Xác định nguồn nguyên liệu và điều kiện nuôi cấy thích hợp cho quá trình tạo sinh khối của chủng Lactobacillus fermentum HA6 phục vụ sản xuất probiotic

Đặc điểm và chức năng của probiotic a) Đặc điểm

Trong đó, hệ vi khuẩn axit lactic là hệ vi khuẩn được sử dụng nhiều nhất trong các sản phẩm probiotic, chủ yếu là giống Lactobacillus, do có khả năng chuyển hóa đường (bao gồm cả lactoza) và các hydratcacbon khác thành axit lactic. Nó không chỉ tạo vị chua cho các sản phẩm sữa lên men như sữa chua mà còn có tác dụng như một chất bảo vệ bằng cách hạ pH, giảm khả năng phát triển của các vi sinh vật có hại. b) Chức năng của probiotic. Ngoài ra vi khuẩn lactic còn làm giảm hoạt tính, mức độ của các chất gây ung thư và sự hoạt động của các khối u, giảm bệnh cao huyết áp, dị ứng, giữ cân bằng lượng ostrogen, tăng khả năng hấp thụ canxi để phòng bệnh loãng xương và bệnh trào ngược thực quản, ngăn chặn các bệnh về nhiễm trùng đường tiết niệu, đường hô hấp ở trẻ em [18].

Dạng chế phẩm và ứng dụng của Probiotic

Khi cơ thể bị ốm, tiêu chảy, loạn khuẩn do dùng kháng sinh… sẽ làm mất cân bằng này, ảnh hưởng đến sức khỏe con người. Vi khuẩn lactic được đưa vào cơ thể có thể ức chế các vi sinh vật gây bệnh: Samonella, E.coli…bằng cách sản sinh ra axit lactic, H2O2 và các chất thuộc họ Bacteriocin. Những chất này làm biến đổi môi trường ruột, tạo môi trường không thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật gây hại làm chúng không sinh trưởng phát triển được hoặc tạo lỗ thủng ở thành tế bào làm kìm hãm quá trình sinh tổng hợp lớp peptidoglucan và làm tăng cường quá trình tự phân của tế bào. Nhờ đó đã khôi phục lại sự cân bằng của hệ vi sinh vật đường ruột. Vi khuẩn lactic được đưa vào thay thế vi sinh vật có lợi bị giết, làm giảm tác dụng phụ của thuốc kháng sinh khi sử dụng kháng sinh chữa bệnh. Ngoài ra vi khuẩn lactic còn làm giảm hoạt tính, mức độ của các chất gây ung thư và sự hoạt động của các khối u, giảm bệnh cao huyết áp, dị ứng, giữ cân bằng lượng ostrogen, tăng khả năng hấp thụ canxi để phòng bệnh loãng xương và bệnh trào ngược thực quản, ngăn chặn các bệnh về nhiễm trùng đường tiết niệu, đường hô hấp ở trẻ em [18]. a) Chế phẩm Probiotic dạng bột b) Chế phẩm Probiotic dạng lỏng. c) Chế phẩm Probiotic dạng sệt d) Chế phẩm Probiotic dạng viên nhộng Hình 1.1: Các dạng chế phẩm Probiotic. Dựa vào các thành tựu khoa học hiện đại, người ta đã phân lập và sản xuất được các chế phẩm sinh học từ vi khuẩn lactic để bổ sung vào khẩu phần ăn của người già, em bé, và người bệnh nhằm cung cấp vi khuẩn lactic cho hệ vi khuẩn đường ruột để kích thích và điều tiết quá trình tiêu hóa, tiêu diệt các vi sinh vật nhiễm trùng, chữa bệnh đầy hơi và rối loạn tiêu hóa.

Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

Nhóm các nhà khoa học của Carcalho đã khẳng định rằng khả năng sống sót của L.bulgaricus trong và sau sấy đông khô phụ thuộc vào loại đường được bổ sung trong quá trình nuôi cấy và thu hồi chế phẩm; nếu lên men từ manoza thì tỷ lệ tế bào chết nhiều hơn hẳn so với lên men từ fructoza và lactoza [9]. Để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ chứa nitơ như các sản phẩm thủy phân protein từ lactanbumin, casein, pepton, peptit, dịch nấm men thủy phân, dịch chiết thịt, trypton… Đây cũng chính là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng.

Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic

Tất cả các giống trực khuẩn đều cần đến pantothenate canxi (vitamin B5) và niacin (vitamin B3) và có những đòi hỏi khác nhau đối với những vitamin khác. Mặc dù có rất nhiều các nghiên cứu khác nhau về nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic, tuy nhiên họ đều có quan điểm chung rằng nhóm vitamin B rất cần thiết để kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic lên men dị hình rất cần thiamin, nhưng axit folic và axit p-aminobenzoic không ảnh hưởng đến sự phát triển của các loài Lactobacillus.

Nhu cầu về vitamin còn ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như điều kiện nuôi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hóa khử của môi trường thành phần môi trường. Ngoài ra các hợp chất chứa axit béo có mặt trong môi trường không những tác động đến quá trình sinh trưởng của vi khuẩn mà còn đóng vai trò trong quá trình lạnh đông sau này. Ví dụ như Tween 80 sẽ làm thay đổi một số axit béo trong tế bào vi khuẩn lactic, sự thay đổi này ảnh hưởng đến khả năng chịu lạnh và khả năng chống chịu muối mật của vi khuẩn lactic [2, 11].

Nhiệt độ nuôi cấy quá cao hay quá thấp đều có thể gây ức chế các enzym, làm đình trệ các phản ứng trao đổi chất và do đó ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Mặc dù các vi khuẩn lactic thường được gọi là các vi khuẩn yếm khí tùy tiện, thông thường các chuỗi vận chuyển electron không hoạt động nhưng quá trình oxy hóa khử DNA vẫn xảy ra.  Qua những hiểu biết tổng quan ở trên chúng tôi thấy được tầm quan trọng vô cùng to lớn của vi khuẩn Lactobaccillus fermentum HA6 trong việc tạo chế phẩm probiotic, vì vậy vấn đề cần thiết đặt ra là nuôi cấy để thu hồi sinh khối vi khuẩn trên quy mô lớn.

Nguyên vật liệu – hóa chất- thiết bị nghiên cứu

Môi trường nuôi cấy tạo sinh khối: thành phần muối như môi trường MRS có một số thành phần chính như nguồn cacbon, nguồn nitơ được thay đổi theo yêu cầu nghiên cứu ( hàm lượng đường, nguồn Nitơ được thay thế một phần..).

Phương pháp nghiên cứu 1. Chuẩn bị môi trường

Chủng Lactobacillus fermentum được giữ giống trong môi trường MRS có bổ sung 16% glyxerol, bảo quản ở -80 0C.Khi cần hoạt hóa giống trong môi trường lỏng rồi cấy sang thạch nghiêng để chuẩn bị cho các thí nghiệm khác. Rửa sạch tiêu bản bằng nước rồi nhuộm bổ sung bằng dung dịch Fushin trong 1-2 phút Sau đó rửa lại bằng nước sạch, đợi tiêu bản khô rồi đem đi soi dưới kính hiển vi vât kính dầu có độ phóng đại 1000 lần, đánh giá kết quả. • Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kendan Trong quá trình nghiên cứu, sử dụng dịch nấm men thủy phân để thay thế nhằm giảm giá thành sản phẩm.

Mục đích: Xác định hàm lượng đường khử có trong dịch thủy phân tinh bột sắn, Maltodextrin, làm môi trường nuôi cấy và xác định hàm lượng đường sót của các mẫu sau khi lên men. Tiếp đó dùng dung dịch đường đã xử lý và pha loãng để chuẩn tới mất màu của xanhmetylen.màu của hỗn hợp phản ứng sẽ thay đổi từ xanh sang phớt hồng và cuối cùng là vàng da cam thì kết thúc. • Xác định hàm lượng axit tổng số bằng phương pháp chuẩn độ Mục đích: Xác định hàm lượng axit tổng số của các mẫu nghiên cứu sau khi lên men, và xác định độ chua của sữa chua.

Có thể đánh giá tốc độ phát triển của vi khuẩn bằng cách đo sự tăng sinh khối thông qua giá trị OD(Optical Density). Các thí nghiệm được đo ỏ bước sóng 600 nm. • Xác định lượng sinh khối. a ) Định lượng bằng cách ly tâm và xác định trọng lượng. Mục đích: Ly tâm nhằm xác định lượng sinh khối của vi khuẩn sau khi nuôi cấy, tách sinh khối vi khuẩn khỏi môi trường để dễ dàng định lượng sinh khối tạo thành. Tiến hành: Cho 30ml dịch nuôi cấy vi khuẩn vào ống Falcon, ly tâm ỏ 6000 vòng trong 10 phút, rồi đem cân để suy ra hàm lượng sinh khối trong 1 lit môi trường. b) Định lượng sinh khối vi khuẩn bằng phương pháp mật độ quang. Cơ sở của phương pháp dựa vào sự phụ thuộc tuyến tính của OD giữa canh trường nuôi cấy vi khuẩn và khối lượng tế bào có trong canh trường đó khi ở một giới hạn nồng độ xác định. Sau đó cho vào chén 3g mẫu, sấy ở 1050C trong 3 tiếng, sau đó lấy ra cho vào bình hút ẩm đến khi nguội bỏ ra cân, rồi lại đặt vào tủ sấy sấy tiếp trong 1 tiếng rồi đặt vào bình hút ẩm đến khi nguội và cân.