Chọn nguồn nguyên liệu và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6

Probiotic là những vi sinh vật dưới dạng sản phẩm thực phẩm hoặc chất bổ sung có khả năng cư trú trong đường ruột, tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ.

LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến cô giáo hướng dẫn PGS. TS LÊ THANH MAI, người đã tận tình động viên, giúp đỡ em trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cô giáo hướng dẫn ThS. HỒ PHÚ HÀ đã giúp đỡ em rất nhiều trong quá trình hoàn thành luận văn. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong Viện Công nghệ Sinh học – Thực phẩm đã cho em những kiến thức quý báu trong suốt thời gian học đại học. Cuối cùng em xin gửi tới gia đình, bạn bè, những tình cảm tốt đẹp nhất vì sự động viên, quan tâm, giúp đỡ của mọi người dành cho em trong thời gian làm luận văn. Sinh viên Trần Minh Trang TÓM TẮT Probiotic là những vi sinh vật dưới dạng sản phẩm thực phẩm hoặc chất bổ sung có khả năng cư trú trong đường ruột, tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ. Chủng Lactobacillus fermentum HA6 có tác dụng kháng vi nấm, ức chế sự tăng sinh của các tế bào ung thư nên được dùng làm chế phẩm probiotic. Tuy nhiên, việc thu hồi sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6 nuôi trên môi trường MRS rất đắt tiền, không phù hợp với điều kiện Việt Nam. Để giảm giá thành sản phẩm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tìm môi trường mới thích hợp cho sự phát triển của chủng Lactobacillus fermentum HA6 với tỷ lệ tiếp giống 2 g/l, đường Saccaroza hàm lượng 40 g/l, thay thế 50% Nitơ bằng dịch nấm men thủy phân, nuôi ở điều kiện pH = 6.1, yếm khí 5% CO 2 . SUMMARY Probiotics are defined as living microorganisms in forms of food or supplement in sufficient number, which colonize in a compartment of the host and express health benefits to the host. One of the potential strain is Lactobacillus fermentum HA6 which was found to have antifungal activity and the inhibitory toward proliferation of cancer cells. However, taking Lactobacillus fermentum HA6 biomass on MRS culture is very expensive and not fit well with Vietnamese condition. In order to decrease the price of the product, we have studied new suitable culture with the initial concentration 2 g/l, Sucrose 40 g/l, replace 50% of Nitrogen by yeast hydrolysis solution, pH = 6.1, in anaerobic 5% CO 2 condition. Results show the good development of Lactobacillus fermentum HA6. MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2 I.1. Vi khuẩn lactic 2 I.1.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn lactic 2 I.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic 3 I.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic 3 I.1.4. Một số đặc điểm của Lactobacillus và L.fermentum 4 I.2. Probiotic 5 I.2.1. Đặc điểm và chức năng của pribiotic 5 I.2.2. Dạng chế phẩm và ứng dụng của probiotic 8 I.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối của vi khuẩn lactic. 10 I.3.1. Hoạt động chuyển hóa của vi khuẩn lactic 10 I.3.2. Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic 11 I.3.2.1. Ảnh hưởng của nguồn cacbon 12 I.3.2.2. Ảnh hưởng của nguồn nitơ 14 I.3.2.3. Ảnh hưởng của các muối vô cơ và chất kích thích sinh trưởng 15 I.3.3. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh 17 trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic I.3.3.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống 17 I.3.3.2. Ảnh hưởng của pH 17 I.3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ 17 I.3.3.4 Ảnh hưởng của Oxy 18 PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 II.1. Nguyên vật liệu - hóa chất - thiết bị 19 II.1.1. Đối tượng nghiên cứu 19 II.1.2. Hóa chất 19 II.1.3. Thiết bị 20 II.2. Phương pháp nghiên cứu 20 II.2.1. Chuẩn bị môi trường 20 II.2.2. Phương pháp vi sinh 21 II.2.3. Phương pháp hóa lý 22 PHẦN III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 29 III.1. Đặc tính của chủng Lactobacillus fermentum HA6 29 III.1.1. Đặc điểm hình thái 29 III.1.2. Kiểm tra kiểu lên men 30 III.1.3. Kiểm tra chức năng của chủng HA6 30 III.2. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng tới quá trình tạo sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6 32 III.2.1. Lựa chọn nguồn dinh dưỡng thích hợp cho quá trình tạo sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6 32 III.2.1.1. Ảnh hưởng của nguồn Cacbon 32 III.2.1.2 Ảnh hưởng của nguồn Nitơ 35 III.2.2. Lựa chọn các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy của chủng Lactobacillus fermentum HA6 37 III.2.2.1. Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống 37 III.2.2.2. Ảnh hưởng của pH 38 III.2.2.3. Ảnh hưởng của chế độ thông khí 40 III.2.3. Động học của quá trình sinh trưởng và phát triển của chủng HA6 41 III.3. Ứng dụng của chủng HA6 trong sản xuất sữa chua probiotic 42 KẾT LUẬN 45 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC KÍ HIỆU VIẾT TẮT 1. VTM: vitamin 2. EMP: Embden-Meyergof-Parnas 3. DBS: Dịch thủy phân tinh bột sắn 4. SK: Sinh khối 5. HS: Hiệu suất thu hồi sinh khối 6. HLA: Hàm lượng axit 7. HLD: Hàm lượng đường sót 8. KpH: Không duy trì pH MỞ ĐẦU Các vi khuẩn lactic được sử dụng rộng rãi trong tự nhiên nói chung và ngành thực phẩm nói riêng, đồng thời là loại vi sinh vật được nghiên cứu rất nhiều từ trước tới nay. Qua nhiều thế kỉ, người tiêu dùng biết đến những sản phẩm thực phẩm góp phần cải thiện và nâng cao sức khoẻ con người như: sữa chua, pho mát hay thuốc uống: men tiêu hoá. Những sản phẩm đó chứa nhiều vi sinh vật sống có lợi đặc biệt là vi khuẩn lactic [15]. Năm 1989 Parker đã đưa ra định nghĩa:”Probiotics là những vi sinh vật dưới dạng thực phẩm hoặc chất bổ sung, có khả năng cư trú trong đường ruột, tác động có lợi cho sức khoẻ vật chủ” [15]. Elie Metchknikoff là người đầu tiên đặt nền móng cho việc sử dụng probiotic Nhiều nghiên cứu trong lĩnh vực này đều nhận thấy chế phẩm probiotic đã tạo ra những thay đổi về khu hệ vi sinh vật trong đường ruột theo hướng cân bằng có lợi, trong đó các vi khuẩn có ích tăng đáng kể, số lượng các vi khuẩn có khả năng gây bệnh giảm mạnh [5]. Thuật ngữ probiotic ra đời từ đây. Probiotic có nghĩa là tăng cường sự sống, người ta giả thiết probiotic có lẽ do ghép hai chữ tiếng anh: prophylaxia-phòng bệnh và biotic-sự sống [5]. Trong đó Lactobacillus fermentum là vi khuẩn an toàn, có khả năng kháng vi sinh vật gây hại, hỗ trợ vi khuẩn có ích nên được ứng dụng vào chế phẩm probiotic. Hiện nay, ở Việt Nam, các chế phẩm probiotic hầu hết phải nhập ngoại với giá cao chưa đáp ứng đủ nhu cầu của người tiêu dùng. Một yêu cầu cấp thiết đặt ra là phải nghiên cứu thu hồi sinh khối vi khuẩn lactic với hiệu suất thu hồi cao đồng thời đảm bảo hiệu quả kinh tế để có thể sản xuất với quy mô lớn. Với muc đích như vậy chúng tôi tiến hành đề tài: Chọn nguồn nguyên liệu và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6. PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1. Vi khuẩn lactic I.1.1. Lịch sử nghiên cứu về vi khuẩn lactic (LAB): Vi khuẩn lactic là gì? Một câu hỏi lớn đặt ra cho các nhà khoa học nghiên cứu để có câu trả lời đồng nhất. Trở lại lịch sử của thời kì trước thế kỉ 20, thuật ngữ vi khuẩn lactic được sử dụng để chỉ những vi khuẩn làm chua sữa. Năm 1873 J.Lister lần đầu tiên đã phân lập đươc một loại vi khuẩn đặt tên là “Bacterium lactis” (hay có thể gọi là Lactococcus Lactis). Khi nghiên cứu về việc phân loại vi khuẩn lactic người ta đã tìm thấy những nét tương tự giữa vi khuẩn lactic trong sữa và các vi khuẩn trong các sản phẩm chứa axit lactic khác như thịt, rượu vang, và các loại vi khuẩn lactic có ích trong đường ruột [16] . Trong các định nghĩa trước đây thì vi khuẩn lactic được coi là nhóm vi khuẩn có khả năng lên men và đông tụ sữa, bao gồm cả vi khuẩn đường ruột và vi khuẩn lactic. Năm 1901, Beijernick đã miêu tả sinh vật có tên lactobacillus là dạng vi khuẩn G(+) và phân biệt hẳn vi khuẩn đường ruột với vi khuẩn lactic. Chúng là một trong những vi khuẩn lactic hữu ích nhất, hầu hết được tìm thấy trong bộ máy tiêu hoá. Bước vào thế kỉ 20 sự quan tâm về Lactobacillus xuất hiện trong thực đơn con người tăng lên khi Elie Metchnikoff ở viện Pasteur Paris phát triển và ứng dụng loại vi khuẩn này để bổ sung vào khẩu phần ăn nhằm ngăn ngừa và chữa bệnh. Nhưng lý thuyết của ông về việc kéo dài sự sống và sự khoẻ mạnh nhờ vào việc ăn dạng thực phẩm chứa vi khuẩn này đã gây tai tiếng cho ông. Bởi tác dụng của các sản phẩm này không được như mong muốn người tiêu dùng và hiển nhiên chưa đủ cơ sở khoa học để chứng minh sự ưu việt của nó. Từ đó tới nay đã có rất nhiều nghiên cứu về vi khuẩn lactic nhờ vào những kĩ thuật hiện đại con người đã miêu tả đầy đủ hơn về hình dáng, cấu tạo, đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic. Trong đó kỹ thuật di truyền trở thành một công cụ phân loại vô cùng quan trọng với việc xác định hàm lượng phần trăm mol C+G chứa trong DNA hay phương pháp điện di để xác định các gen [4,8]. I.1.2. Phân loại vi khuẩn lactic Có rất nhiều cách phân loại vi khuẩn lactic. Dựa vào những tính chất cơ bản của chúng mà người ta có thể phân loại theo: hình thái học, kiểu lên men, khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau, khả năng chịu muối, chịu axit hay chịu kiềm… Năm 1919, Orla – Jensen là người tiên phong trong việc nghiên cứu, phân loại có hệ thống các vi khuẩn lactic. Về hình dáng ông phân chúng thành bốn giống: Lactobacillus; Pediococus; Streptococus và lactococus; Leuconostoc. Ngày nay người ta bổ sung thêm một giống nữa là Bifidobacterium có hình dạng biến đổi [16, 17, 22]. - Lactobacillus: Trực khuẩn, có thể xếp đôi, chuỗi hoặc đứng riêng lẻ. Nhiệt độ tối ưu là 30 0 C - 45 0 C. Lên men được galactoza, glucoza, sacaroza, fructoza . Bao gồm ba nhóm có ba loài đặc trưng: L.bulgaricus, L. brevis, L. casei. -Leuconostoc: Cầu khuẩn, có hình ovan hoặc hình trứng. Lên men đường dextran, trioza, sản phẩm tạo thành là axit D- lactic, etanol, CO 2 . Có hai loài đặc trưng là L.mensenteroides và L. lactic. -Pediococus: Cầu khuẩn, tồn tại dưới dạng bát cầu khuẩn, tụ cầu khuẩn. Lên men đường glucoza theo con đường EMP, axit lactic tạo thành có dạng DL, D(-) hay D(+). Có ba loài đặc trưng là P.acidilactici, P.dextranicum, P. halophilus. -Streptococus và Lactococus: Dạng cầu khuẩn, xếp đôi hoặc chuỗi. Có khả năng lên men đường hexoza thành axit lactic và các loại đường khác. Có ba loài đặc trưng được sử dụng trong sữa: S. lactis, S.cremoris, S.thermophilus. -Bifidobacterium: Lên men dị hình, có hình dạng biến đổi, đôi khi có hình ovan, có lúc lại hình que. Có khả năng lên men lactoza sản phẩm tạo thành là axit lactic và axit axetic. I.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic Các vi khuẩn lactic được xếp chung vào họ Lactobacteriacae. Chúng không đồng nhất về mặt hình thái,các giống vi khuẩn khác nhau có hình dạng và kích thước khác nhau. Ngoài ra hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic còn phụ thuộc vào môi trường, điều kiện nuôi cấy, sự có mặt của oxy và tuổi tế bào [6]. Tuy nhiên về mặt sinh lý chúng lại tương đối đồng nhất. Chúng đều là các vi khuẩn Gram(+), không tạo bào tử, không di động, thu năng lượng nhờ phân giải hydratcacbon và tiết [...]... to lớn của vi khuẩn Lactobaccillus fermentum HA6 trong việc tạo chế phẩm probiotic, vì vậy vấn đề cần thiết đặt ra là nuôi cấy để thu hồi sinh khối vi khuẩn trên quy mô lớn Nhằm mục đích đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu:  Kiểm tra đặc tính của chủng Lactobaccillus fermentum HA6  Chọn nguồn nguyên liệu thích hợp thay thế cho môi trường MRS trong quá trình nuôi cấy Lactobaccillus fermentum HA6 để... fermentum HA6 để giảm giá thành sản phẩm  Chọn điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy Lactobaccillus fermentum HA6  Ứng dụng vào chế biến sữa chua probiotic PHẦN II NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1 Nguyên vật liệu – hóa chất- thiết bị nghiên cứu II.1.1 Đối tượng nghiên cứu Chủng giống vi khuẩn: Chủng vi khuẩn lactic thuần khiết Lactobacillus fermentum HA6 được phân lập từ các sản phẩm lên... chất Ngoài ra Silva và cộng sự đã tìm ra mối liên hệ giữa pH cuối cùng của môi trường nuôi cấy chủng L bulgaricus liên quan đến quá trình sấy phun và bảo quản khô sau này Họ nhận định được tế bào sẽ chịu được quá trình xử lý nhiệt độ tốt hơn nếu trong quá trình nuôi cấy không điều chỉnh pH I.3.3.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Nhiệt độ... hưởng của nguồn dinh dưỡng lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic Trong quá trình lên men một môi trường nuôi cấy tốt nhất phải là môi trường đảm bảo cho sản xuất tốt nhất với hiệu suất cao trong thời gian ngắn nhất và giá thành thấp nhất đối với chủng vi sinh vật cho trước [5] Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấp không chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy. .. lượng sinh khối tạo thành Tiến hành: Cho 30ml dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống Falcon, ly tâm ỏ 6000 vòng trong 10 phút, rồi đem cân để suy ra hàm lượng sinh khối trong 1 lit môi trường b) Định lượng sinh khối vi khuẩn bằng phương pháp mật độ quang Mục đích: Sử dụng phương pháp đo OD của dịch nuôi cấy vi khuẩn lactic từ đó xác định được khối lượng sinh khối tạo thành Cơ sở của phương pháp dựa vào sự... lạnh và khả năng chống chịu muối mật của vi khuẩn lactic [2, 11] I.3.3 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic I.3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ tiếp giống Tỷ lệ tiếp giống có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi khuẩn Nếu tỷ lệ tiếp giống quá thấp sẽ kéo dài thời gian nuôi cấy, dễ nhiễm tạp, hiệu suất thu hồi sinh khối thấp Nếu tỷ lệ tiếp giống quá. .. gian nuôi cấy rút ngắn nhưng hàm lượng sinh khối không cao do vi khuẩn phát triển nhanh quá làm nguồn thức ăn chóng cạn kiệt, và chúng sinh ra một số sản phẩm gây ức chế quá trình sinh trưởng Vì vậy chọn tỷ lệ tiếp giống thích hợp sẽ tiết kiệm canh trường giống, đảm bảo quá trình lên men hiệu quả, rút ngắn thời gian lên men I.3.3.2 Ảnh hưởng của pH Sống trong môi trường lỏng, vi khuẩn chịu tác động của. .. pha loãng Vẽ đường chuẩn sinh khối biểu diễn mối quan hệ giữa OD và lượng sinh khối sau pha loãng Sử dụng đường chuẩn cho các tính toán sau này Đo OD ở bước sóng 600 nm • Xác định độ ẩm sinh khối theo phương pháp sấy Nguyên tắc: Sinh khối vi khuẩn được sấy đến khối lượng không đổi Căn cứ vào khối lượng sinh khối trước và sau khi sấy, tính được hàm lượng nước trong nguyên liệu Tiến hành: Lấy một chén... điện ly) và saccaroza (chất không điện ly) vào môi trường MRS khi nuôi cấy L bulgaricus đem lại những kết quả khác nhau trong quá trình tạo sinh khối và tỷ lệ sống sót của tế bào trong khi sấy và bảo quản sau này Khi bổ sung NaCl ở nồng độ thích hợp (5g/l) thì có tỷ lệ sống sót cao hơn so với khi chỉ dùng saccaroza trong môi trường nuôi cấy L bulgaricus [1, 9] Các vi khuẩn lactic , đặc biệt là Lactobacillus. .. được đưa vào cơ thể có thể ức chế các vi sinh vật gây bệnh: Samonella, E.coli…bằng cách sản sinh ra axit lactic, H2O2 và các chất thuộc họ Bacteriocin Những chất này làm biến đổi môi trường ruột, tạo môi trường không thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật gây hại làm chúng không sinh trưởng phát triển được hoặc tạo lỗ thủng ở thành tế bào làm kìm hãm quá trình sinh tổng hợp lớp peptidoglucan và làm . tài: Chọn nguồn nguyên liệu và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6. . hưởng của nguồn Nitơ 35 III.2.2. Lựa chọn các điều kiện thích hợp cho quá trình nuôi cấy của chủng Lactobacillus fermentum HA6 37 III.2.2.1. Ảnh hưởng của