Chọn lựa chủng vi khuẩn và tối ưu hóa điều kiện lên men axetic để sản xuất giấm trái cây

Vai trò của vi khuẩn sinh acetic acid [13]

Các ứng dụng và triển vọng sử dụng vi khuẩn sinh acetic acid - Sản xuất giấm. - Sản xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học: Đặc tính oxy hoá không hoàn toàn nhiều loại nguồn carbon khác nhau của giống Gluconobacter đặc biệt có ý nghĩa trong công nghệ sinh học và sản xuất công nghiệp. Ví dụ: sản xuất rượu Kombucha, 1 loại nước giải khát có vị hơi chua và sủi bọt được ưa thích ở Nhật Bản, Trung Quốc, An Độ và một số nước Châu Au, là quá trình.

Phân loại. [13]

Vào thời điểm này tất cả các chủng vi khuẩn có khả năng sinh acetic acid đều được định danh là giống Acetobacter, Asai đã đề nghị phân loại các chủng có khả năng tạo acetic acid từ ethanol kém nhưng oxy hoá mạnh D-glucose thành D-gluconic vào 1 nhóm phân loại mới với tên giống là Gluconobacter, các chủng có khả năng oxy hoá mạnh ethanol thành acetic acid vẫn được xác định là Acetobacter. Thuật ngữ “ Gluconoacetobacter” được dùng đầu tiên cho cấp độ phân loại giống phụ trong giống Acetobacter khi Yamada và Kondo (1984) nhận thấy thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào sinh vi khuẩn sinh acetic acid khác nhau. Các chủng có Q-10 là thành phần ubiquinone chính được phân loại trong giống phụ Gluconoacetobacter, trong khi Q-9 là thành phần ubiquinone chính trong màng tế bào Acetobacter.

Sau đó, giống phụ Gluconoacetobacter được đưa lên thành giống thứ tư trong họ Acetobacteraceae dựa vào mối quan hệ phát sinh loài khi phân tích một phần trình tự mã hoá 16S rRNA. Các loài Asaia có những đặc điểm khá khác biệt so với các giống đã biết; Không sinh acetic acid hoặc tạo thành 1 lượng rất ít từ nguồn cơ chất ethanol và hầu như bị kìm hãm phát. Giống mới Kozakia được phát hiện khi Lisdiyanti (2002) khảo sát 1 cụm phát sinh loài mới trên cây phát sinh loài của vùng trình tự 16S đối với các chủng vi khuẩn sinh acetic acid phân lập tại Indonesia.

Loganathan và Nair (2004) xác định giống Swaminathania dựa vào khả năng sinh acetic acid từ ethanol và vị trí phân loại của các chủng thuộc giống này trên cây phát sinh được xây dựng dựa vào trình tự 16S rDNA. Giống này được phân loại dựa vào đặc điểm kiểu hình cùng với kết quả phân tích trình tự vùng 16S rDNA, 16S-23S rDNA ITS và kết quả lai DNA bộ gen với loài điển hình của các chủng đã biết.

Vật liệu

MT7: Môi trường cao thịt- pepton dùng nuôi vi khuẩn Acetic để nhuộm Gram, quan sát hình dạng, kích thước tế bào. MT8: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của pH lên sự tăng trưởng của vi khuẩn Acetic. MT9: Môi trường khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự tăng trưởng của vi khuẩn Acetic.

- Nước cất bổ sung cho đủ 1000ml MT13: Môi trường thử khả năng phân giải dextrin.

Thu thập mẫu giấm và khảo sát 1 số đặc tính của mẫu giấm

Tùy theo phương thức lên men và nguyên liệu lên men và chủng giống sẽ tạo nên sản phẩm có hàm lượng acid khác nhau. Các mẫu 2,3,5,10 có hàm lượng acid cao có khả năng sẽ phân lập đựợc những chủng giống tốt từ nguồn giấm này.

Phân lập và khảo sát 1 số đặc điểm phân loại của vi khuẩn acetic 1. Phân lập

Qua quá trình phân lập các mẫu giấm trên môi trường ethanol-cao nấm men-CaCO3 trong 3-4 ngày kết quả tạo được những khuẩn lạc có hình dạng, màu sắc, kích thước khác nhau. Trong đó có các chủng tạo vòng tan, chúng tôi tiến hành làm thuần được 11 chủng sinh acid khác nhau. Đặc tính về hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc trạng thái di động, hình dạng tế bào và trạng thái Gram được trình bày ở bảng 3.3.

Các đặc tính về khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trường Ethanol-Cao nấm men-CaCO3, các đặc trưng về hình thái tế bào,trạng thái Gram đã sơ bộ được các chủng khảo sát mang đặc tính của vi khuẩn sinh acid. Nhưng để định danh sơ bộ các vi khuẩn này đến cấp độ giống chúng tôi tiếp tục khảo sát các đặc tính sinh lý, sinh hóa của các chủng vừa xét. Vi khuẩn Acetic có đặc tính chung như sinh catalase, phát triển trên môi trường Glutamate, môi trường manitol, không làm tan chảy gelatin, không phân giải Dextrin….

Trong quá trình phân lập, trên moi trường có nguồn cacbon là ethanol chúng tôi tuyển chọn được các chủng có vòng phân giải là CaCO3, tức là các chủng này có khả năng oxy hóa ethanol thành acid hữu cơ tương ứng là acid acetic. Để kiểm chứng điều này, chúng tôi tiến hành định tính acid acetic tạo thành trong môi trường nuôi cấy các chủng trên bằng phương pháp dùng dung dịch FeCl3 5%. Sau khi nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh, rồi chuyển sang môi trường nhân giống cấp 1, môi trường nhân giống cấp 2, sau đó là môi trường định lượng.

Biểu đồ 3.3: Hàm lượng acid tổng trong môi trường nuôi cấy các chủng phân lập. Chủng A3 và A6 có hàm lượng acid tổng tạo thành cao hơn các chủng còn lại. Ở những thí nghiệm về các điều kiện lên men chúng tôi chọn 2 chủng này tiếp tục khảo sát.

Khả năng phân giải Dextrin của vi khuẩn Các chủng đều không có khả năng phân giải dextrin. Kết quả cho thấy chủng A3, A4, A5 có khả năng oxy hoá acetate( thể hiện qua sự chuyển màu từ màu vàng hơi xanh sang xanh dương), còn các chủng còn lại không có khả năng oxy hoá acetate( màu vàng hơi xanh). Kết quả khảo sát khả năng phát triển trên môi trường Mannitol cho thấy tất cả các chủng đều có khả năng phát triển trên môi trường này.

Khảo sát một số điều kiện ảnh hưởng đến sự lên men acetic 1. Chọn giống

Nuôi các chủng khảo sát trên môi trường tăng sinh và nhân giống cấp I, II rồi chuyển vào môi trường định lượng, nuôi cấy lắc trong 7 ngày. Nếu hàm lượng giống ban đầu quá cao thì sẽ có sự cạnh tranh của vi khuẩn gây ra ức chế sự oxy hóa ethanol thành acid acetic. Cấy giống từ môi trường thạch nghiêng vào erlen chứa môi trường tăng sinh, nuôi cấy lắc, đo mật độ tế bào, cho đến khi tỉ số OD giảm.

Kết quả cho thấy: đối với chủng A3 ở giờ 96 đo được trị số mật độ quang cực đại và sau đó giảm dần; đối với chủng A6 ở giờ 72 đo được trị số mật độ quang cực đại và sau đó giảm dần. Kết quả thu được cho thấy số vi khuẩn trong dịch nhân giống II của các chủng khảo sát đủ lớn để tiếp tục bước vào giai đoạn lên men. Chuyển khoảng 20% dịch nhân giống cấp II sang môi trường định lượng, đồng thời nuôi cấy bằng 3 phương pháp: phương pháp nuôi cấy tĩnh, phương pháp nuôi cấy sục khí, phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu.

Chuyển khoảng 20% dịch nhân giống cấp II sang môi trường định lượng, nuôi cấy tĩnh, đo hàm lượng acid sinh ra bằng phương pháp xác định acid tổng, kết quả trình bày ở bảng 3.13. Chuyển 20% dịch nhân giống cấp II sang môi trường định lượng, nuôi cấy bằng thiết bị lên men sục khí , đo hàm lượng acid sinh ra bằng phương pháp xác định acid tổng, kết quả trình bày ở bảng 3.14. Biểu đồ 3.12: Ảnh hưởng của thời gian đối sự tạo thành acid tổng của các chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy sục khí).

Biểu đồ 3.13: Ảnh hưởng của thời gian dối sự tạo thành acid tổng của các chủng khảo sát (phương pháp nuôi cấy bằng thiết bị lên men hồi lưu). Phương pháp nuôi cấy tĩnh tốn nhiều thời gian hơn phương pháp lên men sục khí và lên men bằng phương pháp lên men hồi lưu. Do vi khuẩn acetic là loài hiếu khí bắt buộc nên khi có nhiều oxy thì sự oxy hóa ethanol thành acid acetic sẽ diễn ra nhanh hơn.

Ở phương pháp sục khí và hồi lưu: Hàm lượng acid tổng tăng dần từ lúc bắt đâu nuôi cấy cho đến 96 giờ, sau đó bắt đầu giảm dần, nguyên nhân do vi khuẩn đã chuyển hóa hết ethanol, sau đó xảy ra sự quá oxy hóa. Xác bã các loại trái cây sẽ cho lên men tiếp trong khỏang thời gian thích hợp, thu dịch chiết từ xác bã với hàm lượng rượu không đáng kể để lên men giấm. Chúng tôi nhận thấy hàm lượng acid tổng trong môi trường có dịch chiết xác bã nho cao hơn trong môi trường dịch chiết xác bã thơm.Vậy nguyên liệu là xác bã nho thích hợp để làm giấm hơn xác bã thơm.