguồn carbon và nitrogen hiệu quả nhất. pH 7 ở nhiệt độ 30 và 45oC là tối
ưu cho sựsinh trưởng và sinh tổng hợp cellulase của 2 dòng vi khuẩn này.
Abou-Taleb et al. (2009), khảo sát ảnh hưởng của các nhân tố sinh dưỡng và
môi trường đến sản xuất cellulose của 2 dòng vi khuẩn Bacillus alcalophilus S39 và
Bacillus amyloliquefaciens C23 phân giải cellulose. Xác định được rằng 1% CMC và
0.7% yeast là hàm lượng cung cấp carbon, nitơ và 3% vi khuẩn chủng vào ởđiều kiện pH 7 là thích hợp nhất đê sản xuất cellulase của 2 dòng vi khuẩn này.
Oyeleke và Okusanmi (2008), đã tiến hành phân lập và khảo sát hoạt tính phân giải cellulose của vi sinh vật từ dạ cỏ động vật nhai lại như bò, cừu và dê. Kết quả
phân lập được một số dòng vi khuẩn có khảnăng phân giải cellulose như P. eruginosa,
Streptococcus, Bacillus,Penicillin, Aspergillus, Mucor và Fusarium.
Việc sử dụng thực phẩm có chế phẩm vi sinh (hoặc như 1 thành phần tự nhiên của thực phẩm hoặc thực phẩm đã lên men) đã được biết đến từlâu, nhưng việc nghiên cứu hệ vi sinh vật đường ruột và sử dụng chế phẩm vi sinh mới thực sự phát triển từ
những năm 80 của thế kỷ 20 (Patterson et al., 2003).
Những nghiên cứu phân loại và đặc điểm của quần thể vi sinh vật đường ruột ở người và động vật được tiến hành bởi Savage (1987); Vahjen et al. (1998); Apajalahti et al. (1998); Vander Wielen et al. (2000) đã cho thấy nếu như trong ruột non của
người Bacteroides và Bifidobacterium chiếm ưu thế thì ở gà là Ruminococcus và
Streptococcus.
Bằng kỹ thuật phân tử, các nhà nghiên cứu đã chỉ ra rằng chỉ có khoảng 20 đến 50% số loài vi sinh vật đường ruột ởđộng vật được phân lập, nuôi cấy như nguồn chế
phẩm vi sinh (Patterson et al., 2003).
Zhu et al. (2002) đã sử dụng kỹ thuật phân tửđể nghiên cứu sựthay đổi cấu trúc quần thểvà đặc điểm sinh học của hệ vi sinh vật đường ruột ởđộng vật dưới tác động của chế phẩm vi sinh. Tuy nhiên, cho đến nay những nhân tố nào góp phần tạo nên một hệ vi sinh vật cân bằng hoặc làm rối loạn sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột cũng chưa được hiểu biết đầy đủ (Patterson et al., 2003).
Đã có rất nhiều nghiên cứu về vai trò của chế phẩm vi sinh đối với đời sống
động vật như tác động của chế phẩm vi sinh đối với hệ thống miễn dịch ở niêm mạc ruột (Schat và Myer, 1991); Hersbberg Mayer, (2000); đối với sự thay đổi của niêm mạc ruột non ở vật nuôi (McCracken and Lorenz, 2001).
Những ảnh hưởng có lợi của chế phẩm vi sinh thể hiện ở nhiều khía cạnh khác
nhau nhưng những hiểu biết của con người vềcơ chế tác động của chúng còn rất hạn chế. Có một số tác giả cho rằng hiệu quả của chế phẩm vi sinh trong việc ức chế sự
phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách sau: cạnh tranh chất dinh
dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi (các acid béo bay hơi, các chất giống kháng sinh...), cạnh tranh vị trí bám dính ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột (Fuller, 1989; Gibson và Fuller, 2000; Rolfe, 2009).
Trong khoảng 20 năm trở lại đây, nhờứng dụng những tiến bộ kỹ thuật trong lĩnh vực sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật giải trình tự acid nucleic trong nghiên cứu phân loại và định danh các chủng vi sinh vật, công nghệ sản xuất các sản phẩm chế phẩm vi sinh phục vụ chăn nuôi ngày càng trở nên dễ dàng và phổ biến hơn ở
nhiều nước trên thế giới.
2.9. Một số chế phẩm sinh học tiêu biểu ở nước ta
2.9.1. Chế phẩm sinh học được nghiên cứu trong phòng thí nghiệm.
BIO-I (dùng trong chăn nuôi), thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/g, Bacillus spp. 108 CFU/g, Sacchromyces spp. 107 CFU/g, amylase 300 UI/g, protease 40 UI/g. Tác dụng: Kích thích tiêu hóa cho gia súc, gia cầm, giúp tăng trọng và giảm tiêu tốn thức ăn. Giảm các chứng rối loạn tiêu hóa và tiêu chảy.
BIO-SUPER (dùng trong chăn nuôi), thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/g, Bacillus spp. 109 CFU/g, Sacchromyces spp. 107 CFU/g. Tác dụng: Kích thích tiêu hóa cho gia súc, gia cầm. Giúp tăng trọng nhanh và giảm tiêu tốn thức ăn. Phòng và trị các chứng rối loạn tiêu hoá, các chứng tiêu chảy do sử dụng kháng sinh lâu dài.
VEM-K(dùng trong chăn nuôi), và VEM (nuôi trồng thuỷ sản (NTTS)). Thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/ml, Bacillus spp. 106 CFU/ ml, Sacchromyces
spp. 107 CFU/ ml, khoáng dễ tiêu. Tác dụng: Kích thích tiêu hóa, giảm tiêu tốn thức
ăn, giảm mùi hôi của phân, xử lý các chất thải hữu cơ và các khí độc trong môi trường ao nuôi, cạnh tranh, ức chế vi khuẩn gây bệnh cho tôm, cá.
BIO-HR (dùng trong chăn nuôi), thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/ml, Bacillus spp. 106 CFU/ ml, Nấm men 107 CFU/ ml. Tác dụng: Kích thích tiêu hóa, giảm tiêu tốn thức ăn, giảm mùi hôi của phân.
BIO-T (dùng trong chăn nuôi và NTTS) bao gồm Bacillus subtilis 107 CFU/g,
đạm thô 25%, protease 50 UI/g. Tác dụng: Kích thích sự thèm ăn. Giúp tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn. Giảm tỷ lệ bệnh heo, gà, tôm, cá.
BIO-G (dùng trong chăn nuôi và NTTS), thành phần gồm β-Glucan 10%,
Bacillus spp. 108 CFU/g, đạm tổng 25 %, Protease 40 UI/g, chất dẫn dụ. Kích sự thèm
ăn. Giảm tiêu hao thức ăn. Giảm tỷ lệ bệnh cho heo, gà, tôm, cá.
BIO-II (dùng trong nuôi trồng thuỷ sản) thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/g, Bacillus spp. 108 CFU/g, Sacchromyces spp. 107 CFU/g, amylase 300 UI/g, protease 50 UI/g. Có tác dụng: phân hủy thức ăn thừa và các khí thải ởđáy ao, ổn định
màu nước. Ổn định pH của nước ao. Kích thích tiêu hoá. Kìm hãm sựtăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh như các vi khuẩn nhóm Vibrio
BIO-HH (dùng trong nuôi trồng thuỷ sản) thành phần gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/g, Bacillus spp. 108 CFU/g, Sacchromyces spp. 107 CFU/g, Nitrosomonas
sp.108 CFU/g, Nitrobacter sp.108 CFU/g, amylase 800 UI/g, protease 100 UI/g. Có tác dụng: phân hủy nhanh thức ăn thừa và các khí thải ởđáy ao, ổn định màu, pH nước ao, kích thích tiêu hóa và ức chế vi sinh vật gây bệnh tôm, cá.
BIO-III (dùng trong nuôi trồng thuỷ sản) thành phần gồm Bacillus spp. 107
CFU/g, β-glucan 15%. Tác dụng: Kích thích hệ miễn dịch, tăng sức đề kháng của tôm, cá, phân hủy các chất hữu cơ dư thừa. Ức chế các vi sinh vật gây bệnh.
PB (dùng trong NTTS) bao gồm Rhodopseudomonas và Rhodospirillum 109 CFU/ml. Tác dụng: Phân giải thức ăn dư thừa, khí độc H2S, NH3 trong ao nuôi tôm, cá. Giúp cân bằng sinh thái, giảm tỉ lệ bệnh cho tôm.
BIO-H (dùng trong NTTS) Nitrosomonas sp.109 CFU/g, Nitrobacter sp.109 CFU/g, Bacillus spp. 108 CFU/g. Tác dụng: Làm giảm nồng độ NH3, nitrite, phân giải thức ăn dư thừa ởđáy ao, tạo môi trường nước sạch cho sự phát triển của thủy sản.
BIO-MN (dùng trong NTTS) bao gồm Bacillus spp. 107 CFU/g, Nitrosomonas
sp. 107 CFU/g, Nitrobacter sp. 107 CFU/g, xạ khuẩn 105 CFU/g, hữu cơ 50 %, P205 1,8-2,2 %, K20 1,0-1,5 %, Mg 0,3 %. Tác dụng: Kích thích tảo phiêu sinh có lợi, gây
màu nước. Cân bằng hệ sinh thái trong ao, ổn định màu nước. Giúp cho thủy sản phát triển tốt.
BIO-F (dùng trong trồng trọt) bao gồm Trichoderma spp. 108 CFU/g,
Streptomyces spp. 108 CFU/g, Bacillus spp. 108 CFU/g. Phòng nấm bệnh cây trồng. Phân giải các chất hữu cơ làm tăng độmùn và độ phì nhiêu của đất. Sản xuất phân hữu
cơ vi sinh từ than bùn, mùn mía, vỏ cà phê, phân chuồng, rác thải hữu cơ.
BIO-AB (dùng trong trồng trọt) bao gồm Azotobacter sp. 109 CFU/g,
Pseudomonas sp. 109 CFU/g. Cốđịnh Nitơ tự do tạo thành các hợp chất chứa nitơ, làm giàu cho đất, giảm phân bón hóa học. Phân giải các hợp chất lân không tan thành dễ
tan, giúp cây dễ dàng hấp thu. Cải tạo, làm tăng độ phì nhiêu của đất.
BIO-FA (dùng trong trồng trọt) bao gồm Trichoderma spp. 108 CFU/g.
Streptomyces spp. 106 CFU/g. Bacillus sp. 108 CFU/g. Azotobacter sp. 107 CFU/g.
Pseudomonas sp. 108 CFU/g. Tăng cường hệ vi sinh vật có ích trong đất, cải tạo đất,
thúc đẩy quá trình phân giải chất hữu cơ, cellulose, tăng độ mùn, chống thoái hóa đất. Phòng trị các nấm bệnh hại cây trồng. Cố định nitơ tự do tạo thành các hợp chất nitơ
hòa tan, làm giàu nitơ cho đất. Phân giải các hợp chất lân khó tiêu thành dễ tiêu. Sản xuất phân hữu cơ vi sinh từ than bùn, mùn mía, vỏ cà phê, phân chuồng, rác thải hữu
cơ.
BIO-BM (dùng trong trồng trọt) bao gồm Beauveria bassiana ≥ 108 CFU/g.
Metarhizium anisopliae ≥ 108 CFU/g. Đặc trị các loại sâu bệnh và côn trùng gây hại trên cây trồng như: sâu xanh, sâu tơ, sâu cuốn lá,… (thuộc bộ cánh vảy Lepidoptera); rầy nâu (thuộc bộcánh đều Homoptera), bọ trĩ, ve sầu,…
BIO-BL (dùng trong trồng trọt) bao gồm đạm thô 25%, Bacillus sp. 108 CFU/g, Azotobacter sp. 107 CFU/g, Pseudomonas sp. 107 CFU/g. Cốđịnh Nitơ tự do
tạo thành các hợp chất chứa nitơ, làm giàu cho đất, giảm phân bón hóa học. Phân giải các hợp chất lân không tan thành dễ tan, giúp cây dễ dàng hấp thu. Cải tạo, làm tăng độ phì nhiêu của đất.
BIO-HK (dùng trong xử lý môi trường) bao gồm Nitrosomonas sp.108 CFU/g,
Nitrobacter sp.108 CFU/g, Bacillus spp. 108 CFU/g, Streptomyces spp. 107 CFU/g. Xử
lý chất thải trong điều kiện hiếu khí, phân hủy các chất hữu cơ trong nước thải sinh hoạt, công nghiệp.
BIO-YK (dùng trong xử lý môi trường) bao gồm Lactobacillus spp. 108 CFU/ml, Bacillus spp. 107 CFU/ ml, Sacchromyces spp. 107 CFU/ ml, vi khuẩn quang
dưỡng 105. Xử lý chất thải trong điều kiện yếm khí, phân hủy các chất hữu cơ trong nước thải sinh hoạt, công nghiệp.
BIO-D (Bột thông cầu và xử lý môi trường) bao gồm: tổng VSV phân giải chất hữu cơ (cellulose, tinh bột, protein,…): 109 CFU/g. Phòng chống tắc nghẽn hầm cầu. Xử lý chất thải hữu cơ ở đáy ao nuôi tôm, cá. Phân hủy các chất hữu cơ trong nước thải. Giảm mùi hôi.
2.9.2. Chế phẩm sinh học trên thịtrường. Bảng 2. Các chế phẩm sinh học trên thịtrường Bảng 2. Các chế phẩm sinh học trên thịtrường
STT Tên sản phẩm Nguồn gốc Đối tượng Công ty sản xuất
1 Navet- Biozym BIO-I, BIO-II,
BIO-III
Heo, gà, tôm, cá Cty thuốc thú y Trung
Ương
2 Sonasubtyl BIO-I Gia súc, gia cầm Cty thuốc thú y Sài Gòn
3 Biozym BIO-I Heo, cá Cty THNH thuốc thú y
Long An
4 Lactizym NPV BIO-Super Gia súc, gia cầm CtyTNHH-TMSX
5 Prozym NPV BIO-I Gia súc, gia cầm Thuốc thú y NAPHA
6 Thức ăn gia
súc Cám 351
BIO-G, BIO-T Heo sau cai sữa Cty SX TĂGS Kim Long
7 EM VEM gốc Heo, gà, tôm, cá TT UDKHKT các tỉnh
phía nam
8 Mebi-lactyl
Mebi-Antibio
Bio-super Heo, gà Cty TNHH Thuốc thú y
MEBIPHA 9 Vitazym Enzym-ANV Glucan-Biotic BIO - Super BIO I BIO-III Heo, gà Heo, gà Heo, gà CtyTNHH Anvet (*Nguồn:http://www.agroviet.gov.vn/Pages/statisticreport.aspx?TabId=thongke, 24/11/2013)
CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Phương tiện nghiên cứu
3.1.1. Thiết bị, dụng cụ, hóa chất, địa điểm
Thiết bị: Tủ cấy vi sinh vật , tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), kính hiển vi olympus CHT (Nhật), máy đo OD, nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủ
sấy EHRET (Đức), máy khuấy từ (Hoa Kỳ), pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ), cân điện tử Satorius (Đức), lò vi sóng Panasonic (Thái lan), máy ly tâm, tủ lạnh -4oC Akira (Việt Nam), hệ thống phân tích xơ VELP (Ý), máy tro hóa Nabertherm (Đức), máy chụp ảnh kỹ thuật số, máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu.
Dụng cụ: Tủ cấy vi sinh vật, tủủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt Pbi-international (Ý), tủ sấy EHRET (Đức), cân điện tửSatorius (Đức), lò vi sóng Panasonic (Thái lan), máy ly tâm, tủ lạnh -20oC và tủ lạnh 4oC Akira (Việt Nam),
máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu. Eppendorf entrifuge 5417 (Đức), bộ
micropipette (Bio-Rad) P10, P20, P200, P1000 (Đức), đĩa petri, bình Erlenmeyer 500 ml, ống nghiệm 15ml (Đức) và một số dụng cụ khác như: que cấy, que thủy tinh,, cốc
đựng dung dịch, chai lọ thủy tinh, bọc nylon, đèn cồn,…
Hóa chất: Ethanol 95%, agar, H2SO4 đậm đặc, NaCl, K2HPO4, KH2PO4, (NH4)2SO4, MgSO4.7H2O, KH2PO4, n-octanol (C8H18O) octilic alcohol, acetone, Sodium hidroxide (NaOH), acetate buffer,…
Địa điểm: được thực hiện tại phòng thí nghiệm Sinh Hóa và Công nghệ
Enzyme, Hóa sinh Thực phẩm, Vi Sinh Thực phẩm và Vi sinh vật thuộc Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ. Trong khoảng thời gian: từ tháng
07/2013 đến tháng 11/2013.
3.1.2. Nguyên vật liệu
Bã mía: thu bã mía thô từ nhà máy đường Hậu Giang, sấy bã mía ở 70oC trong 30 - 45 phút, sau đó nghiền thành bột bằng máy nghiền mẫu RetschMiihle với kích
thước lỗlưới 0,1mm. Sau đó tiến hành rửa và lọc bột bã mía bằng nước lọc qua nhiều lần để loại bỏđường cũng như một số tạp chất.
Mẫu vi khuẩn: dòng vi khuẩn dạ cỏ bò BM21 cho kết quảđồng hình với dòng vi khuẩn Bacillus subtilis S20(dophòng thí nghiệm CNSH Enzyme cung cấp).
3.1.3. Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật Bảng 3. Thành phần môi trường cải tiến (M1) Bảng 3. Thành phần môi trường cải tiến (M1)
Tên hóa chất Khối lượng/Thể tích Đơn vị
Bột bã mía (NH4)2SO4 KH2PO4 K2HPO4 MgSO4.7H2O NaCl Agar Nước 10 1 1 1 0,5 0,001 20 1000 gram gram gram gram gram gram gram ml
Môi trường lỏng Ryckeboer ( 2003) cải tiến