Tuyển chọn và xác định các điều kiện nuôi cấy thích hợp để các chủng lactobacillus plantarum (r7, r8, r12, t12t1) có khả năng sinh tổng hợp exopolysaccharides cao

MỤC LỤC MỤC LỤC DANH MỤC CÁC HÌNH .4 ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn lactic 1.1.1 Giới thiệu chung vi khuẩn lactic 1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lactic 1.1.3 Phân loại chủng vi khuẩn lactic [9] 1.1.3.1 Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus 1.1.3.2 Aerococcus, Pediococcus 1.1.3.3 Leuconostoc, Oenococcus 1.1.3.4 Lactobacillus .6 1.1.4 Lactobacillus plantarum 1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp exopolysaccharide vi khuẩn Lactobacillus 1.1.5.1 Ảnh hưởng nguồn cacbon [4] .7 1.1.5.2 Ảnh hưởng nguồn nitơ [25] 1.1.5.3 Ảnh hưởng muối vơ chất kích thích sinh trưởng 1.1.5.4 Nhiệt độ nuôi cấy 1.1.5.5 pH môi trường nuôi cấy 1.2 Tổng quan exopolysaccharides 1.2.1 Khái niệm exopolysaccharides 10 1.2.2 Phân loại 10 1.2.3 Cấu trúc EPS 11 1.2.4 Qúa trình sinh tổng hợp EPS [10] 13 1.2.5.Ứng dụng EPS 15 1.2.5.1 Trong công nghệ thực phẩm 15 1.2.5.2.Trong y học 15 1.2.5.3 Một số EPS điển hình .16 PHẦN II ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .19 2.1.Đối tượng nghiên cứu 19 2.2 Thiết bị hóa chất sử dụng 19 2.2.1 Thiết bị sử dụng .19 2.2.2 Hóa chất 19 2.2 Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh 20 2.2.1.1 Nguyên tắc 20 2.2.2.2 Tiến hành 20 2.2.2 Phương pháp thu nhận EPS 21 2.2.2.1 Quy trình 21 2.2.2.2 Thuyết minh quy trình 22 2.2.3 Phương pháp xác định mật độ tế bào 22 2.2.3.1 Nguyên tắc 22 2.2.3.2 Tiến hành 22 2.2.4 Phương pháp xác định pH .23 2.2.5 Phương pháp định lượng EPS 23 2.2.5.1 Nguyên tắc 23 2.2.5.2 Cách tiến hành 23 2.2.6 Phương pháp toán học 24 PHẦN KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Khảo sát tìm chủng có khả sinh EPS cao môi trường MRS .24 3.2 Khảo sát khả sinh tổng hợp EPS chủng Lactobacillus plantarum R8 môi trường thay 26 3.2.1.Môi trường thay glucose saccharose .26 3.2.2 Môi trường thay glucose lactose .28 3.2.3 Môi trường thay glucose đường nước dừa 29 3.3 So sánh môi trường .31 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 33 I.Kết luận 33 II.Kiến nghị 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO 34 PHỤ LỤC .39 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế tổng hợp EPS 13 Hình 3.1 25 Hình 3.2 Hàm lượng EPS chủng vi khuẩn Lactobacillus plantarum R7, R8, R12, T12T1 môi trường MRS 25 Hình 3.2 Hàm lượng EPS chủng Lactobacillus plantarum R8 môi trường thay glucose saccharose 27 Hình 3.3 Hàm lượng EPS chủng R8 môi trường thay glucose lactose 28 Hình 3.4 Hàm lượng EPS chủng R8 môi trường thay glucose đường nước dừa .30 Hình 3.5 Hàm lượng EPS chủng R8 môi trường 31 ĐẶT VẤN ĐỀ Ngày nay, với tiến khoa học công nghệ, người ngày tiếp cận gần hơn, hiểu biết nhiều giới sinh vật nói chung hệ vi sinh vật nói riêng Với bước tiến mình, nhà khoa học nghiên cứu thành cơng nhiều sản phẩm sản xuất từ vi sinh vật, góp phần quan trọng cơng nghiệp sản xuất, y học, xử lý môi trường Một sản phẩm quan trọng exopolysaccharides [32] Exopolysaccharides polymer trọng lượng phân tử cao, tiết số vi khuẩn nấm vào môi trường xung quanh [5] Việc sinh tổng hợp exopolysaccharides phụ thuộc vào chủng vi khuẩn, điều kiện vật lý, thành phần môi trường sử dụng nuôi cấy Trong số nhiều loại exoplysaccharides sản xuất vi sinh vật, vi khuẩn Lactic (LAB) sử dụng nhiều vào thời gian gần quan tâm lợi ích exopolysaccharides từ vi khuẩn nghiên cứu cho thấy thuộc tính an tồn sức khỏe [10] Hơn nữa, việc sản xuất exopolysaccharides từ vi khuẩn dễ dàng tạo lượng lớn thời gian ngắn so với polysaccharides sản xuất từ thực vật tảo Exoplysaccharides từ Lactobacillus plantarum C88 (Li Zhanga cộng sự, 2013)[40] báo cáo tạp chí quốc tế sinh học phân tử có tác dụng chống oxy hóa, giảm cholesterol máu … exoplysaccharides từ Lactobacillus plantarum 70810 (Kun Wang cộng sự)[38] xem chế phẩm sinh học: giảm cholesterol, bảo vệ gan, có tiềm probiotic hồn thiện cấu trúc cho sản phẩm thực phẩm Exoplysaccharides từ Lactobacillus debrueckii subsp.bulgaricus (Junko Nishimura, 2014) [8] góp phần vào chức vật lý sinh học sản phẩm sữa, ra, giúp tăng cường hệ thống miễn dịch giảm cholesterol Theo báo cáo K.Czaczyk cộng (2007) [6] cho thấy hầu hết polysaccharides ngoại bào có vai trị quan trọng việc hình thành màng sinh học Việc phát phát triển exopolysaccharides vi sinh vật mang lại lợi ích to lớn công nghiệp Trong công nghiệp thực phẩm góp phần vào việc tạo hương vị, kết cấu, thời hạn sử dụng thực phẩm lên men (De Vuyst and Degeest 1999) Exopolysaccharides có vai trò quan trọng bệnh nhiễm trùng nội nha Màng sinh học exopolysaccharides ứng dụng làm màng lọc sinh học xử lý môi trường màng trị bỏng y học [29-32] Xuất phát từ vấn đề nên thực đề tài: “Tuyển chọn xác định điều kiện ni cấy thích hợp để chủng Lactobacillus plantarum (R7, R8, R12, T12T1) có khả sinh tổng hợp exopolysaccharides cao’’ với mục đích : - Khảo sát khả sinh tổng hợp Exopolysaccharides chủng Lactobacillus plantarum (R7, R8, R12, T12T1) môi trường MRS để chọn chủng sinh tổng hợp EPS cao - Khảo sát khả sinh tổng hợp EPS chủng cao môi trường : thay glucose saccharose, thay glucose lactose, thay glucose hàm lượng đường có nước dừa PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan vi khuẩn lactic 1.1.1 Giới thiệu chung vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic vi khuẩn gram dương, hình cầu que, catalase oxidase âm tính, khơng hình thành bào tử, khơng di động, nhiều lồi chúng vi khuẩn kỵ khí, vi khuẩn hiếu khí có khả tồn hiếu khí kỵ khí.catalase âm tính, sống điều kiện từ vi hiếu khí đến kị khí nghiêm ngặt Chúng thu nhận lượng nhờ phân giải hydratcacbon sản xuất số lượng lớn axit lactic số nhỏ hợp chất khác sản phẩm q trình chuyển hóa carbonhydrate chúng [9] Các nhóm chủ yếu vi khuẩn lactic bao gồm Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus Streptococcus Ngồi cịn có nhóm khác Tetragenococcus Vagococcus [9] Các vi khuẩn lactic tìm thấy thực phẩm (sản phẩm từ sữa, thịt lên men, bột chua, rau lên men, đồ uống, thức ăn ủ rượu…), cây, nước thải, đường sinh dục, đường ruột hô hấp người động vật [2] Trong ngành công nghiệp thực phẩm, vi khuẩn lactic hoạt động sinh vật có lợi đồng thời sinh vật gây hư hỏng Chúng sử dụng sản xuất sản phẩm sữa lên men sữa chua, mát, bơ, sản xuất xúc xích, dưa chua, dưa cải bắp… Kết trình lên men ổn định chất lượng tạo hương vị đặc trưng cho sản phẩm Tuy nhiên, phát triển vi khuẩn lactic khơng kiểm sốt chúng nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm Các chi thường sử dụng trình công nghiệp Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Oenocococcus Streptocococcus 1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic loài lên men bắt buộc, chúng khơng có cytochrome.Tuy nhiên, chúng sinh trưởng điều kiện có oxy khơng khí nhờ có peroxydase giúp phân giải H 2O2 thành H2O O2 Vì vậy, người ta thường gọi vi sinh vật sinh vật hiếu khí tùy ý kị khí khơng bắt buộc [2] Khả sinh tổng hợp hợp chất cần cho sống yếu, nên chúng vi sinh vật đa khuyết dưỡng nhiều axit amin, nhiều loại vitamin…, khơng có khả tổng hợp nhân hem porphyrine Vi khuẩn lactic có nhu cầu chất sinh trưởng phức tạp Không đại diện nhóm phát triển mơi trường muối khoáng khiết chứa glucose Đa số chúng cần hàng loạt vitamin (lactoflavin, tiamin, axit pantotenic, axit nicotinic, axit folic, biotin) amino acid Vi khuẩn lactic có nhóm chủ yếu Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus Streptococcus Theo phân loại vi khuẩn lactic có khoản 20 chi, nhiên công nghệ thực phẩm sử dụng chi sau : Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Oenococc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella [9] 1.1.3 Phân loại chủng vi khuẩn lactic [9] 1.1.3.1 Enterococcus, Lactococcus, Streptococcus Mặc dù có phân tách hình thành chi chi Streptococcus chi lớn khó phân loại cách hồn hảo Chi phân thành ba nhóm: trùng sinh mủ, đường uống liên cầu khuẩn streptococci khác Nhóm sinh mủ có chứa số tác nhân gây bênh bật Streptococcus pyogenes Streptococcus agalactiae Một tác nhân khác Streptococcus pneumonia trước thuộc nhóm chuyển qua nhóm đường uống, chủ yếu loài liên quan đến khoang miệng người động vật Một số liên cầu khuẩn đường miệng, ví dụ Streptococcus mutans tác nhân sâu nhiễm trùng khác Loài ứng dụng công nghệ thực phẩm Streptococcus thermophilus, sử dụng sản xuất sữa chua số loại phơ mai Lồi xếp vào nhóm Streptococcus “khác” Chúng có khả chịu nhiệt cao, phát triển nhiệt độ 52oC Lactococcus có liên hệ chặt chẽ với cơng nghệ chế biến sữa, số năm lồi cơng nhận có Lactococcus lactic thực sử dụng cơng nghệ sản xuất sữa Ba phân lồi Lactococcus lactic phân biệt: Lactococcus lactic subsp lactic, Lactococcus lactic subsp cremoris, Lactococcus lactic subsp hordniae Có hai loài quan trọng chế biến sữa Lactococcus lactic subsp lactic phân biệt với Lactococcus lactic subsp Cremoris khơng có khả phát triển 40oC, phát triển nồng độ NaCl 4%, thủy phân arginine, lên men ribose Đặc điểm phân biệt Lactococcus, Enterococcus Streptococcus chủ yếu dựa vào khả phát triển nhiệt độ khác nồng độ NaCl khác Trong chủng Lactococcus phát triển 45 oC, NaCl 6,5% pH 9,6 chủng Enterococcus lại phát triển ba điều kiện trên, khơng có quy luật chung cho nhóm Streptococcus Một số lồi Enterococcus, đặc biệt Enterococcus faecalis tác nhân gây bệnh hội, chúng khơng mong muốn có thực phẩm Tuy nhiên nay, chế phẩm Enterococcus faecium Enterococcus faecalis sử dụng probiotic Enterococcus chứng minh có mặt số loại phô mai địa phương châu Âu số sản phẩm từ thịt 1.1.3.2 Aerococcus, Pediococcus Chi Aerococcus có năm lồi Nhìn chung chi có vai trị cơng nghệ thực phẩm Pediococcus dạng vi khuẩn lactic di động, catalase oxydase âm tính, Gram dương, lên men đồng hình, chịu axit Pedicoccus đóng vai trị quan trọng cơng nghệ thực phẩm Pediococcus damnosus, Pediococcus claussenii Pediococcus inopinatus, phân lập từ bia tìm thấy nhà máy bia Pediococcus damnosus tác nhân làm hỏng bia, phát triển chúng dẫn đến tạo thành diacetyl acetoin, gây đục bia, tạo mùi chua, làm cho bia có vị giống bơ làm cho bia nhớt Pediococcus acidilactici Pediococcus pentosaceus sử dụng làm giống nuôi cấy khởi đầu sản xuất xúc xích, chúng cịn có vai trị quan trọng chín phơ mai Trong chăn nuôi gia cầm Pediococcus acidilactici sử dụng để làm chế phẩm sinh học thúc đẩy tăng trưởng bảo vệ vật chủ Các đặc tính để phân biệt loài loại đường lên men, thủy phân arginine, tăng trưởng mức pH khác (7,0 4,5) 1.1.3.3 Leuconostoc, Oenococcus Các nghiên cứu phát sinh loài tiết lộ Leuconostocs rượu vang cịn gọi Leuconostocs oenos, có họ hàng xa với Leuconostocs khác lồi tách tạo thành chi Chi gọi Oenococcus Chi có khả chịu nồng độ rượu axit cao Leuconostoc phát rau xanh rễ cây, sản phẩm lên men từ thực vật dưa chuột, kim chi, củ cải có nguyên liệu sữa, sản phẩm từ sữa, thịt gia cầm, cá Đáng ý phân lập từ ruột cá Leuconostoc carnosum, Leuconostoc gasicomitatum Leuconostoc gelidum liên quan đến việc làm hư hỏng thực phẩm, làm biến đổi khơng khí sản phẩm đóng gói, làm phồng gói thay đổi màu sắc, mùi vị 1.1.3.4 Lactobacillus Chi Lactobacillus chi lớn nhóm vi khuẩn lactic Chúng vi khuẩn gram dương, catalase âm tính, sinh trưởng điều kiện kỵ khí khơng bắt buộc vi hiếu khí Chi gồm khoản 80 lồi khơng đồng hình thái, đặc điểm sinh hóa, sinh lý Tế bào Lactobacillus hình que thường có đường kính (0,5 -1,2)× (1,0 – 10,0)µm, kết thành chuỗi ngắn có dạng gần giống hình cầu Khuẩn lạc mơi trường agar có kích thước 2-5nm, dạng lồi, mờ đục, khơng nhuộm màu Những tế bào địi hỏi mơi trường ni cấy phức tạp giàu dinh dưỡng, có khả lên men thủy phân số loại đường, nửa sản phẩm lên men từ nguồn cacbon lactate Không khử nitrat, không làm tan gelatin, khơng có catalase cytochorme Các lồi chi Lactobacillus tiến hành lên men lactic đồng hình thơng qua đường Embden-Meyerhof dị hình thơng qua đường pentosephosphate Chúng phát triển mạnh mơi trường có tính axit, tùy lồi mà pH dao động từ 4,5 đến 6,4 Nhiệt độ tối thích cho phát triển 30-400C Lactobacillus tồn tự nhiên thực vật đất, thể người đường tiêu hóa, niệu sinh dục, khoang miệng Lactobacillus tồn nhiều loại thực phẩm khác an toàn, chúng sử dụng làm khởi điểm cho trình lên men thực phẩm sử dụng làm chế phẩm sinh học Được tìm thấy nhiều sản phẩm sữa chua, phomat, sữa lên men Các sản phẩm truyền thống kim chi Hàn Quốc sữa chua kerfi Vì chúng sống sót môi trường axit nên thường dùng ủ chua thức ăn lên men rau Các chủng sử dụng ủ chua thức ăn gia súc Lactobacillus plantarum Lactobacillus buchneri Chi Lactobacillus tìm thấy loại thịt, Lactobacillus sakei tìm thấy thịt lên men Trong đồ uống cồn bia, rượu vang, đóng vai trị vào việc tạo hương vị cho sản phẩm Tuy nhiên, chúng làm hỏng thực thấp tương ứng với 65,767 (µg/ml) 61,797 (µg/ml), Lactobacillus plantarum R7 85,675 (µg/ml) Như vậy, chủng Lactobacillus plantarum R8 có khả sinh tổng hợp EPS cao chủng Lactobacillus plantarum R7, R8, R12, T12T1 Do đó, chọn chủng Lactobacillus plantarum R8 để thực thí nghiệm 3.2 Khảo sát khả sinh tổng hợp EPS chủng Lactobacillus plantarum R8 môi trường thay Thành phần môi trường nuôi cấy quan trọng việc sinh tổng hợp EPS Nguồn cacbonhydrat yếu tố tác động thiếu đến suất EPS Đường nguồn cacbon thường sử dụng cho việc sản xuất EPS vi khuẩn Glucose, galactose, mannose sử dụng chất tiêu chuẩn monosaccharide Do đó, tiến hành thay glucose loại đường dissaccharides: saccharose, lactose để khảo sát khảo hấp thụ vi khuẩn sinh tổng hợp EPS Ngoài ra, thay glucose hàm lượng đường có nước dừa – sản phẩm nơng nghiệp để giảm chi phí sản xuất, tìm nguồn nguyên liệu phong phú, rẻ tiền chất lượng lượng tốt, độ tinh khiết cao điều cần thiết Vì vậy, tiến hành khảo sát môi trường thay glucose MRS nguồn: saccharose, lactose nước dừa để đánh giá ảnh hưởng nguồn cacbonhydrate việc sinh tổng hợp EPS chủng Lactobacillus plantarum R8 3.2.1.Mơi trường thay glucose saccharose Thí nghiệm thực môi trường thay glucose môi trường MRS saccharose nồng độ khác nhau: 0,5%, 1%, 1,5%, 2% nhằm khảo sát khả hấp thụ đường saccharose chủng Lactobacillus plantarum R8 để sinh tổng hợp EPS 26 Kết trình bày hình 3.2 Hình 3.2 Hàm lượng EPS chủng Lactobacillus plantarum R8 môi trường thay glucose saccharose Chú thích: (Đ/C): 2% glucose + 0% saccharose, (I): 1.5% glucose + 0,5 % saccharose, (II): 1% glucose + 1% saccharose, (III): 0,5% glucose + 1,5% saccharose, (IV): 0%glucose + 2% saccharose Qua bảng 3.2 ta thấy ứng với nồng độ môi trường khác cho ta hàm lượng EPS khác Hàm lượng EPS giảm dần từ môi trường đối chứng (2% glucose + 0% saccharose) đến môi trường IV (0%glucose + 2% saccharose) Ở môi trường đối chứng, hàm lượng EPS thu 34,168 µg/ml cao mơi trường khảo sát Ở môi trường IV, hàm lượng EPS thu thấp 14,899 µg/ml 27 Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Looijesteijn cộng (1999) công bố hoạt động sinh tổng hợp EPS chủng L lactis NIZO B40 môi trường saccharose thấp so với loại đường khác : glucose, maltose, lactose … Nghiên cứu Korakli M (2002) chủng Lactobacillus sanfranciscensis cho kết tương tự Như Đường saccharose khơng thích hợp để thay glucose cho việc sinh tổng hợp EPS chủng R8 3.2.2 Môi trường thay glucose lactose Thí nghiệm thực mơi trường thay glucose môi trường MRS lactose nồng độ khác nhau: 0,5%, 1%, 1,5%, 2% nhằm khảo sát khả hấp thụ đường lactose chủng Lactobacillus plantarum R8 để sinh tổng hợp EPS Kết trình bày hình 3.2 Hình 3.3 Hàm lượng EPS chủng R8 môi trường thay glucose lactose 28 Chú thích : (Đ/C): 2% glucose + 0% lactose, (I): 1.5% glucose + 0,5 % lactose, (II): 1% glucose + 1% lactose, (III): 0,5% glucose + 1,5% lactose, (IV): 0%glucose + 2% lactose Qua bảng 3.3 ta thấy ứng với nồng độ môi trường lactose khác cho ta hàm lượng EPS khác Hàm lượng EPS tăng dần từ môi trường đối chứng (2% glucose + 0% lactose) đến môi trường IV (0%glucose + 2% lactose) Ở môi trường đối chứng, hàm lượng EPS thu 28,735 µg/ml thấp mơi trường khảo sát Ở môi trường IV, hàm lượng EPS thu cao 71,566 µg/ml Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Cerning J cộng (1994) Cerning J cộng (1994) nghiên cứu chủng Lactobacillus casein CG11 môi trường thay glucose lactose Khi tăng hàm lượng lactose tương ứng từ 5, 10, 20 g/l hàm lượng EPS tăng lên tương ứng từ 10, 15, 45 mg/l Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Mozzi F cộng chủng Lactobacillus casei CRL 87 cho thấy tác dụng lalactose glucose vào phản ứng tăng trưởng EPS bắt đầu cách tăng nồng độ lactose Như đường lactose sử dụng để thay thể glucose cho việc sinh tổng hợp EPS chủng R8 3.2.3 Môi trường thay glucose đường nước dừa Nước dừa sản phẩm phụ nông nghiệp giàu chất dinh dưỡng (Shivakumar Vijayendra, 2006) có chứa nồng độ đường cao (glucose g/l, fructose 6,1 g/l, sucrose 6,7 g/l), nitơ thành phần nhỏ khoảng 10 MGN / l (Unagul et al., 2007) Việc sử dụng nước dừa nguồn carbon chi phí thấp cho sản xuất EPS Agrobacterium sp (Shivakumar Vijayendra, 2006) scleroglucan Sclerotium rolfsii MTCC 2156 (Survase et al., 2007) nghiên cứu [25-26] 29 Hình 3.4 Hàm lượng EPS chủng R8 môi trường thay glucose đường nước dừa Chú thích: Đ/C: 2% glucose + 0% glucose có nước dừa (100% nước cất), (I):1,5% glucose + 5% glucose có nước dừa (50% nước cất + 50% nước dừa), (II): 1% glucose + 1% glucose nước dừa (0% nước cất + 100% nước dừa Qua bảng 3.4 ta thấy ứng với nồng độ môi trường khác cho ta hàm lượng EPS khác Hàm lượng EPS tăng dần Ở mẫu Đ/C (2% glucose + 0% glucose có nước dừa) cho hàm lượng EPS thấp 35,675 µg/ml Ở mơi trường II (1%glucose + 1% glucose có nước dừa) 30 cho hàm lượng EPS cao 102,296 µg/ml Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Ampin Kuntiya cộng chủng Lactobacillus confusus TISTR 1489 thay glucose đường nước dừa Như vậy, nước dừa có thành phần dinh dưỡng phong phú: đường, vitamin, chất khoáng … cần thiết cho phát triển chủng R8 để sinh tổng hợp EPS Do đó, nước dừa nguồn hiệu để sản xuất EPS 3.3 So sánh môi trường Sau khảo sát khả sinh tổng hợp EPS chủng Lactobacillus plantarum R8 môi trường: môi trường MRS, môi trường thay glucose saccharose, môi trường thay glucose lactose, môi trường thay glucose đường nước dừa Chúng tơi tiến hành thí nghiệm so sánh mơi trường để chọn môi trường tối ưu sinh EPS cao Kết thể hình 3.5 Hình 3.5 Hàm lượng EPS chủng R8 mơi trường Chú thích: (1): mơi trường MRS, (2): môi trường thay glucose saccharose, (3): môi trường thay glucose lactose, (4): môi trường thay glucose đường nước dừa Qua hình 3.5 ta thấy, mơi trường khảo sát mơi trường (1) cho EPS cao nhất: 114,991 µg/ml Mơi trường (4) cho hàm lượng EPS không thấp so với mơi trường (1): 102,296 µg/ml Cho hàm lượng 31 EPS thấp mơi trường (2): 34,169 µg/ml Kết nghiên cứu phù hợp với kết nghiên cứu tác giả Yuksekdag N.Z cộng (2008) Yuksekdag N.Z cộng (2008) nghiên cứu chủng Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus (B3, G12) Streptococcus thermophilus (W22) mơi trường có chứa nguồn carbon khác nhau: glucose, fructose, sucrose, lactose Đối với môi trường sử dụng fructose, lactose glucose, chủng B3 cho hàm lượng EPS tương ứng là: 180, 203 211 mg/l Chủng G12 cho hàm lượng EPS tương ứng là: 69, 113 175 mg/l Đối với W22, với môi trường chứa sucrose, fructose, lactose glucose cho hàm lượng EPS tương ứng là: 34, 40, 114 120 mg / L Như vậy, sử dụng fructose sucrose làm nguồn cacbon hàm lượng EPS giảm đáng kể Glucose cho hàm lượng EPS cao Cerning J cộng (1994) nghiên cứu chủng Lactobacillus casein CG11 mơi trường có chứa nguồn carbon khác nhau: glucose, lactose, galactose, maltose, cho hàm lượng EPS sau: glucose cao 160mg/l, lactose 45mg/l, galactose 20mg/l, maltose 60mg/l Durlu-Ozkaya F cộng (2007) [57] báo cáo hàm lưởng EPS sản xuất Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus NCFB 2772 môi trường thay cho hàm lượng EPS 25 mg/l nuôi cấy fructose 80 mg/l trồng glucose cao Ngoài ra, kết nghiên cứu tác giả Nisha P cộng (2005), Lactobacillus plantarum, glucose nguồn cacbon hiệu galactose, lactose, sucrose, maltose raffinose môi trường thay [53] Cerning J (1990), sản xuất EPS Lactobacillus casei CG11 điều tra môi trường tối thiểu chứa galactose, glucose, lactose, sucrose, maltose, melibiose; glucose nguồn carbon hiệu [61] Như vậy, môi trường MRS sử dụng glucose cho kết sinh tổng hợp EPS cao (114,991 µg/ml) mơi trường khảo sát Tuy nhiên môi trường nước dừa cho EPS không thấp so với mơi trường MRS (102,296 µg/ml) Các kết từ nghiên cứu cho thấy nước dừa nguồn dinh dưỡng tự nhiên, giá rẻ Sử dụng nước dừa làm môi trường để sản xuất EPS giảm chi phí sản xuất Do đó, việc sử dụng chất rẻ để thay cho vật liệu chi phí cao chất lượng tốt tinh khiết quan trọng Nước dừa đáp ứng vấn đề 32 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ I.Kết luận Qua kết đạt trên, rút số kết luận sau:  Đã xác định chủng sinh tổng hợp EPS cao khảo sát chủng Lactobacillus plantarum R7, R8, R12, T12T1 nuôi cấy mơi trường MRS có bổ sung 2%lactose 1%glucose chủng Lactobacillus plantarum R8  Đã xác định môi trường thay sinh EPS cao nuôi cấy chủng Lactobacillus plantarum R8 môi trường: môi trường MRS, môi trường thay glucose MRS saccharose, môi trường thay glucose MRS lactose, môi trường thay glucose MRS đường nước dừa là: môi trường MRS bổ sung 2% lactose 1% glucose với hàm lượng EPS: 114,991 µg/ml  Mơi trường nước dừa cho EPS không thấp so với mơi trường MRS (102,296 µg/ml) Do đó, việc sử dụng nước dừa làm môi trường thay để sinh tổng hợp EPS có ý nghĩa mặt thực tiễn, đồng thời, tiết kiệm chi phí sản xuất II.Kiến nghị Từ kết đạt trên, để tăng hiệu ứng dụng đề tài này, chúng tơi đề nghị thêm hướng sau: Thí nghiệm môi trường sinh tổng hợp EPS cao nhất, khảo sát điều kiện ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp EPS môi trường này: thời gian nuôi cấy, pH môi trường, mật độ tế bào độ acid tổng số 33 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Alan D and Ian S (2003), “Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges”, Trends in Biotechnology Vol.21 No.6, 269-274 [2] Axelsson L (2004), “Classification and physiology”, In Advance in Lactic Acid Bacteria: Microbiological and Functional Aspects, pp 1-66 [3] Bouazzaoui K., LaPointe G (2006), “Use of antisense RNA to modulate glycosyltransferase gene expression and exopolysaccharide molecular mass in Lactobacillus rhamnosus”, Journal of Microbiological Methods 65 : 216– 225 [4] Cerning J., Thibault F., Bouillanne C., Landon M., Desmazeaud M and L Topisirovic L.(1994), “Carbon Source Requirements for Exopolysaccharide Production by Lactobacillus casei CG11 and Partial Structure Analysis of the Polymer”, Appl Environ Microbiol Nov; 60(11): 3914–3919 [5] Cerning J (1990), “Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria”, FEMS Microbiol Rev 87: 113-130 [6] Czaczyk K., Myszka K, (2007), “Biosynthesis of Extracellular Polymeric Substances (EPS) and Its Role in Microbial Biofilm Formation” Department of Biotechnology and Food Microbiology, Vol 16, No 6, 799-806 [7] De Vuyst L., Degeest L., (1999) “Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria”, FEMS Microbiol Rev 23, 153 [8] Durluozkaya F, Aslimb B, Ozkaya MT (2007) “Effect of exopolysaccharides produced by LactoBacillus delbrueckii subsp bulgaricus strains to bacteriophage and nisin sensitivity of the bacteria” LWT 40: 564–568 [9] Fennema R.O., Hui H.Y., Karel M., Walstra P., Whitake R.J (2004) “Lactic Acid Bacteria”, Food Science and Technology [10] Freitas F., Vitor D and Maria A (2011), “Advances in bacterial exopolysaccharides: from production to biotechnological applications”, Trends in Biotechnology, Vol 29, No 8, 388-398 34 [11] Fukuda K., Shi T., Nagami K., Leo F., Nakamura F., Yasuda K., Senda A., Motoshima H., Urashima H (2010) “Effects of carbohydrate source on physicochemical properties of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus fermentum TDS030603 in a chemically defined medium”, Carbohydrate Polymers 79: 1040–1045 [12] Gerard W., Imberty A., Dick J.C., Johannes F.G., Perez S (1996), “Predicting helical structures of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus sake”, Carbohydrate Research 288: 57-74 [13] Harutoshi T “Exopolysaccharides of Lactic Acid Bacteria for Food and Colon Health Applications”, Additional information is available at the end of the chapter [14] Julie A., Steve Labrie S., Roy D and LaPointe G., (2010) , “Sugar source modulates exopolysaccharide biosynthesis in Bifidobacterium longum subsp.longum CRC 002”, Microbiology 156: 653–664 [15] Korakli M., (2002), “Sucrose metabolism and exopolysaccharide production by Lactobacillus sanfranciscensis” [16] Laws A., Chadha M., Chacon-Romero M., Marshall V and Maqsood M (2008), “Determination of the structure and molecular weights of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus acidophilus when grown on different carbon feeds”, Carbohydrate Research 343: 301–307 [17] Lynch K., Paul L., Elke K., Galle S., Coffey A (2014), “Isolation and characterisation of exopolysaccharide-producing Weissella and Lactobacillus and their application as adjunct cultures in Cheddar cheese”, International Dairy Journal 34: 125-134 [18] Mishra A., Jha B.,“Microbial Exopolysaccharides”, Discipline of Marine Biotechnology and Ecology, CSIR-Central Salt and Marine Chemicals Research Institute (CSIR-CSMCRI), Bhavnagar, Gujarat, India, 180-193 [19] Monsan P., Bozonnet S., Albenne C., Joucla G., Willemot R., (2001) “Homopolysaccharides from lactic acid bacteria”, Int Dairy J 11, 675 35 [20] Mozzi F., Rollan G (2001), “Effect of lalactose and glucose on the exopolysaccharide production and the activities of biosynthetic enzymes in Lactobacillus casei CRL 87”, Journal of Applied Microbiology 91: 160-167 [21]8 Nichols, C.M.; Lardiere, S.G.; Bowman, J.P.; Nichols, P.D.; Gibson, J.A.E.; Guézennec, J (2005), “Chemical characterization of exopolysaccharides from Antarctic marine bacteria”, Microb Ecol., 49, 578– 589 [22] Nisha P., Ananthanarayan L., Singhal R (2005), “Effect of stabilizers on stabilization of idli (traditional south Indian food batter during storage” , Food Hydrocolloids 19: 179-186 [23] Nishimura J (2014), “Exopolysaccharides Produced from Lactobacillus delbrueckii subsp Bulgaricus”, Advances in Microbiology 4: 1017-1023 [24] Nwodo U., Green E and Okoh A (2012) “Bacterial Exopolysaccharides: Functionality and Prospects”, International Journal of Molecular Sciences [25] Otero A., Vincenzini M., (2003), “Extracellular polysaccharide synthesis by Nostoc strains as affected by Nito source and light intensity”, Journal of Biotechnology 102 :143-152 [26] Patel A and Prajapati J (2013) “Food and Health Applications of Exopolysaccharides produced by Lactic acid Bacteria”, Advances in Dairy Research, 2-7 [27] Pindar, D.F.; Bucke, C (1975) “The biosynthesis of alginic acid by Azotobacter vinelandii Biochem” 617- 622 [28] Rabha B., Sidhoum Nadra R., and Ahmed B (2012), “Effect of Some Fermentation Substrates and Growth Temperature on Exopolysaccharide Production by Streptococcus Thermophilus BN1”, International Journal of Bioscience, Biochemistry and Bioinformatics, Vol 2, No 1, 44-47 [29] Rehm, B.H.A ( 2010) “Bacterial polymers: Biosynthesis, modifications and application” Nat Rev.Microbiol 2010, 8, 578–592 36 [30] Saidhussein A., Saber ibrahim G., (2008), “Exopolysaccharide from Lactobacillus helveticus: Identification of Chemical Structure and Effect on Biscuit Quality” [31] Sutherland I W (2001), “Microbial polysaccharides from Gram-negative bacteria”, Int Dairy J 11, 663 [32] Uchechukwu N , Ezekiel Green and Anthony O., (2012), “Bacterial Exopolysaccharides: Functionality and Prospects”, International Journal of Molecular Sciences, 13: 14002-14015 [33] Vanhooren P, Vandamme EJ (1998) “Biosynthesis physiological role use and fermentation process characteristics of bacterial exopolysaccharides Recent research developments in fermentation and bioengineering” 1: 253-299 [34] Vigliar R., Vera L., Fagundes U (2006), “Biochemical profile of coconut water from coconut palms planted in an inland region”, Biochemical profile of coconut water , Vol 82, No.4, 308-312 [35] Wang Y., Ahmed Z., Feng W., Li C., Song S (2008), “Physicochemical properties of exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens ZW3 isolated from Tibet kefir”, International Journal of Biological Macromolecules 43: 283–288 [36] Wang K., Li W., Rui X., Chen X., Jiang M., Dong M (2014), “Characterization of a novel exopolysaccharide with antitumor activity from Lactobacillus plantarum 70810”, International Journal of Biological Macromolecules 63 :133– 139 [37] Wang Y., Li C., Liu P., Ahmed Z., Xiao P., Bai X (2010), “Physical characterization of exopolysaccharide produced by Lactobacillus plantarum KF5 isolated from Tibet Kefir”, Carbohydrate Polymers 82: 895–903 [38] Wang K., Li W., Rui X., Chen X., Jiang M., Dong M (2014) “Characterization of a novel exopolysaccharide with antitumor activity from Lactobacillus plantarum 70810”, International Journal of Biological Macromolecules 63: 133– 139 [39] Yuksekdag N.Z., Aslim B., (2008), “Influence of different carbon sources on exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp 37 bulgaricus (B3, G12) and Streptococcus thermophilus (W22)”, Brazilian Archives of Biology and Technology, vol.51 no.3 [40] Zhanga L., Liub C., Li D., Zhaoa Y., Zhanga X., Zenga X., Yanga Z., Li S (2013) “Antioxidant activity of an exopolysaccharide isolated from Lactobacillus plantarum C88”, International Journal of Biological Macromolecules 54: 270– 275 38 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kết hàm lượng EPS chủng Lactobacillus plantarum R7, R8, R12, T12T1 môi trường MRS Phụ lục 2: Kết hàm lượng EPS chủng Lactobacillus plantarum R7, R8, R12, T12T1 môi trường MRS 39 Phụ lục 3: Kết hàm lượng EPS chủng Lactobacillus plantarum R8, , môi trường thay glucose lactose Phụ lục 4: Kết hàm lượng EPS chủng Lactobacillus plantarum R8, , môi trường thay glucose lactose 40 ... ? ?Tuyển chọn xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp để chủng Lactobacillus plantarum (R7, R8, R12, T12T1) có khả sinh tổng hợp exopolysaccharides cao? ??’ với mục đích : - Khảo sát khả sinh tổng hợp. .. khả sinh tổng hợp Exopolysaccharides chủng Lactobacillus plantarum (R7, R8, R12, T12T1) môi trường MRS để chọn chủng sinh tổng hợp EPS cao - Khảo sát khả sinh tổng hợp EPS chủng cao môi trường :... Đã xác định chủng sinh tổng hợp EPS cao khảo sát chủng Lactobacillus plantarum R7, R8, R12, T12T1 nuôi cấy mơi trường MRS có bổ sung 2%lactose 1%glucose chủng Lactobacillus plantarum R8  Đã xác