Tuyển chọn và xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase của các chủng vi nấm biển phân lập từ vịnh Nha Trang và vịnh Vân Phong, tỉnh Khánh Hòa

Vi nấm biển đóng vai trò quan trọng trong các hệ sinh thái biển và cung cấp nhiều sản phẩm có giá trị trong công nghiệp. bài viết này tuyển chọn chủng vi nấm biển sinh amylase và xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận enzyme từ các chủng này. Trong tổng số 160 chủng vi nấm biển thu thập được, tất cả các chủng nấm men không thể hiện hoạt tính amylase (0/112 chủng); trong khi đó, các chủng nấm mốc có hoạt tính amylase cao với tỷ lệ 70,8% (34/48 chủng).

Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 129, Số 1C, 59–67, 2020 pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 TUYỂN CHỌN VÀ XÁC ĐỊNH ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY THÍCH HỢP CHO SINH TỔNG HỢP AMYLASE CỦA CÁC CHỦNG VI NẤM BIỂN PHÂN LẬP TỪ VỊNH NHA TRANG VÀ VỊNH VÂN PHONG, TỈNH KHÁNH HÒA Phạm Thu Thủy, Đinh Thị Sở, Nguyễn Văn Duy* Viện Công nghệ sinh học Môi trường, Trường Đại học Nha Trang, Nguyễn Đình Chiểu, Nha Trang, Việt Nam * Tác giả liên hệ Nguyễn Văn Duy (Ngày nhận bài: 16-12-2019; Ngày chấp nhận đăng: 14-04-2020) Tóm tắt Vi nấm biển đóng vai trò quan trọng hệ sinh thái biển cung cấp nhiều sản phẩm có giá trị công nghiệp Nghiên cứu tuyển chọn chủng vi nấm biển sinh amylase xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp để thu nhận enzyme từ chủng Trong tổng số 160 chủng vi nấm biển thu thập được, tất chủng nấm men hoạt tính amylase (0/112 chủng); đó, chủng nấm mốc có hoạt tính amylase cao với tỷ lệ 70,8% (34/48 chủng) Trong số này, chủng DM12M có hoạt độ amylase cao (13,0 U/mL) Môi trường nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chủng Czapek–Dox cải tiến, bổ sung 1% tinh bột tan, 0,3% NaNO3, 0,5% NaCl, pH 6,0 với thời gian nuôi cấy ngày 30 C Ở điều kiện này, hoạt độ amylase chủng DM12M đạt 58,4 U/mL, cao khoảng 4,5 lần so với trước tối ưu hóa Chủng DM12M có trình tự đoạn gen ITS15,8S-ITS2 tương đồng 99,8–100% với chủng loài Aspergillus aculeatus nên thuộc lồi Nghiên cứu cung cấp thông tin khoa học yếu tố ảnh hưởng đến khả sản xuất amylase ngoại bào vi nấm biển mở tiềm ứng dụng chúng cơng nghiệp Từ khóa: amylase, vi nấm biển, Aspergillus aculeatus, vịnh Nha Trang, vịnh Vân Phong Selection and culture condition optimisation for amylase biosynthesis of marine fungal strains isolated from Nha Trang Bay and Van Phong Bay, Khanh Hoa province Pham Thu Thuy, Dinh Thi So, Nguyen Van Duy* Institute of Biotechnology and Environment, Nha Trang University, Nguyen Dinh Chieu St., Nha Trang, Vietnam * Correspondence to Nguyen Van Duy (Received: 16 December 2019; Accepted: 14 April 2020) Abstract Marine fungi play an important role in marine ecosystems and provide numerous valuable industrial products This study screens for amylase-producing marine fungi strains and studies the appropriate culture conditions to obtain enzymes From 160 isolated strains, all the yeast strains not have amylase activity (0/112 strains), while the molds have amylase activity with a high rate at 70.8% (34/48 strains) Among these molds, the DM12M strain has the highest amylase activity (13.0 U/mL) DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5449 59 Phạm Thu Thủy CS Suitable culture conditions for amylase production of this strain are the modified Czapek–Dox medium supplemented with 1% soluble starch, 0.3% NaNO3, 0.5% NaCl, and days incubation at pH 6.0 and 30 C Under these conditions, the amylase activity of the DM12M strain reaches 59.0 U/mL, approximately 4.5 times higher than that under pre-optimal conditions The DM12M strain has the ITS15.8S-ITS2 nucleotide sequence of 99.8–100% similarity to the strain of Aspergillus aculeatus, revealing that it may belong to this species The research provides scientific data on the factors affecting the ability of the marine fungi to produce extracellular amylase and opens up their potential for industrial applications Keywords: amylase, Aspergillus aculeatus, marine fungi, Nha Trang Bay, Van Phong Bay Mở đầu amylase [5] Wang cs sàng lọc khả sinh Trong thị trường công nghiệp enzyme, am- cho sinh trưởng sáu chủng vi nấm biển đại ylase enzyme quan trọng chiếm thị phần lớn diện thuộc sưu tập vi nấm biển thuộc Trung tâm với 30% tổng thị phần enzyme giới nghiên cứu biển GEOMAR, Kiel, Cộng hòa liên [1] Amylase ứng dụng rộng rãi công bang Đức Kết cho thấy số 19 nguồn nghiệp thực phẩm, sản xuất thức ăn gia súc, chất cacbon khác nhau, nguồn cacbon phù hợp cho tẩy rửa, xử lý môi trường Để ứng dụng sinh trưởng sáu chủng tinh bột, cơng nghiệp, enzyme nói chung amylase nói laminarin xylan [6] riêng cần có hoạt tính cao ổn định thích ứng với số điều kiện sản xuất chịu nhiệt pH enzyme ngoại bào nguồn cacbon thích hợp Tại Việt Nam, nhiều nghiên cứu nhằm khai thác tiềm vi sinh vật biển thực hiện, công bố amylase từ vi nấm biển Trên giới có nhiều cơng trình nghiên hạn chế Phần lớn nghiên cứu cứu amylase từ vi nấm biển Điển hình có amylase từ vi nấm tập trung vào chủng nấm có Mohapatra cs sàng lọc chủng Mucor sp nguồn gốc cạn Chỉ có số nghiên cứu sinh amylase từ bọt biển Spirastrella sp sử dụng amylase từ vi nấm nước lợ thực Điển môi trường muối tối thiểu chứa 1% tinh bột tan [2] hình, Nguyễn Thị Thanh Bình phân lập Li cs sàng lọc chủng nấm men biển 409 chủng nấm mốc từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Aureobasidium pullulans N13d sinh amylase ngoại 261 chủng có khả sinh amylase bào từ trầm tích biển sâu Thái Bình Dương sử (63,81%) [7] Phạm Thị Ngọc Lan Huỳnh Ngọc dụng môi trường chứa 1% tinh bột tan pha Thành tuyển chọn 53 chủng nấm mốc từ nước biển, pH 4,0 [3] Sahoo cs sàng lọc hoạt ao nuôi tôm Thừa Thiên Huế Chỉ 3/53 chủng tính amylase nấm mốc phân lập từ mẫu có khả sinh amylase với hoạt tính mức trầm tích rừng ngập mặn Ấn Độ Nghiên cứu trung bình [8] phân lập 40 chủng nấm mốc, 1/2 số chủng có hoạt tính amylase ngoại bào Trong số chủng Penicillium citrinum MSF-9 sản sinh amylase mạnh điều kiện môi trường nuôi cấy chứa 1% tinh bột tan, 1% NaCl, pH [4] Gần đây, Lanka cs phân lập mẫu nước ven biển Machilipatnam Ấn Độ sàng lọc chủng Fusarium sp ưa muối có tiềm sản xuất enzyme ngoại bào mạnh có 60 Điều cho thấy amylase từ vi nấm biển có tiềm ứng dụng lớn, nghiên cứu theo hướng Việt Nam hạn chế Mục tiêu nghiên cứu tuyển chọn chủng vi nấm biển có khả sinh amylase từ nước biển ven bờ vịnh Nha Trang vịnh Vân Phong, nghiên cứu điều kiện môi trường nuôi cấy thích hợp để thu nhận amylase từ chủng pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 129, Số 1C, 59–67, 2020 Vật liệu phương pháp vào môi trường MT3, ni lắc 120 vịng/ phút 28 2.1 Chủng vi nấm biển sinh amylase Tổng số 160 chủng vi nấm biển phân 2.3 C vòng năm ngày, nhằm cảm ứng khả lập từ nước biển ven bờ 11 vị trí thuộc vịnh Vân Xác định hoạt tính amylase phương pháp đo đường kính vịng phân giải Phong vịnh Nha Trang khoảng thời gian Các chủng vi nấm nuôi cấy môi từ tháng đến tháng 8/2018 Các chủng trường thạch MT3 28 C Sau ngày nuôi cấy, lưu giữ glycerol 20% –70 C thạch nghiêng 4–8 C Phịng thí nghiệm Vi sinh, đĩa thạch lấy bổ sung 10 mL thuốc thử Lugol, để phút đo đường kính vịng phân giải Viện Cơng nghệ sinh học Môi trường, Trường chất thước đo xăng ti mét Hoạt tính Đại học Nha Trang enzyme xác định dựa vào hiệu số D – d, 2.2 D đường kính vịng phân giải (mm), d Nuôi cấy vi nấm Các chủng vi nấm hoạt hóa mơi đường kính khuẩn lạc (mm) (MT1) nấm mốc môi trường thạch YPD Xác định hoạt độ amylase phương pháp DNS (Yeast Extract Peptone Dextrose, Difco) (MT2) đối Hoạt độ amylase chủng nấm mốc với nấm men 28 C 1–3 ngày nấm xác định theo phương pháp DNS [9] Một men 1–10 ngày tùy vào thời gian sinh trưởng đơn vị hoạt độ enzyme (U/mL) định nghĩa chủng vi nấm mốc kích thước lượng enzyme cần thiết giải phóng mg khuẩn lạc đạt 2,5–3,0 cm, sau sử dụng cho maltose từ tinh bột tan ba phút pH 6,9 mục đích 20 C Hoạt độ enzyme tính theo công thức trường thạch PDA (Potato Dextrose Agar, Difco) Nhằm cảm ứng khả sinh tổng hợp 2.4 sau: amylase, chủng vi nấm nuôi cấy môi trường Czapek–Dox cải tiến có bổ sung tinh bột tan làm chất cảm ứng (MT3) Thành phần môi trường bao gồm NaNO3 3,0 g/L, K2HPO4 1,0 g/L, MgSO4·7H2O 0,5 g/L, KCl 0,5 g/L, FeSO4·7H2O 0,01 g/L, tinh bột tan 10 g/L, pH 6,5 ± 0,2, pha 50% nước biển Môi trường thạch bổ sung thêm 1,5% agar Các môi trường hấp khử trùng 121 °C 15 phút, sau bổ sung kháng sinh Hoạt độ enzyme (U/mL) = (hàm lượng maltose giải phóng × df)/V df độ pha lỗng dịch enzyme thơ, V thể tích dịch enzyme thơ sử dụng (mL) lượng maltose giải phóng (mg) xác định dựa vào đường chuẩn maltose 2.5 Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase ampicillin 0,05% streptomycin sulfate 0,075% Các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh Các chủng nấm mốc cấy chấm điểm (một tổng hợp amylase chủng vi nấm nghiên điểm) chủng nấm men cấy vạch (ba cứu khảo sát theo bước gồm thời vạch) lên đĩa thạch, sau ủ 28 C năm gian ni cấy, nhiệt độ nuôi cấy, pH môi trường, ngày nguồn cacbon, nguồn nitơ, độ mặn, kết Đối với môi trường lỏng, trước tiên chủng nấm mốc hoạt hố mơi trường thơng số tối ưu từ bước trước áp dụng cho thí nghiệm MT1 đường kính khuẩn lạc đạt 2,5–3,0 cm; sau dùng dao vơ trùng cắt miếng khuẩn lạc, kích thước 1/10 khuẩn lạc, bổ sung DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5449 61 Phạm Thu Thủy CS 2.6 Định danh chủng vi nấm giải trình tự đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 5] Từ kết trên, 10 chủng nấm mốc có đường DNA tổng số vi nấm tách chiết dụng cho thí nghiệm kính vịng phân giải tinh bột lớn sử DNA miniprep kit (BioBasic, Canada) theo hướng Hoạt độ amylase chủng vi nấm biển nghiên cứu dẫn nhà sản xuất bảo quản –20 C Để đánh giá xác khả sinh kit EZ–10 spin column plant genomic 3.2 Các mồi sử dụng cho phản ứng PCR amylase 10 chủng nấm mốc làm sở cho ITS1F_KYO2 (5’-TAG AGG AAG TAA AAG TCG trình tuyển chọn tiếp theo, tiến hành nuôi TAA-3’) [10] ITS4 (5’-TCC TCC GCT TAT TGA cấy chủng môi trường lỏng MT3 TAT GC-3’) [10] Hỗn hợp phản ứng PCR bao gồm 28 °C Sau ngày nuôi cấy, dịch enzyme thô 9,5 µL nước, µL mồi (10 mM), µL DNA (2– thu nhận để xác định hoạt độ enzyme theo phương 20 ng), 12,5 µL MyTaq Mix 2X (Bioline, Mỹ) pháp DNS Chu trình nhiệt thực sau: 93 C phút, 35 chu kỳ 93 C 30 giây, 56–58 C 30 giây, 72 C 30 giây kết thúc 72 C 10 phút Sản phẩm phản ứng PCR điện di kiểm tra gel agarose 1,2% Trong số 10 chủng nấm mốc tuyển chọn, chủng DM12M, TB8M DW7M có khả phân giải tinh bột mạnh với hoạt độ enzyme tương ứng đạt 13,0; 12,9 10,6 U/mL (Hình 1) Mohapatra cs sàng lọc chủng Mucor sp Sản phẩm PCR gửi giải trình tự sinh amylase từ bọt biển Spirastrella sp sử dụng công ty Macrogen (Hàn Quốc) Trình tự DNA mơi trường muối tối thiểu chứa 1% tinh bột tan xử lý phần mềm MEGA [11], Geneious Chủng sinh enzyme mạnh môi trường 10.2.2 (Biomatters, New Zealand) công cụ pH 5,0 với hoạt độ đạt 41,84 U/mL [2] Li BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ BLAST) cs sàng lọc chủng nấm men biển 2.7 Xử lý số liệu Aureobasidium pullulans N13d sinh amylase ngoại bào mạnh từ mẫu trầm tích biển sâu Thái Các số liệu phân tích thống kê Bình Dương sử dụng môi trường chứa 1% tinh bột phần mềm SPSS 16 (SPSS Inc., Chicago, Mỹ), tan pha nước biển, pH 4,0 Amylase thu khác biệt coi có ý nghĩa thống kê với từ chủng có hoạt tính cao (10 U/mL) mức ý nghĩa p < 0,05 nuôi cấy 28 °C 56 [3] Điều cho thấy hoạt tính enzyme thu chủng nấm Kết thảo luận 3.1 Sàng lọc hoạt tính amylase ngoại bào chủng vi nấm biển khác nhau, tuỳ thuộc vào nguồn gốc phân lập Trong số 160 chủng vi nấm biển (112 chủng nấm men 48 chủng nấm mốc) phân lập, tất chủng nấm men khơng thể hoạt tính amylase, có 34/48 (70,8%) chủng nấm mốc có hoạt tính amylase Nấm mốc biết đến nguồn sản xuất enzyme ngoại bào mạnh Vì vậy, nhiều nghiên cứu nhằm sàng lọc hoạt tính amylase ngoại bào từ vi nấm biển thực [2, 4, 62 Hình Hoạt độ amylase trung bình 10 chủng nấm mốc tuyển chọn (Các chữ a–d cho biết khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05) pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 129, Số 1C, 59–67, 2020 điều kiện nuôi cấy Từ kết nghiên cứu trên, dần đạt tối ưu giá trị pH 6,0 với hoạt độ đạt 30 chọn chủng DM12M, DW7M TB8M U/mL sau giảm dần giá trị pH cao cho nghiên cứu (Hình 4) Mahapatra Banerjee đưa kết 3.3 luận tương tự chủng Aspergillus aculeatus Thời gian ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chủng DM12M, DW7M TB8M Khi nuôi cấy 28 °C, chủng nấm mốc nghiên cứu có hoạt độ amylase cao sau ngày ni cấy, chủng DM12M có khả sinh enzyme mạnh nhất, đạt 13,7 U/mL (Hình 2) Từ ngày thứ trở hoạt độ enzyme giảm dần, mơi trường tạo sản phẩm thứ cấp ức chế sinh trưởng cạn kiệt chất dinh dưỡng Kết tương đồng với nghiên cứu Ominyi khả sinh amylase chủng nấm mốc Aspergillus, Mucor Rhizopus, với khả sản sinh amylase đạt hoạt độ cao sau ngày [12] Vì vậy, thời gian nuôi cấy ngày sử dụng cho thí nghiệm 3.4 Hình Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh amylase chủng nấm mốc DM12M, DW7M TB8M (Các chữ a–d cho biết khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05) Nhiệt độ nuôi cấy thích hợp cho q trình sinh tổng hợp amylase chủng DM12M, DW7M TB8M Nhiệt độ có ảnh hưởng lớn đến khả sinh amylase ngoại bào chủng nấm Cụ thể, chủng DM12M, DW7M TB8M sinh amylase mạnh 30, 37 28 C, xét tổng thể, khả sinh amylase chủng DM12M mạnh so với chủng cịn lại (Hình 3) Vì vậy, chủng DM12M với nhiệt độ nuôi cấy 30 C lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu điều kiện nuôi cấy khác nhằm thu nhận enzyme Mahapatra Banerjee, trình tối ưu hố điều kiện ni cấy nhằm thu nhận amylase từ chủng Aspergillus aculeatus DBF9, sử dụng môi trường Czapek–Dox lỏng, bổ sung 1% tinh bột tan nhận thấy chủng sinh enzyme tối ưu 30 C [13] Kết tương đồng với nghiên cứu chủng DM12M định danh Aspergillus aculeatus (kết trình bày mục tiếp theo) 3.5 DBF9 [13] pH môi trường ni thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chủng DM12M Khi thay đổi pH môi trường từ đến 8, khả sinh amylase chủng DM12M tăng DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5449 Hình Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả sinh amylase chủng DM12M, DW7M TB8M (Các chữ a–i cho biết khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05) Hình Ảnh hưởng pH mơi trường nuôi cấy đến hoạt độ amylase chủng DM12M (Các chữ a–c cho biết khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05) 63 Phạm Thu Thủy CS 3.6 Nguồn cacbon thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chủng DM12M Hình cho thấy hoạt độ amylase chủng DM12M đạt cao (30 U/mL) sử dụng nguồn cacbon tinh bột tan 1% Điều chứng tỏ tinh bột tan nguồn cacbon phù hợp nguồn chất cảm ứng tốt để kích thích sản sinh amylase chủng Kết tương đồng với số nghiên cứu trước tinh bột tan nguồn cacbon thích hợp cho q trình sinh amylase nhiều chủng nấm mốc biển [6] 3.7 Nguồn nitơ thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chủng DM12M Hình Ảnh hưởng nguồn cacbon đến hoạt độ amylase chủng DM12M (Các chữ a–c cho biết khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05) Đối với 0,3% nguồn nitơ vô khác bổ sung vào mơi trường ni cấy NaNO3 a) thích hợp cho q trình sản xuất amylase ngoại bào chủng DM12M với hoạt độ đạt 40,0 U/mL (Hình 6a) Chúng tơi tiếp tục tối ưu nguồn nitơ hỗn hợp cách bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy 0,3% nguồn nitơ hữu khác gồm pepton, trypton, urê cao nấm men Hoạt độ amylase chủng DM12M đạt 30–40 U/mL, tức khơng có thay đổi đáng kể so với môi trường ban đầu bổ sung nguồi nitơ vô b) (Hình 6b) Vì vậy, NaNO3 chọn nguồn nitơ mơi trường ni cấy cho thí nghiệm chủng DM12M 3.8 Nồng độ NaCl NaNO3 thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chủng DM12M Độ mặn yếu tố quan trọng có ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển vi nấm biển Trong thí nghiệm trên, chủng nấm nuôi cấy môi trường chứa 50% nước biển (độ mặn 2–3,6%), hay môi trường nuôi cấy Hình Ảnh hưởng nguồn nitơ đến hoạt độ amylase chủng DM12M: (a) nitơ vô cơ; (b) nitơ hữu (Các chữ a–d cho biết khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05) chứa 1–1,8% NaCl Để xác định xác độ mặn thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chủng DM12M, tiến hành nuôi cấy chủng mơi trường khơng bổ sung nước biển có bổ sung NaCl nồng độ khác Khi bổ sung thêm 0,5% NaCl vào môi trường nuôi cấy, hoạt độ amylase chủng DM12M đạt cao 64 (58,4 U/mL) khác biệt có ý nghĩa thống kê so với điều kiện nồng độ NaCl cao (Hình 7a) Kết khác với nghiên cứu Sahoo cs khả sinh amylase vi nấm rừng ngập mặn, nồng độ NaCl thích hợp 1% [4] pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 129, Số 1C, 59–67, 2020 Các kết thu ứng dụng a) để tiếp tục xác định nồng độ NaNO3 thích hợp cho sinh tổng hợp amylase chủng nghiên cứu Khi bổ sung 0,6% NaNO3 vào mơi trường ni cấy hoạt độ amylase chủng DM12M đạt cao (63,2 U/mL) (Hình 7b) Hoạt độ enzyme thu cao so với điều kiện môi trường chứa 0,3% NaNO3 (59,0 U/mL), khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Do vậy, xét mặt kinh tế, nồng độ NaNO3 0,3% lựa chọn 3.9 b) Định danh chủng nấm mốc DM12M Sản phẩm PCR đoạn gen ITS1-5,8S-ITSS2 chủng DM12M thu nhận có kích thước khoảng 580 bp Kết giải phân tích trình tự gen cho thấy trình tự đoạn gen ITS1-5,8S-ITSS2 chủng DM12M có độ tương đồng cao đạt từ 99,8% đến 100% so với chủng thuộc loài Aspergillus aculeatus (mã số GenBank tương ứng KY320594, EU833205, EU326206 AJ279995), Hình Ảnh hưởng nồng độ NaCl (a) NaNO3 (b) đến hoạt độ amylase chủng DM12M (Các chữ a–c cho biết khác biệt có ý nghĩa thống kê với p < 0,05) có độ tương đồng thấp (99,7%) với chủng loài A violaceofuscus (MG682503) A japonicus (KC128815) (Bảng 1) Như vậy, chủng DM12M thuộc lồi Aspergillus aculeatus Kết tương đồng với đặc điểm hình thái chủng chúng tơi mơ tả từ nghiên cứu trước Bảng So sánh trình tự đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 chủng DM12M với trình tự tương đồng cao Genbank Điểm xếp hạng Mã số Genbank Tên loài Tỷ lệ tương đồng (%) Tỷ lệ che phủ (%) 1064.79 KY320594 Aspergillus aculeatus 100 100 1064.79 EU833205 Aspergillus aculeatus 100 100 1064.79 EU326206 Aspergillus aculeatus 100 100 1057.4 AJ279995 Aspergillus aculeatus 99,8 100 1053.71 MG682503 Aspergillus violaceofuscus 99,7 100 1053.71 KC128815 Aspergillus japonicus 99,7 100 DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5449 65 Phạm Thu Thủy CS Hiện nay, giới có nhiều nghiên cứu khả sinh amylase chi Aspergillus, công bố amylase từ A aculeatus hạn chế Khokhar cs so sánh khả sinh amylase cellulase chủng nấm mốc thuộc chi Aspergillus Penicillium từ nguồn khác cho thấy A aculeatus có khả sinh amylase [14] Mahapatra cs thu nhận, tinh chế xác định đặc tính hố sinh amylase thu nhận từ chủng A aculeatus DBF9 phân lập từ đất rừng [13] Một nghiên cứu ứng dụng khác cho thấy chủng A aculeatus BCC17849 có khả sản sinh amylase phân giải tinh bột đa thành phần [15] Điều thú vị sử dụng dịch chiết enzyme ngoại bào từ chủng (trong có amylase) q trình đường hố tinh bột sắn lên men thu nhận etanol làm tăng hiệu suất trình lên tới 96,7% [15] Các nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng chủng A aculeatus DM12M sinh amylase trình thuỷ phân tinh bột lĩnh vực công nghiệp khác Kết luận Nghiên cứu sàng lọc hoạt tính amylase ngoại bào 160 chủng vi nấm biển có nguồn gốc từ vịnh Nha Trang vịnh Vân Phong tuyển chọn chủng nấm mốc DM12M có khả sinh amylase mạnh Mơi trường ni cấy thích hợp để thu nhận amylase từ chủng Czapek–Dox cải tiến bổ sung 1% tinh bột tan, 0,3% NaNO3 0,5% NaCl, với thời gian nuôi ngày pH 6,0 30 C Trong điều kiện này, hoạt độ amylase đạt 58,4 U/mL, cao gấp lần so với chưa tối ưu Chủng DM12M có trình tự đoạn gen ITS1-5,8S-ITS2 tương đồng 99,8–100% với chủng lồi Aspergillus aculeatus nên thuộc loài Các kết cho thấy chủng DM12M amylase từ chủng có tiềm ứng dụng công nghiệp Thông tin tài trợ Cơng trình thực tài trợ Quỹ NAFOSTED (Đề tài mã số 106-NN.022016.70) Tài liệu tham khảo Vaidya S, Srivastava PK, Rathore P, Pragya R, Pandey AK Amylases: a prospective enzyme in the field of biotechnology The Journal of Applied Biosciences 2015; 41: 1-18 Mohapatra B, Banerjee U, Bapuji M Characterization of a fungal amylase from Mucor sp associated with the marine sponge Spirastrella sp Journal of Biotechnology 1998;60:113–117 Li HF, Chi ZM, Wang XH, Duan XH, Ma LY, Gao LM Purification and characterization of extracellular amylase from the marine yeast Aureobasidium pullulans N13d and its raw potato starch digestion Enzyme and Microbial Technology 2007;40:1006-1012 Sahoo K, Dhal N, Das R Production of amylase enzyme from mangrove fungal isolates African Journal of Biotechnology 2014;13(46):4338-4346 Lanka S, Pydipally M, Latha JNL Extraction and activity studies of industrially important enzymes from marine fusarium species isolated from Machilipatnam sea water, (a.p), India European Journal of Pharmaceuticaland Medical Research 2016;3(12): 254-258 Wang Y, Barth D, Tamminen A, Wiebe MG Growth of marine fungi on polymeric substrates BMC Biotechnology 2016;16(3) doi: 10.1186/s12896-0160233-5 Bình NTT Nghiên cứu thu nhận enzym amylase số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ [Luận văn] Hồ Chí Minh: Trường Ðại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh; 2010 Lan PTN, Thành HN Nghiên cứu nấm mốc có khả phân giải tinh bột phân lập từ ao nuôi tôm Đầm Sam – Chuồn, Thừa Thiên Huế Trường Đại học Khoa học, Đại học Huế Tạp chí khoa học Đại học Huế 2012;73(4):147-156 Bernfeld P Amylases, α and β Methods in Enzymology 1955;1:149-58 66 Tạp chí Khoa học Đại học Huế: Khoa học Tự nhiên Tập 129, Số 1C, 59–67, 2020 10 Toju H, Tanabe AS, Yamamoto S, Sato H Highcoverage ITS primers for the DNA-based identification of ascomycetes and basidiomycetes in environmental samples PLoS ONE 2012;7(7): e40863 11 Tamura K, Stecher G, Peterson D, Filipski A, Kumar S MEGA6: Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 Molecular Biology and Evolution 2013;30:2725-2729 12 Ominyi MC Optimization of α-amylase and glucoamylase production from three fungal strains isolated from Abakaliki, Ebonyi State European Journal of Experimental Biology 2013;3(4):26-34 13 Mahapatra S, Banerjee D Production and characterization of thermal acid amylase from A DOI: 10.26459/hueuni-jns.v129i1C.5449 pISSN 1859-1388 eISSN 2615-9678 aculeatus DBF9 Dynamic Biochemistry, Process Biotechnology and Molecular Biology 2012;6(1): 109-112 14 Khokhar I, Mukhtar I,Mushtaq S Comparative studies on the amylase and cellulase production of Aspergillus and Penicillium Journal of Applied Sciences and Environmental Management 2011;15(4):657-661 15 Poonsrisawat A, Paemanee A, Wanlapatit S, Piyachomkwan K, Eurwilaichitr L, Champreda V Simultaneous saccharification and viscosity reduction of cassava pulp using a multi-component starch- and cell-wall degrading enzyme for bioethanol production Biotech 2017;7(5):290 67 ... xác định dựa vào đường chuẩn maltose 2.5 Khảo sát điều kiện ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase ampicillin 0,05% streptomycin sulfate 0,075% Các điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh Các. .. hướng Vi? ??t Nam hạn chế Mục tiêu nghiên cứu tuyển chọn chủng vi nấm biển có khả sinh amylase từ nước biển ven bờ vịnh Nha Trang vịnh Vân Phong, nghiên cứu điều kiện mơi trường ni cấy thích hợp để... lọc hoạt tính amylase ngoại bào chủng vi nấm biển khác nhau, tuỳ thuộc vào nguồn gốc phân lập Trong số 160 chủng vi nấm biển (112 chủng nấm men 48 chủng nấm mốc) phân lập, tất chủng nấm men khơng