Tuyển chọn và xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp để các chủng lactobacillus plantarum (r7, r8, r12, t12t1) có khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharides cao

Với những bước tiến của mình, các nhà khoa học đã nghiêncứu thành công rất nhiều những sản phẩm được sản xuất từ vi sinh vật, gópphần quan trọng trong nền công nghiệp sản xuất, trong y h

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic 3

1.1.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn lactic 3

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic 3

1.1.3 Phân loại các chủng vi khuẩn lactic [9] 4

1.1.3.1 Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus 4

1.1.3.2 Aerococcus, Pediococcus 5

1.1.3.3 Leuconostoc, Oenococcus 5

1.1.3.4 Lactobacillus 6

1.1.4 Lactobacillus plantarum 7

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp exopolysaccharide ở vi khuẩn Lactobacillus 7

1.1.5.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon [4] 7

1.1.5.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ [25] 8

1.1.5.3 Ảnh hưởng của các muối vô cơ và các chất kích thích sinh trưởng 8

1.1.5.4 Nhiệt độ nuôi cấy 9

1.1.5.5 pH của môi trường nuôi cấy 9

1.2 Tổng quan về exopolysaccharides 10

1.2.1 Khái niệm về exopolysaccharides 10

1.2.2 Phân loại 10

1.2.3 Cấu trúc của EPS 12

1.2.4 Qúa trình sinh tổng hợp EPS [10] 13

1.2.5.Ứng dụng của EPS 15

1.2.5.1 Trong công nghệ thực phẩm 15

1.2.5.2.Trong y học 15

1.2.5.3 Một số EPS điển hình 16

PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19

2.1.Đối tượng nghiên cứu 19

2.2 Thiết bị và hóa chất sử dụng 19

2.2.1 Thiết bị sử dụng 19

2.2.2 Hóa chất 19

2.2 Phương pháp nghiên cứu 20

2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh 20

2.2.1.1 Nguyên tắc 20

2.2.2.2 Tiến hành 20

2.2.2 Phương pháp thu nhận EPS 21

2.2.2.1 Quy trình 21

2.2.2.2 Thuyết minh quy trình 22

2.2.3 Phương pháp xác định mật độ tế bào 22

2.2.3.1 Nguyên tắc 22

2.2.3.2 Tiến hành 22

2.2.4 Phương pháp xác định pH 23

2.2.5 Phương pháp định lượng EPS 23

2.2.5.1 Nguyên tắc 23

2.2.5.2 Cách tiến hành 23

2.2.6 Phương pháp toán học 24

PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25

3.1 Khảo sát tìm chủng có khả năng sinh EPS cao nhất trong môi trường MRS 25

3.2 Khảo sát khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng Lactobacillus plantarum R8 ở các môi trường thay thế 26

3.2.1.Môi trường thay thế glucose bằng saccharose 26

3.2.2 Môi trường thay thế glucose bằng lactose 28

3.2.3 Môi trường thay thế glucose bằng đường trong nước dừa 29

3.3 So sánh giữa các môi trường 31

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33

I Kết luận 33

II Kiến nghị 33

TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cơ chế tổng hợp EPS 13Hình 3.1 25Hình 3.2 Hàm lượng EPS của 4 chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum R7,R8, R12, T12T1 trong môi trường MRS 25Hình 3.2 Hàm lượng EPS của chủng Lactobacillus plantarum R8 ở môitrường thay thế glucose bằng saccharose 27Hình 3.3 Hàm lượng EPS của chủng R8 ở môi trường thay thế glucose bằnglactose 28Hình 3.4 Hàm lượng EPS của chủng R8 ở môi trường thay thế glucose bằngđường trong nước dừa 30Hình 3.5 Hàm lượng EPS của chủng R8 ở 4 môi trường 31

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay, với sự tiến bộ của khoa học công nghệ, con người ngày càngtiếp cận gần hơn, hiểu biết nhiều hơn về thế giới sinh vật nói chung và hệ visinh vật nói riêng Với những bước tiến của mình, các nhà khoa học đã nghiêncứu thành công rất nhiều những sản phẩm được sản xuất từ vi sinh vật, gópphần quan trọng trong nền công nghiệp sản xuất, trong y học, trong xử lý môitrường Một trong những sản phẩm quan trọng đó là exopolysaccharides [32].Exopolysaccharides là những polymer trọng lượng phân tử cao, được tiết

ra bởi một số vi khuẩn và nấm vào môi trường xung quanh [5] Việc sinh tổnghợp exopolysaccharides còn phụ thuộc vào chủng vi khuẩn, điều kiện vật lý,thành phần môi trường sử dụng trong nuôi cấy Trong số nhiều loạiexoplysaccharides được sản xuất bởi vi sinh vật, vi khuẩn Lactic (LAB) được

sử dụng nhiều vào thời gian gần đây nhất và được quan tâm nhất bởi nhữnglợi ích của exopolysaccharides từ vi khuẩn này đã được nghiên cứu và chothấy những thuộc tính an toàn đối với sức khỏe [10] Hơn nữa, việc sản xuấtexopolysaccharides từ vi khuẩn dễ dàng hơn và có thể tạo ra một lượng lớntrong thời gian ngắn so với polysaccharides được sản xuất từ thực vật và tảo

Exoplysaccharides từ Lactobacillus plantarum C88 (Li Zhanga và cộng

sự, 2013)[40] đã được báo cáo trên tạp chí quốc tế sinh học phân tử có tácdụng chống oxy hóa, giảm cholesterol trong máu … exoplysaccharides từ

Lactobacillus plantarum 70810 (Kun Wang và cộng sự)[38] được xem là chế

phẩm sinh học: giảm cholesterol, bảo vệ gan, có tiềm năng probiotic cũng nhưhoàn thiện cấu trúc cho sản phẩm thực phẩm Exoplysaccharides từ

Lactobacillus debrueckii subsp.bulgaricus (Junko Nishimura, 2014) [8] góp

phần vào chức năng vật lý và sinh học của các sản phẩm sữa, ngoài ra, giúptăng cường hệ thống miễn dịch và giảm cholesterol Theo báo cáo củaK.Czaczyk và cộng sự (2007) [6] cho thấy rằng hầu hết các polysaccharidesngoại bào đều có vai trò quan trọng trong việc hình thành màng sinh học.Việc phát hiện và phát triển các exopolysaccharides vi sinh vật đã manglại lợi ích to lớn trong nền công nghiệp Trong công nghiệp thực phẩm nó gópphần vào việc tạo hương vị, kết cấu, và thời hạn sử dụng của thực phẩm lênmen (De Vuyst and Degeest 1999) Exopolysaccharides cũng có một vai tròquan trọng trong các bệnh nhiễm trùng nội nha Màng sinh học

exopolysaccharides còn được ứng dụng làm màng lọc sinh học trong xử lýmôi trường và màng trị bỏng trong y học [29-32]

Xuất phát từ những vấn đề trên nên tôi thực hiện đề tài: “Tuyển chọn và xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp để các chủng Lactobacillus plantarum (R7, R8, R12, T12T1) có khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharides cao’’ với mục đích :

- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp Exopolysaccharides của 4 chủng

Lactobacillus plantarum (R7, R8, R12, T12T1) trên môi trường MRS để chọn

chủng sinh tổng hợp EPS cao nhất

- Khảo sát khả năng sinh tổng hợp EPS của chủng cao nhất trong cácmôi trường : thay thế glucose bằng saccharose, thay thế glucose bằng lactose,thay thế glucose bằng hàm lượng đường có trong nước dừa

PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về vi khuẩn lactic

1.1.1 Giới thiệu chung về vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là những vi khuẩn gram dương, hình cầu hoặc que,catalase và oxidase âm tính, không hình thành bào tử, không di động, nhiềuloài trong chúng là những vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn hiếu khí và có khả năngtồn tại cả hiếu khí cũng như kỵ khí.catalase âm tính, sống trong điều kiện từ

vi hiếu khí đến kị khí nghiêm ngặt Chúng thu nhận năng lượng nhờ phân giảihydratcacbon và sản xuất số lượng lớn axit lactic và một số nhỏ các hợp chấtkhác là sản phẩm của quá trình chuyển hóa carbonhydrate của chúng [9]

Các nhóm chủ yếu của vi khuẩn lactic bao gồm Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus Ngoài ra còn có các nhóm khác

là Tetragenococcus và Vagococcus [9].

Các vi khuẩn lactic được tìm thấy trong thực phẩm (sản phẩm từ sữa, thịtlên men, bột chua, rau lên men, đồ uống, thức ăn ủ rượu…), trên cây, trongnước thải, nhưng cũng có thể là trong đường sinh dục, đường ruột và hô hấpcủa con người và động vật [2]

Trong ngành công nghiệp thực phẩm, vi khuẩn lactic hoạt động như làsinh vật có lợi và đồng thời cũng là các sinh vật gây hư hỏng Chúng được sửdụng trong sản xuất các sản phẩm sữa lên men như sữa chua, pho mát, bơ,trong sản xuất xúc xích, dưa chua, dưa cải bắp… Kết quả của những quá trìnhlên men là ổn định chất lượng và tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm Tuynhiên, nếu sự phát triển của vi khuẩn lactic không được kiểm soát thì chúng

có thể là một nguyên nhân chính gây hư hỏng thực phẩm Các chi thường

được sử dụng trong các quá trình công nghiệp là Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Oenocococcus và Streptocococcus.

1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn lactic

Vi khuẩn lactic là loài lên men bắt buộc, chúng không cócytochrome.Tuy nhiên, chúng có thể sinh trưởng trong điều kiện có oxykhông khí là nhờ có peroxydase giúp phân giải H2O2 thành H2O và O2 Vìvậy, người ta thường gọi những vi sinh vật này là những sinh vật hiếu khí tùy

ý hoặc kị khí không bắt buộc [2]

Khả năng sinh tổng hợp những hợp chất cần cho sự sống là rất yếu, nên

chúng là những vi sinh vật đa khuyết dưỡng đối với nhiều axit amin, nhiềuloại vitamin…, không có khả năng tổng hợp nhân hem của porphyrine.

Vi khuẩn lactic có nhu cầu về chất sinh trưởng rất phức tạp Không mộtđại diện nào của nhóm này có thể phát triển trong môi trường muối khoángthuần khiết chứa glucose Đa số chúng cần hàng loạt các vitamin (lactoflavin,tiamin, axit pantotenic, axit nicotinic, axit folic, biotin) và các amino acid

Vi khuẩn lactic có các nhóm chủ yếu là Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus và Streptococcus Theo phân loại thì vi khuẩn lactic có khoản 20

chi, tuy nhiên trong công nghệ thực phẩm chỉ sử dụng các chi sau :

Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, và Weissella [9].

1.1.3 Phân loại các chủng vi khuẩn lactic [9]

1.1.3.1 Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus

Mặc dù có sự phân tách và hình thành các chi mới nhưng chi

Streptococcus vẫn là một chi lớn và khó phân loại một cách hoàn hảo Chi

này được phân thành ba nhóm: trùng sinh mủ, đường uống và liên cầu khuẩn

streptococci khác Nhóm sinh mủ có chứa một số tác nhân gây bênh nổi bật như Streptococcus pyogenes và Streptococcus agalactiae Một tác nhân khác

là Streptococcus pneumonia trước đây thuộc nhóm này nhưng đã được

chuyển qua nhóm đường uống, trong đó chủ yếu là loài liên quan đến khoangmiệng của người và động vật Một số liên cầu khuẩn đường miệng, ví dụ

như Streptococcus mutans có thể là tác nhân sâu răng và nhiễm trùng khác Loài được ứng dụng trong công nghệ thực phẩm là Streptococcus thermophilus, được sử dụng trong sản xuất sữa chua và một số loại phô mai Loài này được xếp vào nhóm Streptococcus “khác” Chúng có khả năng chịu

nhiệt cao, có thể phát triển ở cả nhiệt độ 52oC

Lactococcus có liên hệ chặt chẽ với công nghệ chế biến sữa, nhưng trong

số năm loài được công nhận chỉ có Lactococcus lactic là thực sự được sử dụng trong công nghệ sản xuất sữa Ba phân loài của Lactococcus lactic có thể được phân biệt: Lactococcus lactic subsp lactic, Lactococcus lactic subsp cremoris, và Lactococcus lactic subsp hordniae Có hai loài đầu tiên rất quan trọng trong chế biến sữa Lactococcus lactic subsp lactic được phân biệt với Lactococcus lactic subsp Cremoris không có khả năng phát triển ở

40oC, phát triển ở nồng độ NaCl 4%, thủy phân arginine, và lên men ribose

Đặc điểm phân biệt giữa Lactococcus, Enterococcus và Streptococcus chủ

yếu dựa vào khả năng phát triển ở các nhiệt độ khác nhau và nồng độ NaCl

khác nhau Trong khi các chủng Lactococcus không thể phát triển ở 45oC,

NaCl 6,5% và pH 9,6 thì các chủng Enterococcus lại phát triển được trong cả

ba điều kiện trên, không có quy luật chung cho nhóm Streptococcus.

Một số loài Enterococcus, đặc biệt là Enterococcus faecalis là những tác

nhân gây bệnh cơ hội, vì thế chúng không mong muốn có trong thực phẩm

Tuy nhiên hiện nay, các chế phẩm của Enterococcus faecium và Enterococcus faecalis được sử dụng như là probiotic Enterococcus cũng đã

được chứng minh là có mặt trong một số loại phô mai địa phương ở châu Âu

quan trọng trong công nghệ thực phẩm

Pediococcus damnosus, Pediococcus claussenii và Pediococcus inopinatus, được phân lập từ bia hoặc tìm thấy tại nhà máy bia Pediococcus damnosus là một tác nhân chính làm hỏng bia, vì sự phát triển của chúng có

thể dẫn đến sự tạo thành diacetyl và acetoin, gây đục bia, tạo mùi chua, làm

cho bia có vị giống bơ và làm cho bia rất nhớt Pediococcus acidilactici và Pediococcus pentosaceus được sử dụng làm giống nuôi cấy khởi đầu trong

sản xuất xúc xích, chúng còn có vai trò quan trọng trong sự chín của phô mai

Trong chăn nuôi gia cầm Pediococcus acidilactici được sử dụng để làm chế

phẩm sinh học thúc đẩy tăng trưởng và bảo vệ vật chủ Các đặc tính chính đểphân biệt giữa các loài là các loại đường lên men, thủy phân arginine, tăngtrưởng ở mức pH khác nhau (7,0 và 4,5)

1.1.3.3 Leuconostoc, Oenococcus

Các nghiên cứu phát sinh loài cũng tiết lộ rằng Leuconostocs ở rượu vang còn được gọi là Leuconostocs oenos, chỉ có họ hàng xa với Leuconostocs khác và loài này vì vậy đã được tách ra và tạo thành một chi mới Chi này được gọi là Oenococcus Chi này có khả năng chịu được nồng

độ rượu và axit cao

Leuconostoc được phát hiện trong rau xanh và rễ cây, trong các sản

phẩm lên men từ thực vật như dưa chuột, kim chi, củ cải và cũng có trongnguyên liệu sữa, các sản phẩm từ sữa, thịt gia cầm, cá Đáng chú ý là nó đượcphân lập từ ruột cá

Leuconostoc carnosum, Leuconostoc gasicomitatum và Leuconostoc gelidum liên quan đến việc làm hư hỏng thực phẩm, nó làm biến đổi không

khí trong các sản phẩm đóng gói, làm phồng gói và thay đổi màu sắc, mùi vị

1.1.3.4 Lactobacillus

Chi Lactobacillus là chi lớn nhất trong nhóm vi khuẩn lactic Chúng là

những vi khuẩn gram dương, catalase âm tính, sinh trưởng trong điều kiện kỵkhí không bắt buộc hoặc vi hiếu khí Chi này gồm khoản 80 loài và nó khôngđồng nhất về hình thái, đặc điểm sinh hóa, sinh lý

Tế bào Lactobacillus hình que và thường có đường kính (0,5 -1,2)× (1,0 –

10,0)µm, kết thành chuỗi ngắn nhưng thỉnh thoảng có dạng gần giống hình cầu.Khuẩn lạc trên môi trường agar có kích thước 2-5nm, dạng lồi, mờ đục, vàkhông nhuộm màu Những tế bào này đòi hỏi môi trường nuôi cấy phức tạp vàgiàu dinh dưỡng, có khả năng lên men và thủy phân 1 số loại đường, ít nhất 1nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon là lactate Không khử được nitrat,không làm tan gelatin, không có catalase cũng như cytochorme Các loài trongchi Lactobacillus có thể tiến hành cả lên men lactic đồng hình thông qua conđường Embden-Meyerhof hoặc dị hình thông qua con đường pentose-phosphate Chúng phát triển mạnh trong môi trường có tính axit, tùy loài mà

pH dao động từ 4,5 đến 6,4 Nhiệt độ tối thích cho sự phát triển là 30-400C

Lactobacillus tồn tại trong tự nhiên ở thực vật và đất, trong cơ thể người

ở đường tiêu hóa, niệu sinh dục, khoang miệng Lactobacillus tồn tại trong

nhiều loại thực phẩm khác nhau và rất an toàn, chúng được sử dụng làm khởiđiểm cho quá trình lên men thực phẩm và sử dụng làm chế phẩm sinh học.Được tìm thấy trong nhiều sản phẩm như sữa chua, phomat, sữa lên men Cácsản phẩm truyền thống như kim chi Hàn Quốc và sữa chua kerfi Vì chúng cóthể sống sót trong môi trường axit nên thường được dùng trong ủ chua thức

ăn và lên men rau quả Các chủng sử dụng trong ủ chua thức ăn gia súc là

Lactobacillus plantarum và Lactobacillus buchneri Chi Lactobacillus cũng được tìm thấy trong các loại thịt, như Lactobacillus sakei được tìm thấy trong

thịt lên men Trong đồ uống cồn như bia, rượu vang, đóng vai trò vào việc tạohương vị cho sản phẩm Tuy nhiên, đôi khi chúng cũng có thể làm hỏng thực

phẩm do một số sản phẩm của quá trình trao đổi chất của chúng làm cho thựcphẩm như bia, sữa, thịt có mùi khó chịu.

1.1.4 Lactobacillus plantarum

Lactobacillus plantarum là những vi khuẩn gram dương, trực khuẩn nhỏ,thường kết đôi hoặc chuỗi, tế bào hình que Chúng phát triển ở nhiệt độ từ 15-

450C và ở mức độ pH thấp là 3,2 Nhiệt độ tối ưu cho sinh trưởng là 300C

Nó thường được tìm thấy trong con người và động vật có vú khác qua dạdày, nước bọt, và các sản phẩm thực phẩm khác nhau: bắp cải muối, dưachua, kim chi Hàn Quốc, bột làm bánh, nguyên liệu thực vật lên men, một sốloại pho mát, xúc xích lên men, và cá hồi phơi khô không có muối

Lactobacillus plantarum được quan tâm hiện nay bởi các nhà nghiên cứu

và các ngành công nghiệp thực phẩm vì nó được coi là một probiotic an toàn

Nó có thể giúp hạn chế số lượng vi khuẩn gây bệnh hoặc bệnh có thể có mộttác động tiêu cực đối với con người Có vai trò quan trọng trong việc tạo nênkết cấu cho các sản phẩm thực phẩm Ngoài ra, nghiên cứu gần đây chỉ ra

rằng Lactobacillus plantarum có thể được sử dụng như một phương tiện

vaccine, giảm cholesterol trong máu, bảo vệ gan

1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh tổng hợp exopolysaccharide ở vi khuẩn Lactobacillus

Trong công nghiệp, vật liệu dể làm môi trường cho vi sinh vật phát triểncần đảm bảo các yếu tố: đầy đủ chất dinh dưỡng, không có độc tố, cho hiệusuất thu hồi lớn nhất và giá thành rẻ nhất Mỗi nguồn dinh dưỡng cung cấpkhông chỉ ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy

mà còn ảnh hưởng không nhỏ đến quá trình thu hồi và bảo quản chế phẩmsinh khối sau này

1.1.5.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon [4]

Cacbon là thành phần chính trong các hợp chất hữu cơ xây dựng lên cơthể của mọi loài vi sinh vật Vì vậy, sự chuyển hóa nguồn dinh dưỡng cacbonthành các chất cần thiết cho tế bào vi sinh vật chiếm vị trí hàng đầu trong quátrình dinh dưỡng của tế bào vi sinh vật

Vi khuẩn lactic sử dụng được rất nhiều loại cacbonhydrat, từ các hexose(glucose, fructose, mantose, galactose), các đường đôi (saccarose, lactose,maltose) cho đến các polysaccharide (tinh bột, dextrin)

Glucose ở dạng D-glucose, là loại monosaccharide dễ hấp thụ nhất

chúng được vi sinh vật sử dụng đầu tiên rồi mới đến các loại khó chuyển hóahơn Vì vậy, trong quá trình sản xuất người ta thường đưa về loại đường nàycho vi sinh vật dễ hấp thụ.

Lactose là disaccharide, nó là đường có trong sữa người và động vật.Một số chủng vi khuẩn lactic có khả năng sử dụng lactose làm thức ăn vìchúng có khả năng sinh enzyme β-galactosidase Enzyme này thủy phânlactose thành glucose và galactose, giúp cho quá trình trao đổi chất của vikhuẩn được dễ dàng hơn

Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic làmonosaccharide và disaccharide Các nguồn cacbon này được dùng để cungcấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào

1.1.5.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ [25]

Nitơ cũng là một nguyên tố cần thiết cho sự sống của vi sinh vật Vậtchất cơ bản của tế bào (protein, acid nuleic…) đều chứa nitơ, vì vậy nitơ đóngmột vai trò hết sức quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của vikhuẩn Vi khuẩn lactic đòi hỏi rất nhiều acid amin khác nhau do đó chúngcần môi trường có sẵn nguồn nitơ nhằm đảm bảo cho sự phát triển của mình.Acid amin có thể được đồng hóa dưới dạng peptid nhờ và tác dụng của enzymprotease nội bào hay ngoại bào

Mỗi loài vi khuẩn khác nhau lại có nhu cầu về nguồn nitơ khác nhau.Phần lớn vi khuẩn lactic không thể sinh tổng hợp được các chất hữu cơ phứctạp có chứa nitơ nên chúng đòi hỏi nguồn nitơ có sẵn trong môi trường để sinhtrưởng và phát triển bình thường, ngoài nitơ dưới dạng hỗn hợp các acid amin,

vi khuẩn lactic còn cần những hợp chất hữu cơ quan trọng như các sản phẩmthủy phân protein từ lactanbumin, casein, pepton, dịch nấm men thủy phân,dịch chiết thịt …Đây cũng là nguồn nitơ thường xuyên được sử dụng cho quátrình nuôi cấy Tuy nhiên ở quy mô công nghiệp cần nghiên cứu những nguồnnitơ thích hợp để sản xuất giúp làm giảm giá thành mà nâng cao được hiệu quảsản xuất Trong đó, dịch nấm men thủy phân được sử dụng khá nhiều

1.1.5.3 Ảnh hưởng của các muối vô cơ và các chất kích thích sinh trưởng

Các muối vô cơ và các chất khoáng chỉ với một lượng rất nhỏ nhưng lại

có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh và phát triển của vi khuẩn Chẳng hạn đốivới Lactobacillus Mn2+, Mg2+, Fe2+ làm tăng cường sự phát triển của vi khuẩnlactic, hay Ca2+ tham gia vào cấu trúc enzyme protese thủy phân một số

protein là nguồn dinh dưỡng nuôi tế bào Nhìn chung mangan và magie lànhững chất đóng vai trò chủ yếu sau:

+ Tham gia cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzyme

+ Giải độc cho tế bào khỏi sự có mặt của oxy

+ Ổn định cấu trúc tế bào

Mangan là chất hoạt động trong quá trình lên men lactic bằng cách giúp

vi khuẩn lactic sử dụng tốt hơn các loại đường

Các chất chứa acid béo có mặt trong môi trường cũng có ảnh hưởngkhông nhỏ đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn Chúng khôngnhững kích thích sinh trưởng mà còn đóng vai trò trong quá trình lạnh đôngsau này Ví dụ Tween 80 sẽ làm thay đổi một số acid béo trong tế bào vikhuẩn lactic [6]

1.1.5.4 Nhiệt độ nuôi cấy

Nhiệt độ ảnh hưởng sâu sắc đến quá trình sống của vi sinh vật nói chung

và của vi khuẩn nói riêng Mỗi loài vi sinh vật thích nghi với một vùng nhiệt

độ khác nhau, căn cứ vào sự thích nghi nhiệt độ, các loài vi sinh vật được chialàm 3 nhóm: nhóm ưa lạnh và chịu lạnh, nhóm ưa ấm và nhóm chịu nhiệt.Một nghiên cứu điều tra các điều kiện nôi cấy tối ưu cho sản xuất EPS

bởi Lactobacillus delbrueckii subsp, bugaricus đã xác định được nhiệt độ tối

ưu cho sản xuất EPS là khoảng 36 – 39oC Nhiệt độ tối ưu cho sản xuất EPS

là khoảng 40oC cho các chủng LAB ưa nhiệt, và khoảng 25oC cho LABmensophilic Những ảnh hưởng nhiệt độ đối với sản xuất EPS trong whey đã

được nghiên cứu trong Lactobacillus plantarum là 37oC [8]

1.1.5.5 pH của môi trường nuôi cấy

ở pH: 6,2 pH ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh tổng hợp của EPScủa vi sinh vật Mỗi loài vi sinh vật có pH nuôi cấy khác nhau phù hợp choviệc sinh tổng hợp EPS pH thích hợp cho mỗi loài có thể là acid, kiềm haytrung tính [6-8]

Trong một nghiên cứu được tiến hành với Lactobacillus sake, pH tối ưu

cho sản xuất EPS là 5,8 nhưng con số di động đã đạt được

1.2 Tổng quan về exopolysaccharides

Lịch sử của exopolysaccharides vi khuẩn bắt đầu trong giữa thế kỷ 19

với sự phát hiện của một exopolysaccharide trong rượu vang, mà sau nàyđược biết đến như dextran và prokaryote chịu trách nhiệm cho việc sản xuấtđược xác định bởi Leuconostoc mesenteriodes Trong suốt thời gian sau này,exopolysaccharides khác phát hiện bao gồm cellulose, alginate và xanthan.Những tiến bộ trong khoa học dẫn đến việc nghiên cứu sâu sắc hơn về bảnchất, cấu trúc của chúng cũng như những thành tựu đáng kể màexopolysaccharide mang lại cho nền công nghiệp nói chung và thực phẩm nóiriêng [32].

1.2.1 Khái niệm về exopolysaccharides

Exopolysaccharide là những polymer có trọng lượng phân tử cao, đượctiết ra bởi một loại vi sinh vật vào môi trường xung quanh, là polysaccharideschuỗi dài phân nhánh, bao gồm các đơn vị đường hoặc dẫn xuất đường lặp đilặp lại Những đơn vị đường chủ yếu là glucose, galactose và rhamnose, tỷ lệkhác nhau [5] Chúng được bài tiết vào môi trường xung quanh trong quátrình tăng trưởng và không được gắn vĩnh viễn vào bề mặt của tế bào vi sinhvật [ Điều này phân biệt chúng với các polysaccharides cấu trúc tương tự(CPSs), mà chúng vẫn gắn vĩnh viễn vào bề mặt của các tế bào

Vi sinh vật tổng hợp nhiều loại polysaccharides đa chức năng bao gồmpolysaccharides nội bào, polysaccharides cấu trúc, polysaccharides ngoại bàohay còn gọi là exopolysaccharides (EPS)

Độ dày thông thường của lớp EPS là từ 0,2-1,0µm Trong một số loại vikhuẩn độ dày của lớp EPS không vượt quá giá trị từ 10-30 nm [6] Cấu trúc hóahọc của các chất polyme được tiết ra bởi tế bào vào môi trường rất đa dạng

1.2.2 Phân loại

Dựa vào thành phần hóa học, exopolysaccharides có thể được xem xétdựa trên thành phần monomeric và được chia làm 2 nhóm (Sutherland 1997):homopolysaccharides và heteropolysaccharides

Homopolysaccharides chỉ chứa một loại monosaccharide (ví dụ nhưcellulose, dextran, mutan, alternan, pullulan, levan và curdlan)Homopolysaccharides có bốn nhóm chính: α-D-glucans, β-D-glucans,fructans và polygalactan α-D-glucans sản xuất bởi Leuconostoc mesenteroi-des, liên kết chủ yếu là α–D-1,6 -glucosyl Mức độ liên quan đến việc phânnhánh thể hiện ở liên kết α-1,3 -glucosyl, ít khi thể hiện liên kết α -1,2 và α -

1,4 glucosyl β-D-glucans được tổng hợp bởi Pediococcus spp,

Streptococcus spp Các phân tử được liên kết với nhau bởi liên kết β-1,3 glucosyl Fructans sản xuất bởi Streptococcus salivarius liên kết với nhau bởi

liên kết β-2,6 fructosyl [8] Homopolysaccharide được phân thành hailoại:polymer mạch thẳng và polymer mạch nhánh Một ví dụ của mộthomopolysaccharide mạch thẳng là cellulose vi khuẩn (polyglucose).Homopolysaccharides mạch nhánh được đại diện bởi levans (polyfructoses)

và dextrans (polyglucose) [6-13-19]

Homopolysaccharides EPS được tổng hợp bằng các enzymeglycosyltransferase (GTF) hoặc fructosyltransferase (FTF).Homopolysaccharides EPS sản xuất từ LAB cũng sử dụng enzyme GTF đểtổng hợp polymer cao phân tử α-glucans từ sucrose Quá trình này sử dụngsucrose, năng lượng cần thiết cho quá trình này đến từ việc thủy phân sucrose

Dextran sản xuất từ Leuconostoc mesenteroides là một homopolysaccharide Leuconostoc mesenteroides có khả năng tiết glucansucrase và tổng hợp α-

glucan polymer từ glucose được giải phóng Glucansucrase thường hình thành

mối nhiều mối liên kết glucosyl, do đó dextran sản xuất từ Leuconostoc mesenteroides không chỉ chứa liên kết α-1,6 glucosyl mà còn cả liên kết α-

2,3,4 glucosyl Dextran được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp y

tế và sinh hóa Các dẫn xuất dextran đã được phát triển và được sử dụng rộngrãi và có giá trị thương mại cao [13-19]

Heteropolysaccharides bao gồm các đơn vị lặp đi lặp lại của D-glucose,D-galactose, L-rhamnose và trong một một số trường hợp, có N-acetylglucosamine (GlcNAc), N-acetylgalactosamine (GalNAc) hoặc axítglucuronic (GlcA) Các mối liên kết giữa các đơn vị monosaccharide và cácnhánh của chuỗi xác định tính chất vật lý của heteropolysaccharides [7-13].Heteropolysaccharide được tổng hợp bởi các enzyme transferasesglycosyl nội bào [2] Cụ thể, saccharides đưa vào tế bào được sử dụng như mộtnguồn năng lượng của Embden-Meyerhof (EM), heteropolysaccharide đượctổng hợp qua trung gian của con đường glycolysis trong các tế bào EPS đượcthực hiện bằng cách trùng hợp của các đơn vị lặp đi lặp lại, và các đơn vị lặp lạiđược xây dựng bởi sự bổ sung các đường nucleotide ở màng tế bào chất [6]

1.2.3 Cấu trúc của EPS

Một số nghiên cứu đã được tiến hành để xác định thành phần đường củaEPS, mặc dù cấu trúc hóa học không được phân tích [13] [26] - [31] Trong

những nghiên cứu, glucose (GLC), galactose (Gal), rhamnose (Rha) được tìmthấy là những loại đường chính, và các đườngkhác, chẳng hạn như mannose(Man), fructose (FRU) cũng có mặt [22].

Bảng 1.1 Các thành phần chung của exopolysaccharides [17]

D-riboseD-xylose

D-galactoseD-mannoseD-alloseL-rhamnoseL-fucose

D-galactosamine

D-galacturonic acidsD-mannuronic acidOrganic substituents Acetate,

SuccinatePyruvateGlycerateHydroxybutanoateInorganic substituents Sulfate

Phosphate

1.2.4 Qúa trình sinh tổng hợp EPS [10]

Hình 1.1 Cơ chế tổng hợp EPS

Thuyết minh cơ chế tổng hợp EPS như sau :

(Hình 1.1a): Cơ chất đi vào tế bào thông qua những con đường vậnchuyển riêng biệt Ví dụ, glycerol đi qua màng tế bào nhờ quá trình khuếch tán

do sự giảm nồng độ của nó; trong khi đó, sự vận chuyển của hầu hết các loạiđường gắn với động lực proton thông qua hệ thống vận chuyển ATP (ví dụ, cácnhóm vận chuyển các loại đường), theo đó quá trình thủy phân ATP cung cấpnăng lượng để vận chuyển cơ chất ngược dòng gradient nồng độ của chúng.(Hình 1.1b): Cơ chất đi vào tế bào trước tiên được chuyển hóa bởi conđường glycolysis tạo thành pyruvate trong điều kiện hiếu khí, sau đó pyruvateđược chuyển hóa thành Acetyl-CoA và tiếp đó đi vào chu trình Tricarboxylicacid Những chất chuyển hóa cấp 1 tạo ra từ những con đường chuyển hóanày là tiền thân của quá trình tổng hợp sinh học của những phân tử sinh họcnhỏ (ví dụ aminoacids, ribonucleotides và hexoamines)

(Hình 1.1c): Đường phosphoryl hóa được chuyển hóa thành nhữngmonosaccharide giàu năng lượng, chủ yếu là đường nucleoside diphosphate(NDP) Những tiền chất này (ví dụ như UDP-Glc, UDP-Gal and GDP-Man)được chuyển hóa tương tác qua thông qua những phản ứng đồng phân hóa,phản ứng oxi hóa, phản ứng decarboxy hóa, phản ứng khử, và phản ứngchuyển vị

(Hình 1.1d) Quá trình tổng hợp polysaccharide và polyme hóa xảy ra quamột trong hai cơ chế sau:

(i): Trong hệ thống phụ thuộc Wzx-Wzy (trái), đơn vị lặp lại được tổnghợp bởi quá trình chuyển tuần tự các monosaccharides từ đường NDP thànhchất mang polyprenylphosphate lipid Những đơn vị lặp lại trưởng thành đượcvận chuyển qua màng bên trong bởi một enzyme flippase giả định (Wzy) đến

bề mặt bào chất nơi mà quá trình polymer hóa diễn ra do hoạt động của mộtpolymerase (Wzy giả định) Đối với nhiều loại vi sinh vật, phương thức (conđường) chuyển vị mở rộng vỏ tế bào được hình thành do enzymepolysaccharide copolymerase (PCP) quyết định chiều dài chuỗi polymer, vàmột protein giải phóng màng tế bào polysaccharide bên ngoài (OPX) dẫn đến

sự hình thành các kênh

(ii): Trong hệ thống vận chuyển phụ thuộc ABC (phải), polysaccharideđược polymer hóa ở bề mặt tế bào chất của màng tế bào bên trong thông qua

việc bổ sung liên tục các đơn vị đường đến đầu không khử của chuỗi polymer.Polymer được giải phóng qua màng tế bào bên trong thông qua hệ thống vậnchuyển ABC, tiếp đến là sự chuyển vị của nó trên toàn bào chất và màng tếbào bên ngoài thông qua PCP và OPX protein.

1.2.5.Ứng dụng của EPS

1.2.5.1 Trong công nghệ thực phẩm

Exopolysaccharides được sản xuất bởi các vi khuẩn lactic (LAB) đãđược báo cáo với các đặc tính độc đáo để tạo điều kiện ứng dụng trong ngànhcông nghiệp thực phẩm như ổn định, keo, hoặc chất nhũ hoá EPS sản xuất từLAB đã được sử dụng rộng rãi để cải thiện tính lưu biến, kết cấu, trạng tháicác sản phẩm sữa lên men như sữa chua và pho mát Vì vậy, EPS từ LAB cótiềm năng phát triển như các chất phụ gia thực phẩm hoặc các thành phầnthực phẩm chức năng với cả sức khỏe và các lợi ích kinh tế [17-25]

Đối với ngành công nghệ thực phẩm nói riêng, sự hình thành các màngsinh học trên bề mặt giúp thực phẩm hạn chế được nguy cơ tiếp xúc với các visinh vật gây hỏng cũng như bảo vệ sản phẩm trước tác hại của một số yếu tố

về môi trường [6]

1.2.5.2.Trong y học

Do có tính chất miễn dịch, một số thấp exopolysaccharides được sử dụngnhư là thành phần không thể thiếu vắc xin, tá dược, hoặc các protein kháng

nguyên Gần đây một số chủng Lactobacillus plantarum được coi là chế phẩm

sinh học do một số tính chất có lợi của nó (làm giảm cholesterol, bảo vệgan…) [14-16]

Một ứng dụng quan trọng của màng sinh học chính là làm màng trị bỏng.

Người ta dùng màng trị bỏng để ngăn ngừa biến chứng nhiễm trùng vếtthương bỏng, tạo điều kiện che phủ vết thương Qua đó, rút ngắn thời gianđiều trị và giảm thiểu thẹo xấu trên vùng da bỏng sâu Chế phẩm này có khảnăng thấm nước cao, kết dính chặt chẽ và trơ về mặt hóa học nên nó có vai trònhư màng sinh học.Màng có khả năng diệt 100% vi khuẩn thường gây ranhiễm trùng các vết thương hở Chỉ cần áp sát màng vào vết thương và khôngcần sử dụng thêm bất cứ gì khác, màng đã có khả năng cản khuẩn, đồng thờilàm vết thương mau lành do quá trình thúc đẩy tái tạo mô da [29]

1.2.5.3 Một số EPS điển hình

a Xanthan

Xathan có ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực đa dạng như phục hồidầu thô, sơn công nghiệp, thuốc trừ sâu và chất tẩy rửa công thức, mỹ phẩm,dược phẩm, mực in, và thực phẩm (Vandamme và Soetaert 1995; Sutherland1997; 1998; Năm 1999; Kumar et al 2007; Kumar và Mody 2009) Xanthan

là một polysaccharide ngoại bào được sản xuất bởi các vi khuẩn

Xanthomonas campestris gồm homopolysaccharide D-glucose với mạch phân

nhánh là trisaccharide [13-17]

Xanthan có độ nhớt thay không đổi đáng kể khi tăng nhiệt độ, ổn định ở

cả axit và pH kiềm Nó tạo thành các chất phân tán trong nước và cũng có thểhình thành gel trong dung dịch Xanthan gum có nhiều ứng dụng và nhậnGRAS (thường được coi là an toàn) niêm yết cho mục đích ăn được Trong lĩnhvực thực phẩm, xathan được dùng để làm mát và gói giấy bọc thực phẩm, phômai nhũ tương Ngoài ra, nó còn được dùng làm chất ổn định kem đánh răng,thức ăn gia súc bổ sung Giải pháp của nó cũng được sử dụng như chất bôi trơncho khoan máy được sử dụng trong bùn khoan tại giếng khoan dầu [17]

b Gellan

Gellan là một sản phẩm của vi khuẩn Sphingomonas paucimobilis

(Sutherland 2002) Các tính chất hóa lý của gellan đáng quan tâm là nó có độnhớt cao và ổn định ở nhiệt độ cao (Banik et al 2000) Nó là một chất geltuyệt vời, gel giòn ở nồng độ thấp hơn so với agar (Lin và Casida 1984).Gellan được sử dụng cho mục đích thương mại và có sẵn dưới tên thương mạicủa gelrite hoặc phytogel (Banik et al 2000) Nó được sử dụng rộng rãi như

là thay thế agar trong môi trường nuôi cấy, là một gel đàn hồi, nó giữ các hạt

lơ lửng mà không thay đổi độ nhớt của dung dịch (Kumar và Mody 2009).Hơn nữa, nó ổn định nhiệt và acid, có độ đàn hồi và độ cứng (Sutherland1998; Banik et al., 2000; Kumar và Mody 2009) Gellan cũng được sử dụngtrong dược phẩm như là một phương tiện cho các loại thuốc nhỏ mắt(Carlforset al 1998) [ 17-25]

c Dextran

Dextran là một polysaccharide ngoại bào của vi khuẩn quan trọng sử

dụng rộng rãi như một rây phân tử cho lọc và tách các protein, axit nucleic, vàpolysaccharides, (ví dụ, SephadexTM), loại trừ sắc ký (Naessens et al 2005).Dextran cũng được sử dụng trong nghiên cứu lâm sàng như '' dextran lâmsàng, '' thay thế huyết tương, làm giảm bớt tình trạng thiếu máu thiếu sắt, vàtrong ngành bánh kẹo để cải thiện duy trì độ ẩm, độ nhớt, và ức chế sự kếttinh đường (Sutherland 1997, 1998, 1999; Kumar et al 2007; Kumar vàMody 2009) [13-17]

d Alginate hoặc axit alginic

Alginate hoặc axit alginic là một sản phẩm thương mại nổi tiếng thu

được từ tảo nâu Nó cũng được tiết ra bởi Pseudomonas aeruginosa và Azotobacter vinelandii (Remminghorst và Rehm 2009) Ứng dụng của

alginate vi khuẩn bao gồm việc sử dụng nó như là một chất ổn định nhũtương, tác nhân keo, chất làm đặc, bọt ổn định, giữ nước, và trong ngành côngnghiệp dược phẩm dùng như băng vết thương và nha khoa vật liệu Trong lĩnhvực nông nghiệp, nó được sử dụng như một lớp phủ cho rễ cây giống và câytrồng để ngăn ngừa sự khô hạn, làm phân bón, thuốc trừ sâu, chất dinhdưỡng… (Vandamme và Soetaert 1995; Sutherland năm 1998; Kumar vàMody 2009) [17]

e Hyaluronan hay axit hyaluronic (HA)

Hyaluronan hay axit hyaluronic (HA) là một polymer mạch thẳng Một

số ứng dụng của HA có thể kể đến trong mỹ phẩm và các lĩnh vực dược liệunhư kem dưỡng ẩm da, trong nước mắt nhân tạo, điều trị viêm xương khớp,như thay thế các chất lỏng mắt trong mắt phẫu thuật, chất bôi trơn cho khớpxương, phòng chống nhiễm trùng trong phẫu thuật bụng, chữa lành vếtthương (Vandamme và Soetaert 1995; Yamada và Kawasaki năm 2005;Widner et al 2005) [17]

f Curdlan

Exopolysaccharide curdlan có khả năng tạo thành một gel đàn hồi(gelatin) trong dung dịch nước (Dumitriu 2004) và được sử dụng trong ngànhcông nghiệp thực phẩm và dược phẩm để cải thiện kết cấu và độ ổn định củacác loại thực phẩm (nhiệt được xử lý thực phẩm) và phát hành các loại thuốc,tương ứng (Gummadi và Kumar năm 2005; Kumar và Mody 2009).Succinoglucan là một glucosegalactose heteropolymer, trong đó có chứa

succinate và pyruvate moieties với các ứng dụng tương tự như curdlan(Vandamme và Soetaert 1995) Curdlan không có giá trị calo, nó rất hữu íchtrong ít calo thực phẩm (mứt và thạch)[17]

g Cellulose

Cellulose là polymer tinh khiết cao, được sử dụng như chất xơ được bổsung vào trong thực phẩm (Sutherland 1998) Bên cạnh đó, nó được sử dụngnhư là một làn da nhân tạo tạm thời bỏng và vết thương phẫu thuật cho ngườibệnh (Vandamme và Soetaert 1995) Ứng dụng trong tương lai của cellulose

vi khuẩn trong công nghệ phân tách như màng hoặc sợi rỗng và như mộtnguồn giấy đặc biệt (Vandamme và Soetaert 1995)[13-17-25]

h Kefiran

Kefiran được biết đến với hoạt động kháng khuẩn, kháng nấm, kháng u

đã được báo cáo cho các vi khuẩn EPS, (Micheli et al,1999; Kumar và Mody2009) Kefiran được tiêu thụ truyền thống và được sử dụng trong việc xâydựng khí ga, hơi cồn sữa lên men (Duboc và Mollet 2001) Ngoài ra, nó được

sử dụng để tăng cường độ nhớt của các sản phẩm từ sữa [17]

i Levans

Levans gây sự chú ý của các nhà nghiên cứu do các tính chất prebioticcủa nó và phạm vi rộng rãi trong ngành công nghiệp sữa Một tác dụng gâyđộc tế bào chống lại các dòng tế bào ung thư ở người đã được báo cáo cho

một exopolysaccharide thu được từ Pseudomonas sp (Matsuda et al 2003).

Ứng dụng của nó hiện đang được mở rộng về hướng phát triển các loại thuốcmới sẽ được sử dụng cho các mục đích dược phẩm (Laurienzo 2010) [13-17]