Tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho các chủng bacillus subtilis có khả năng sản sinh bacteriocin hoạt tính cao

BỘ CÔNG THƯƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG Tên đề tài: TUYỂN CHỌN VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN NI CẤY THÍCH HỢP CHO CÁC CHỦNG Bacillus subtilis CĨ KHẢ NĂNG SẢN SINH BACTERIOCIN HOẠT TÍNH CAO Mã số đề tài: 19.2TP05SV Chủ nhiệm đề tài: Đinh Thị Ngọc Ngân Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh, 10/2020 LỜI CÁM ƠN Để có thành cơng ngày hôm không công sức cá nhân mà nhờ vào cố gắng tập thể, bạn bè, anh chị quan trọng hết hỗ trợ tận tình thầy cơ, người đưa đị dẫn lối cho chúng tơi đường tìm kiếm tri thức Trước tiên xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Trường đại học Công nghiệp TP HCM với phòng Quản lý khoa học Hợp tác quốc tế hỗ trợ tạo điều kiện để thực đề tài Chúng tơi cảm ơn đến quý thầy cô viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm tận tình truyền đạt cho tơi kiến thức kỹ chuyên môn, hành trang q giá để tơi tự tin bước vào đời cống hiến cho xã hội Chúng xin chân thành cảm ơn thầy cô Đặc biệt, xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Ngọc Ẩn dành thời gian quý báu để cố vấn cho lĩnh vực nghiên cứu khoa học Bên cạnh chúng tơi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến TS Phạm Tấn Việt TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh đồng hành, tạo điều kiện hỗ trợ trình thực đề tài Mặc dù đề tài khơng tránh khỏi thiếu sót, chúng tơi mong nhận ý kiến đóng góp quý báu q thầy giúp đề tài hồn thiện PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Tuyển chọn xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng Bacillus subtilis có khả sản sinh bacteriocin hoạt tính cao 1.2 Mã số: 19.2TP05SV 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học hàm, học vị) Đơn vị công tác Vai trò thực đề tài Đinh Thị Ngọc Ngân Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm (Sinh viên) - Khảo sát điều kiện nuôi cấy Bacillus subtilis NN Viết báo cáo Trịnh Tiền Kim Ngân Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm (Sinh viên) Khảo sát điều kiện nuôi cấy Bacillus licheniformis KN Viết báo cáo Nguyễn Phúc Thạnh (Sinh viên) Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm - Phân lập định danh vi khuẩn sinh bacteriocin Kiểm tra khả kháng VSV chủng Bacillus Viết báo cáo 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Cơng nghệ Sinh học vả Thực phẩm trường Đại học Công nghiệp TP HCM 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 04 năm 2020 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng 09 năm 2020 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 10 năm 2019 đến tháng 09 năm 2020 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Dựa số thay đổi thực tế sở điều kiện thí nghiệm tình Hình dịch bệnh, chúng tơi có số thay đổi so với thuyết minh ban đầu sau: Thuyết minh ban đầu Aspergillus niger Vi sinh vật đối kháng Nguồn nitrogen pH môi trường ban đầu Thay đổi - Thay bằng: A fumigatus - Bổ sung thêm vi khuẩn: S aureus, S typhi, E coli - Bổ sung thêm nấm mốc: F oxysporum, F equiseti, Aspergillus sp., P chermesinum, N dimidiatum (NH4)2HPO4, NH4H2PO4, - Thay bằng: NH4Cl, NaNO3, tryptone peptone - Bổ sung nồng độ 0.1% - Bổ sung nồng độ 1.0% Thay bằng: 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 6.8, 6.9, 7.0, 7.1, 7.2 9.0 Nhiệt độ nuôi cấy 36.0℃, 36.5℃, 37.0℃, 37.5℃, 38.0℃ Thời gian nuôi cấy 12h, 24h, 36h, 48h Nồng độ NaCl 3.3%, 3,4%, 3.5%, 3.6%, 3.7% Nhiệt độ bảo quản -40℃, 0℃, 4℃ Thay bằng: 25℃, 28℃, 33℃, 37℃, 45℃ Thay bằng: sau hay giờ, 24 Thay bằng: 0%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0% Thay bằng: -60℃, -20℃, 4℃, nhiệt độ phịng (~33℃) 1.7 Tổng kinh phí phê duyệt đề tài: triệu đồng II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Trong năm ngày việc xuất nhiều vi sinh vật đề kháng kháng sinh ngày gia tăng vấn đề báo động toàn giới Theo báo cáo WHO từ năm 2014 đến có triệu người tử vong nhiễm siêu vi khuẩn kháng kháng sinh Các chủng vi khuẩn gây bệnh đa phần kháng thuốc, khoảng 60% ca nhiễm trùng bệnh viện vi khuẩn kháng thuốc nhóm kháng sinh bị kháng Hiện nay, WHO xếp Việt Nam vào nhóm nước kháng sinh bị kháng cao giới mà nguyên nhân đến từ việc lạm dụng mức sử dụng kháng sinh không phù hợp với chứng cho thấy 88-97% cửa hàng bán thuốc kê kháng sinh mà khơng có đơn thuốc bác sĩ [1] [2] Theo nghiên cứu từ bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp cho thấy E coli Klebsiella spp kháng cephalosporin hệ với tỷ lệ tương đối cao: cefotaxime (52,2%-64,4%) (43,2%-56,7%), kháng ceftazidime (32,3%-53,0%) (39,9%-50,8%), Klebsiella spp kháng imipenem 26,2%-28,1%, kháng meropenem 21,9%-29,6%, đặc biệt xuất chủng Acinetobacter baumannii Pseudomonas aeruginosa đề kháng với tất kháng sinh thử nghiệm [3] Kháng sinh hầu hết sản xuất kháng sinh phổ rộng dùng để ức chế tiêu diệt nhiều loài vi sinh vật gây bệnh việc sử dụng kháng sinh cịn tiêu diệt vi sinh vật sống cộng sinh thể vật chủ (các loài bacteroides sống đại tràng tổng hợp vitamin K cần thiết; vi khuẩn đường ruột giúp chống lại sinh vật gây bệnh), đa số vi sinh vật trở trạng thái tiền xử lí kháng sinh có số khơng thể phục hồi làm ảnh hưởng đến sức khỏe vật chủ [4] Sự khan việc tìm loại kháng sinh thay loại kháng sinh khơng cịn tác dụng chữa trị thúc đẩy cần tìm giải pháp an toàn chẳng hạn bacteriocin hợp chất giống bacteriocin (bacteriocin like substances) [5] Bacteriocin hợp chất giống bacteriocin có số điểm thuận lợi chúng protein peptide sản xuất ribosome nên không giống với kháng sinh, chúng nhạy cảm với protease, có hại với người môi trường xung quanh [6] Bacteriocin ức chế giết chết lồi có quan hệ gần gũi chí khác lồi vơ hại thân vi sinh vật sản xuất chúng có gen giúp chống lại tác động bacteriocin [6] Chính tác dụng có lợi tiềm ứng dụng lớn hợp chất y học chăn nuôi, thủy sản, thực phẩm… nên tiến hành tuyển chọn từ chế phẩm sinh học chủng Bacillus khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho sản sinh bacteriocin từ chủng vi khuẩn Mục tiêu Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sản sinh bacteriocin từ chủng Bacillus Với mục tiêu đề tài gồm có nội dung nghiên cứu sau:  Phân lập định danh chủng vi khuẩn Bacillus từ chế phẩm sinh học  Sàng lọc khả kháng khuẩn kháng mốc chủng Bacillus  Khảo sát ảnh hưởng điều kiện nhiệt độ thời gian nuôi cấy lên khả kháng khuẩn kháng mốc chủng Bacillus  Khảo sát ảnh hưởng pH môi trường ban đầu lên khả kháng khuẩn kháng mốc chủng Bacillus  Khảo sát ảnh hưởng nguồn nitrogen lên khả kháng khuẩn kháng mốc chủng Bacillus  Khảo sát ảnh hưởng nồng độ NaCl lên khả kháng khuẩn kháng mốc chủng Bacillus  Khảo sát nhiệt độ thời gian bảo quản dịch bacteriocin thô Phương pháp nghiên cứu 3.1 Phương pháp phân lập Cân g bột chế phẩm sinh học cho vào môi trường LB broth, nuôi lắc 150 vòng/phút 30 phút 37°C Dùng que cấy nhúng vào ống giống hoạt hóa tiến hành cấy ria đĩa môi trường LB agar nuôi ủ 37°C 24 Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy ria có chủng vi khuẩn khiết Tiến hành giữ giống cho thí nghiệm 3.2 Phương pháp giữ giống Chọn khuẩn lạc riêng lẻ tăng sinh ml môi trường LB, hút 10% giống vào 10 ml môi trường LB ni cấy lắc 150 vịng/phút đến OD600= 0.6-0.8 Sau phân phối vào eppendorf dịch khuẩn glycerol với tỷ lệ 1:1, tiến hành trữ đông -60ºC 3.3 Phương pháp định danh Quan sát đại thể, vi thể Hình thái khuẩn lạc quan sát sau 24 nuôi cấy môi trường thạch LB Tiến hành quan sát đặc điểm khuẩn lạc dựa vào yếu tố: màu sắc, kích thước, bề mặt khuẩn lạc, hình dạng rìa khuẩn lạc [7] Cấu trúc vi thể khuẩn lạc quan sát tiêu nhuộm Gram: (1) Chọn khuẩn lạc đặc trưng (2) Tạo vết bơi cách dùng que cấy lấy vi khuẩn hịa vào giọt nước lam kính sau hơng khơ lửa đèn cồn (3) Nhuộm tiêu theo thứ tự thuốc nhuộm tím kết tinh 60 giây - rửa nước - Lugol 60 giây - rửa nhanh cồn 96° - rửa nước - safranin 60 giây - rửa nước (4) Quan sát ghi nhận Hình ảnh vật kính X100 với dầu Vi khuẩn Bacillus đa số tạo bào tử sau 48 giờ, sau thời gian nuôi ủ chọn khuẩn lạc đặc trưng tiến hành nhuộm bào tử: (1) Chọn khuẩn lạc đặc trưng (2) Tạo vết bôi cách dùng que cấy lấy vi khuẩn hịa vào giọt nước lam kính sau hong khơ lửa đèn cồn (3) Đặt lam kính lên giá đỡ đặt vào nồi nước đun sôi, đặt giấy lọc vệt bôi (4) Nhỏ 2-3 giọt malachite lên để yên 10 phút sau rửa nước cất (5) Nhỏ 2-3 giọt safranin 30 giây, rửa lại nước cất, để khơ (6) Quan sát vật kính X100 ghi nhận Hình ảnh Các phản ứng sinh hóa Thử nghiệm phản ứng sinh hóa: Thử nghiệm indol, VP, amylase, catalase, có khả di động, hiếu khí [7] - Thử nghiệm indol: Vi khuẩn nuôi cấy môi trường canh thang Tryptophan 35-37°C 18-24 giờ, sau thời gian ủ nhỏ 2-3 giọt thuốc thử Kovac quan sát kết Dương tính xuất vịng đỏ phía dung dịch ni cấy - Thử nghiệm VP: Vi khuẩn nuôi cấy môi trường MR-VP 37°C 24-48 Sau thời gian nuôi ủ lấy ml dịch nuôi cấy cho vào ống nghiệm mới, thêm 0.6 ml dung dịch α-napthol 15% với 0.2 ml KOH 40% Sau 15-20 phút quan sát kết Kết dương tính xuất màu đỏ môi trường - Thử nghiệm tính di động: Cấy vi khuẩn đâm sâu vào mơi trường thạch mềm (0.5% agar) vi khuẩn có tính di động làm môi trường đục, phát triển lan khỏi vệt cấy - Thử nghiệm catalase: Lấy vi khuẩn đặt lên lam kính sạch, nhỏ vài giọt H2O2 30% lên vi khuẩn, quan sát sau - giây Phản ứng dương tính có bọt khí xuất - Kiểm tra hoạt tính amylase: bổ sung vào môi trường LB agar 1% tinh bột, cấy chấm điểm vi khuẩn sau ủ 37°C 24-48 Tiến hành nhỏ lugol vào đĩa thạch, vi khuẩn có khả phân giải amylase xuất vòng phân giải Định danh phương pháp sinh học phân tử Mẫu gửi giải trình tự công ty TNHH Dịch Vụ Thương Mại Nam Khoa Kết giải trình tự xử lí so sánh với sở liệu 16S-rRNA vi khuẩn có sẵn NCBI cơng cụ BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) sử dụng để vẽ phát sinh loài phần mềm Mega version (Tamura, Peterson, Stecher, Nei, and Kumar, 2011) 3.4 Phương pháp thu nhận dịch nuôi cấy Bacillus nuôi tăng sinh môi trường LB broth với tốc độ lắc 150 vòng/phút 24 giờ, sau chia nhỏ dịch huyền phù vào ống eppendorf 1.5 ml, tiến hành ly tâm 14000 vòng/ phút 15 phút 4℃ loại bỏ cặn tế bào Phần dịch sau ly tâm lọc qua màng lọc 0.45 µm điều kiện vơ trùng để loại bỏ phần tế bào cịn sót lại [8] 3.5 Phương pháp khuếch tán giếng thạch Vi khuẩn nuôi cấy qua đêm mơi trường LB broth, sau dịch vi khuẩn pha loãng tương đương với giá trị McFarland 0.5 (≈1.5x108 CFU/ml) để sử dụng làm đối kháng Chuẩn bị đĩa môi trường LB agar (10 ml), hút 100 µl dịch vi khuẩn thị trang bề mặt thạch khô Tiến hành đục giếng với đường kính mm đĩa thạch Hút 50 µl dịch cho vào giếng với giếng 1: dịch nuôi cấy; giếng 2: dung dịch NaCl 0.9% [8] Ủ đĩa nhiệt độ phòng đọc kết sau 12 Khả kháng khuẩn dịch nuôi cấy xác định diện vịng kháng khuẩn xung quanh giếng, đường kính vịng kháng khuẩn tính cơng thức: [8] [9] H= D-d Trong H: Độ lớn vùng kháng khuẩn (mm) D: Đường kính vịng ức chế (mm) d: Đường kính giếng (mm) 3.6 Phương pháp chuẩn bị giống Bacillus từ eppendorf giống hoạt hóa đĩa mơi trường LB agar ủ 37°C 24 Sau thời gian ủ, dùng que cấy tròn lấy khuẩn lạc cho vào bình chứa ml mơi trường LB broth ni lắc 150 vịng/phút, 37°C, qua đêm Tiếp theo dùng micropipette hút 10% giống cho vào bình 20 ml môi trường LB broth tiếp tục nuôi cấy lắc 150 vịng/phút 37°C 12-15 Dịch ni cấy sử dụng làm giống cho thí nghiệm 3.7 Phương pháp khảo sát nhiệt độ thời gian ni cấy thích hợp cho khả sinh bacterocin từ Bacillus Tiến hành môi trường LB broth, dùng micropiptette hút ml dịch vi khuẩn chuẩn bị cho vào bình chứa 20 ml mơi trường ni cấy lắc 150 vịng/phút nhiệt độ khác nhau: 25°C, 28°C, 33°C, 37°C, 45°C Sau nuôi cấy, tiến hành thu dịch xử lí, đánh giá khả kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng để lựa chọn nhiệt độ thời gian mà dịch ni cấy có khả kháng khuẩn mạnh Giá trị nhiệt độ thời gian nuôi cấy sử dụng cho thí nghiệm [9] [10] 3.8 Phương pháp khảo sát giá trị pH thích hợp cho khả sinh bacterocin từ Bacillus Tiến hành môi trường LB broth, dùng micropiptette hút ml dịch nuôi cấy chuẩn bị cho vào bình chứa 20 ml môi trường điều chỉnh với giá trị pH khác nhau: 4.0, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0 Các bình ni cấy lắc 150 vịng/phút, nhiệt độ thời gian lựa chọn thí nghiệm trước Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu dịch đánh giá khả kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn giá trị pH thích hợp [9] [11] 3.9 Phương pháp khảo sát nguồn nitrogen thích hợp cho khả sinh bacterocin từ Bacillus Tiến hành môi trường MTCB (0.5 g MgSO4.7H2O, g NaH2PO4.2H2O, g Na2HPO4.12H2O) có bổ sung 1% glucose, dùng hút ml dịch nuôi cấy chuẩn bị cho vào bình chứa 20 ml mơi trường với 1% nguồn nitrogen khác (NH4Cl, NH4NO3, NaNO3, peptone, yeast extract, urea) Các bình ni cấy lắc 150 vòng/phút với giá trị pH 7.0, nhiệt độ, thời gian lựa chọn từ thí nghiệm trước Sau thời gian nuôi cấy, tiến hành thu dịch đánh giá khả kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn nguồn nitrogen thích [9] [11] [12] 3.10 Phương pháp khảo sát nồng độ NaCl thích hợp cho khả sinh bacterocin từ Bacillus Tiến hành môi trường LB broth môi trường (MTCB) (0.5 g MgSO4.7H2O, 3g NaH2PO4.2H2O, g Na2HPO4.12H2O) Dùng micropiptette hút ml dịch ni cấy chuẩn bị cho vào bình chứa 20 ml mơi trường có bổ sung nồng độ NaCl khác (0%, 0.5%, 1.0%, 1.5%, 2.0%) Các bình ni cấy lắc 150 vịng/phút với giá trị pH, nhiệt độ, thời gian lựa chọn từ thí nghiệm trước Sau thời gian ni cấy, tiến hành thu dịch đánh giá khả kháng vi sinh vật phương pháp khuếch tán giếng thạch để lựa chọn nồng độ thích hợp [13] 3.11 Phương pháp khảo sát nhiệt độ thời gian bảo quản dịch bacteriocin thô từ chủng Bacillus Dịch bacteriocin thô sau thu nhận bảo quản nhiệt độ khác (-60℃, -20℃, 5℃, nhiệt độ phịng) Hoạt tính kiểm tra phương pháp khuếch tán giếng thạch sau 10 ngày 30 ngày [14] Tổng kết kết nghiên cứu Đề tài nghiên cứu đã: - Phân lập định danh chủng Bacillus từ chế phẩm sinh học - Xác định khả kháng khuẩn, kháng mốc chủng - Xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh bacteriocin thô chủng Bacillus: thời gian nhiệt độ nuôi cấy, giá trị pH môi trường ban đầu, nguồn nitrogen, nồng độ NaCl - Xác định nhiệt độ thời gian thích hợp để bảo quản bacterioin thô thời gian ngắn Đánh giá kết đạt kết luận Đề tài hoàn thành tốt tất nội dung nghiên cứu đáp ứng mục tiêu nghiên cứu đề Các kết đạt từ đề tài tiền đề có giá trị tham khảo cao cho nghiên cứu sản xuất sau ứng dụng lĩnh vực chăn nuôi, dược phẩm, thực phẩm… Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) Chi Bacillus vi khuẩn có khả sản sinh nhiều hợp chất kháng khuẩn kháng mốc, có tiềm ứng dụng y học, chăn nuôi thực phẩm Chúng phân lập định danh chủng Bacillus từ chế phẩm sinh học B subtilis NN B lichenifomis KN, có nhiều tiềm ứng dụng tương lai Bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch, B subtilis NN chứng minh có khả ức chế Bacillus cereus, Salmonella enteritica subsp enteritica, Fusarium oxysporum, Fusarium equiseti, Penicilium chermesinum, tương tự B licheniformis KN ức chế phát triển B cereus, Salmonella enteritica subsp Enteritica, F oxysporum F equiseti Điều kiện ni cấy thích hợp cho 3.8.2 Nhiệt độ bảo quản thích hợp cho dung dịch bacteriocin thơ từ Bacillus licheniformis KN Hình 3.20 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính bacteriocin từ B licheniformis KN Kết cho thấy nhiệt độ bảo quản có ảnh hưởng đến khả kháng khuẩn bacteriocin từ B licheniformis KN khoảng thời gian bảo quản dài Bacteriocin sau 10 ngày bảo quản, nhiệt độ 33C 4C cịn hoạt tính gần 50% so với ban đầu nhiệt độ -20C -60C giữ nguyên hoạt tính kháng khuẩn Tại nhiệt độ -20C -60C sau thời gian 20 ngày bảo quản, bacteriocin cịn hoạt tính đến 77%-82% Ở ngày thứ 30, nhiêt độ 33C ức chế vi khuẩn đối kháng hồn tồn hoạt tính nhiệt độ mát âm sâu hoạt tính giữ khoảng gần 45% Theo kết thống kê với mức tin cậy 95%, nhiệt độ -20C -60C nhiệt độ bảo quản tốt cho khả kháng B cereus dịch nuôi cấy B licheniformis KN khoảng thời gian dài Từ thấy bateriocin thơ từ B licheniformis KN có hoạt tính ổn định 10 ngày bảo quản nhiệt độ -20C -60C Có thể thấy hoạt tính bacteriocin từ B licheniformis KN bền nhiều so với hoạt tính bacteriocin từ B subtilis NN Cụ thể bảo quản nhiệt độ lạnh sâu bacteriocin từ B licheniformis KN ổn định sau 10 ngày giảm mạnh sau đó, hoạt tính bacteriocin từ B subtilis NN ổn định tối thiểu 30 ngày 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Trong đề tài định danh hai chủng vi khuẩn Bacillus có chế phẩm tìm mơi trường ni cấy thích hợp cho khả sinh bacteriocin từ B subtilis NN cụ thể yếu tố thích hợp thời điểm 18 nuôi cấy 33-37°C, pH môi trường ban đầu 6.0 với 1% nguồn nitrogen peptone yeast extract 1% nguồn carbon glucose Môi trường ni cấy thích hợp cho khả sinh bacteriocin từ B licheniformis KN cụ thể nhiệt độ nuôi ủ 37°C thời gian nuôi cấy 15 với giá trị pH ban đầu môi trường 7.0 mơi trường LB bổ sung 1.0-1.5% NaCl thu hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật cao Ngồi đề tài cịn khảo sát nhiệt độ bảo quản thích hợp cho dịch bacteriocin thô từ B subtilis NN B lichenifofmis KN nhiệt độ -20°C -60°C Tuy đề tài chưa thể xác định cụ thể loại bacteriocin có dịch nuôi cấy Bacillus subtilis NN B licheniformis KN tiền đề cho nghiên cứu hợp chất cụ thể có dịch ni cấy 4.2 Kiến nghị Bên cạnh việc tìm yếu tố mơi trường thích hợp cho q trình sinh tổng hợp bacteriocin từ Bacillus subtilis NN B licheniformis KN, chúng tơi kiến nghị nên có nghiên cứu tối ưu hóa mơi trường với nhiều yếu tố khác chẳng hạn như: ảnh hưởng ion kim loại, ảnh hưởng nguồn vitamin, … để thu hợp chất kháng VSV có hoạt tính cao nhất; kéo dài thêm thời gian bảo quản dịch bacteriocin Ngoài cần có nghiên cứu phân tích SDS-PAGE, HPLC MALDI-TOF nhằm mục đích xác định rõ loại bacteriocin có dịch ni cấy từ có ứng dụng cụ thể tương lai 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] “Kháng Kháng Sinh Việt Nam.” https://www.who.int/vietnam/vi/healthtopics/antimicrobial-resistance [2] N Kiên, “Vi khuẩn kháng thuốc, nước đến chân!,” 2016 http://amr.moh.gov.vn/vikhuan-khang-thuoc-nuoc-da-den-chan/ [3] H T B Ngọc, N T Hằng, T Đức, H Q Cường, and L T Quỳnh, “Tình hình kháng kháng sinh vi khuẩn Gram âm thường gặp phân lập từ bệnh nhân điều trị bệnh viện Hữu Nghị Việt Tiệp, Hải Phịng,” TẠP CHÍ Y HỌC DỰ PHÒNG, vol 29, no 11, p 131, 2019, [Online] Available: http://www.tapchiyhocduphong.vn/tap-chi-y-hocdu-phong/2019/11/tinh-hinh-khang-khang-sinh-cua-vi-khuan-gram-am-thuong-gapphan-lap-tu-benh-nhan-o81E2086D.html [4] B P Willing, S L Russell, and B B Finlay, “Shifting the balance : antibiotic effects on host-microbiota munualism,” Nat Publ Gr., vol 9, no 4, pp 233–243, 2011, doi: 10.1038/nrmicro2536 [5] A D Discovery, “Effective antibacterials: at what cost? The economics of antibacterial resistance and its control,” no June, pp 1948–1953, 2011, doi: 10.1093/jac/dkr260 [6] S C Yang, C H Lin, C T Sung, and J Y Fang, “Antibacterial activities of bacteriocins: Application in foods and pharmaceuticals,” Front Microbiol., vol 5, no MAY, pp 1–10, 2014, doi: 10.3389/fmicb.2014.00241 [7] Đ S Mai, T N Nam, and B H Quân, THỰC HÀNH VI SINH VẬT HỌC [8] E Yang, L Fan, Y Jiang, C Doucette, and S Fillmore, “Antimicrobial activity of bacteriocin-producing lactic acid bacteria isolated from cheeses and yogurts,” AMB Express, vol 2, no pp 1–12, 2012, doi: 10.1186/2191-0855-2-48 [9] Đ T Hiền, “Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp bacteriocin vi khuẩn Bacillus subtilis thử nghiệm khả đối kháng chủng Vibrio spp.,” Tạp chí khoa học đại học Thủ Dầu Một, vol 2, no 37, 2018 [10] C Corvey, T Stein, S Düsterhus, M Karas, and K D Entian, “Activation of subtilin precursors by Bacillus subtilis extracellular serine proteases subtilisin (AprE), WprA, 43 and Vpr,” Biochemical and Biophysical Research Communications, vol 304, no pp 48–54, 2003, doi: 10.1016/S0006-291X(03)00529-1 [11] P T Hương and vũ văn Hạnh, “Lựa chọn điều kiện lên men cho sinh trưởng chủng Bacillus subtilis BSVN15 ứng dụng sản xuất chế phẩm probiotic chăn ni,” Tạp chí Công nghệ Sinh học, vol 16, no 1, pp 167–172, 2018 [12] V K Dung, H T Thủy, and N T Nhân, “Nghiên cứu sản xuất levan từ Bacillus subtilis natto D,” Tạp chí khoa học cơng nghệ lâm nghiệp, pp 11–18, 2017 [13] E V Pingitore, E M Hebert, F Sesma, and M E Nader-Macías, “Influence of vitamins and osmolites on growth and bacteriocin production by Lactobacillus salivarius CRL 1328 in a chemically defined medium,” Can J Microbiol., vol 55, no 3, pp 304–310, 2009, doi: 10.1139/W08-092 [14] N L Md Sidek, M Halim, J S Tan, S Abbasiliasi, S Mustafa, and A B Ariff, “Stability of bacteriocin-like inhibitory substance (BLIS) produced by pediococcus acidilactici kp10 at different extreme conditions,” Biomed Res Int., vol 2018, 2018, doi: 10.1155/2018/5973484 [15] W L Nicholson, “Roles of Bacillus endospores in the environment,” Cell Mol Life Sci., vol 59, no 3, pp 410–416, 2002, doi: 10.1007/s00018-002-8433-7 [16] J Errington, “Regulation of endospore formation in Bacillus subtilis,” Nat Rev Microbiol., vol 1, no 2, pp 117–126, 2003, doi: 10.1038/nrmicro750 [17] M E Sanders, L Morelli, and T A Tompkins, “Sporeformers as Human Probiotics: Bacillus, Sporolactobacillus, and Brevibacillus,” Compr Rev Food Sci Food Saf., vol 2, no 3, pp 101–110, 2003, doi: 10.1111/j.1541-4337.2003.tb00017.x [18] M A Riley and J E Wertz, “Bacteriocins: Evolution, Ecology, and Application,” Annu Rev Microbiol., vol 56, no 1, pp 117–137, 2002, doi: 10.1146/annurev.micro.56.012302.161024 [19] kenji sonomoto Mami nishie, Jun-ichi nagao, “Antibacterial Peptides ‘Bacteriocin’: An overview of their diverse characteristics and applications,” Biocontrol Sci., vol 17, no 1, pp 1–16, 2012 44 [20] N C K Heng, P A Wescombe, J P Burton, R W Jack, and J R Tagg, “The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria,” Bacteriocins, pp 45–92, 2007, doi: 10.1007/978-3-540-36604-1_4 [21] G Bierbaum and H.-G Sahl, “Lantibiotics: Mode of Action, Biosynthesis and Bioengineering,” Curr Pharm Biotechnol., vol 10, no 1, pp 2–18, 2009, doi: 10.2174/138920109787048616 [22] J Nissen-Meyer, P Rogne, C Oppegard, H Haugen, and P Kristiansen, “StructureFunction Relationships of the Non-Lanthionine-Containing Peptide (class II) Bacteriocins Produced by Gram-Positive Bacteria,” Curr Pharm Biotechnol., vol 10, no 1, pp 19–37, 2009, doi: 10.2174/138920109787048661 [23] T Stein, “Bacillus subtilis antibiotics: Structures, syntheses and specific functions,” Mol Microbiol., vol 56, no 4, pp 845–857, 2005, doi: 10.1111/j.13652958.2005.04587.x [24] J Biochem, K Babasaki, T Takao, and Y Shimonishi, “Babasaki K 1985 Subtilosin A.pdf,” vol 98, no 3, pp 585–603, 1985 [25] T S B Clarisse S Compaoré, Dennis S Nielsen, Labia I I Ouoba, “Co-production of surfactin and a novel bacteriocin by Bacillus subtilis subsp subtilis H4 isolated from Bikalga, an African alkaline Hibiscus sabdariffa seeds fermented condiment.” 2013, doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2013.01.013 FOOD [26] S G Lee and H C Chang, “Purification and characterization of mejucin, a new bacteriocin produced by Bacillus subtilis SN7,” LWT - Food Sci Technol., vol 87, pp 8–15, 2018, doi: 10.1016/j.lwt.2017.08.044 [27] P Pattnaik, J K Kaushik, S Grover, and V K Batish, “Purification and characterization of a bacteriocin-like compound (Lichenin) produced anaerobically by Bacillus licheniformis isolated from water buffalo,” J Appl Microbiol., vol 91, no 4, pp 636–645, 2001, doi: 10.1046/j.1365-2672.2001.01429.x [28] L He, W L Chen, and Y Liu, “Production and partial characterization of bacteriocinlike pepitdes by Bacillus licheniformis ZJU12,” Microbiol Res., vol 161, no 4, pp 321–326, 2006, doi: 10.1016/j.micres.2005.12.002 45 [29] A Ansari, A Aman, N N Siddiqui, S Iqbal, and S A Ul Qader, “Bacteriocin (BACIB17): Screening, isolation and production from Bacillus subtilis KIBGE IB-17,” Pakistan Journal of Pharmaceutical Sciences, vol 25, no pp 195–201, 2012 [30] A Alvarez-Ordóđez M Begley, C Kiera, “Investigation of the Antimicrobial Activity of Bacillus licheniformis Strains Isolated from Retail Powdered Infant Milk Formulae,” Probiotics Antimicrob Proteins, vol 6, no 1, pp 32–40, 2014, doi: 10.1007/s12602013-9151-1 [31] X Liu, J Lee, S Jeong, K Cho, “Properties of a bacteriocin produced by Bacillus subtilis EMD4 isolated from Ganjang (Soy sauce),” J Microbiol Biotechnol., vol 25, no 9, pp 1497–1505, 2015, doi: 10.4014/jmb.1502.02037 [32] N Khochamit, S Siripornadulsil, P Sukon, and W Siripornadulsil, “Ac ce p te d t,” Microbiol Res., 2014, doi: 10.1016/j.micres.2014.09.004 [33] A M Asaturova, A I Homyak, N S Tomashevich, “Conditions for the cultivation of new bacillus bacteria being micro bioproduct producers,” J Pure Appl Microbiol., vol 9, no 4, pp 1–8, 2015 [34] K.-H S and W B W Paul De Vos, George M Garrity, Dorothy Jones, Noel R Krieg, Wolfgang Ludwig, Fred A Rainey, Ed., BERGEY’S MANUAL OF Systematic Bacteriology, vol 2009 [35] “Taxomony Browser (Bacillus subtilis group).” https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi?id=653685 [36] M S Salkinoja-Salonen, R Vuorio, M A Andersson, “Toxigenic strains of Bacillus licheniformis related to food poisoning,” Appl Environ Microbiol., vol 65, no 10, pp 4637–4645, 1999, doi: 10.1128/AEM.65.10.4637-4645.1999 [37] L Martirani, M Varcamonti, G Naclerio, and M De Felice, “Purification and partial characterization of bacillocin 490, a novel bacteriocin produced by a thermophilic strain of Bacillus licheniformis,” Microb Cell Fact., vol 1, pp 1–5, 2002, doi: 10.1186/14752859-1-1 [38] N Kayalvizhi and P Gunasekaran, “Production and characterization of a low46 molecular-weight bacteriocin from Bacillus licheniformis MKU3,” Lett Appl Microbiol., vol 47, no 6, pp 600–607, 2008, doi: 10.1111/j.1472-765X.2008.02473.x [39] F Cladera-Olivera, G R Caron, and A Brandelli, “Bacteriocin-like substance production by Bacillus licheniformis strain P40,” Lett Appl Microbiol., vol 38, no 4, pp 251–256, 2004, doi: 10.1111/j.1472-765X.2004.01478.x [40] T Anthony, T Rajesh, N Kayalvizhi, and P Gunasekaran, “Influence of medium components and fermentation conditions on the production of bacteriocin(s) by Bacillus licheniformis AnBa9,” Bioresour Technol., vol 100, no 2, pp 872–877, 2009, doi: 10.1016/j.biortech.2008.07.027 [41] D.-H P and D.-O K Sung-Sub Jung1, Jung-I Choi1, Woo-Hong Joo2, Hyun-Hyo Suh3, Ae-Sil Na, Yong-Kweon Cho, Ja-Young Moon, Kwon-Chul Ha, “간장에서 분리한 Bacillus licheniformis가 생산하는 박테리오신의 특성 및 정제,” J Life Sci., vol 19, no 7, pp 994–1002, 2009 47 PHỤ LỤC Phụ lục A Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến khả sinh bacteriocin Bacillus subtilis NN 48 Phụ lục B Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian nuôi cấy đến khả sinh bacteriocin Bacillus licheniformis KN Phụ lục C Ảnh hưởng giá trị pH nuôi cấy đến khả sinh bacteriocin B subtilis NN 49 Phụ lục D Ảnh hưởng giá trị pH nuôi cấy đến khả sinh bacteriocin B licheniformis KN Phụ lục E Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến khả sinh bacteriocin B subtilis NN Phụ lục F Ảnh hưởng nguồn nitrogen đến khả sinh bacteriocin B licheniformi KN 50 Phụ lục G Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh bacteriocin B subtilis NN Phụ lục H Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến khả sinh bacteriocin B licheniformis KN Phụ lục I Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian bảo quản bacteriocin từ B subtilis NN 51 Phụ lục K Ảnh hưởng nhiệt độ thời gian bảo quản bacteriocin từ B licheniformis KN 52 PHẦN III PHỤ LỤC ĐÍNH KÈM Hợp đồng thực đề tài nghiên cứu khoa học Thuyết minh đề tài phê duyệt Quyết định nghiệm thu Hồ sơ nghiệm thu (biên họp, phiếu đánh giá, bảng tổng hợp điểm, giải trình, phiếu phản biện) Sản phẩm nghiên cứu (bài báo, vẽ, mô Hình .) 53 Sản phẩm nghiên cứu  Sản phẩm dạng I: Giống vi sinh vật Giống B subtilis NN B licheniformis KN lưu trữ eppendorf chứa glycerol 50% -60C phịng T3.08 54  Sản phẩm II: Quy trình nuôi cấy thu nhận bacteriocin từ chủng B subtilis (B subtilis NN B licheniformis KN) Thuyết minh quy trình Hoạt hóa giống: giống vi khuẩn hoạt hóa mơi trường LB agar, ni ủ 37°C 24 h Kiểm tra độ chủng, sử dụng khuẩn lạc đặc trưng nuôi cấy môi trường LB broth 37°C với tốc độ 150v/p 24 h Nuôi ủ: bổ sung 10% giống vào môi trường với thành phần thích hợp cho lồi vi khuẩn, nuôi ủ 33°C (B licheniformis) 37°C (B subtilis) với tốc độ 150v/p 15 h (B licheniformis) 18 h (B subtilis) Thu dịch bacteriocin thô: sau thời gian nuôi ủ, dịch nuôi cấy chia nhỏ vào enppendorf, sau ly tâm 4°C, 13000 v/p 20 phút Phần dịch chia vào eppendorf khác Bảo quản: eppendorf chứa phần dịch bảo quản -20°C -60°C 55 ... cho khả sinh bacteriocin từ Bacillus nhiều tiềm có ý nghĩa khoa học lẫn thực tiễn Vì lý tơi định thực đề tài ? ?Tuyển chọn xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho chủng Bacillus subtilis có khả sản. .. kiện ni cấy thích hợp cho sản sinh bacteriocin từ chủng vi khuẩn Mục tiêu Xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sản sinh bacteriocin từ chủng Bacillus Với mục tiêu đề tài gồm có nội dung nghiên... đã: - Phân lập định danh chủng Bacillus từ chế phẩm sinh học - Xác định khả kháng khuẩn, kháng mốc chủng - Xác định điều kiện ni cấy thích hợp cho khả sinh bacteriocin thô chủng Bacillus: thời