Phân lập, tuyển chọn và tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn có khả năng sinh axit lactic từ đường xylose

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy cô giáo, gia đình bạn bè Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS TRẦN LIÊN HÀ - Phòng Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, tận tình định hướng, hướng dẫn, truyền cho niềm đam mê nghiên cứu suốt thời gian thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo, nghiên cứu sinh Phí Thị Thanh Mai anh chị, bạn học viên, sinh viên phòng thí nghiệm hóa sinh - sinh học phân tử nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho trình học tập thực luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè người thân động viên, khuyến khích giúp vượt qua khó khăn suốt trình nghiên cứu Hà Nôi, ngày 26 tháng năm 2015 Nguyễn Thị Thùy LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Kết luận văn kết nghiên cứu thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Trần Liên Hà trường Đại học Bách khoa Hà Nội, giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên học tập làm việc phòng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh Sinh học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu kham khảo luận văn Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày 26 tháng năm 2015 Nguyễn Thị Thùy LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI MỤC LỤC DANH MỤC VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC HÌNH DANH MỤC CÁC BẢNG MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .2 1.1 Giới thiệu chung axit lactic 1.1.1 Đặc điểm tính chất axit lactic 1.1.2 Ứng dụng axit lactic 1.2 Quá trình tổng hợp axit lactic 1.2.1 Tổng hợp axit lactic phƣơng pháp hóa học .4 1.2.2 Tổng hợp axit lactic phƣơng pháp sinh học 1.3 Giới thiệu Biomass – nguồn cung cấp Xylose .8 1.3.1 Phân loại .9 1.3.2 Thành phần 1.3.3 Các bƣớc tổng quát để sản xuất axit lactic từ nguyên liệu Biomass 13 1.4 Lên men axit lactic từ đƣờng Xylose 15 1.4.1 Giới thiệu nguồn đƣờng Xylose 15 1.4.1.1 Công thức hóa học 15 1.4.1.2 Tính chất 16 1.4.2 Cơ chế lên men axit lactic từ đƣờng Xylose 16 1.5 Vi khuẩn lên men axit lactic từ Xylose 19 1.5.1 Giới thiệu vi khuẩn lactic 19 1.5.2 Đặc điểm 19 1.5.3 Một số chủng vi khuẩn có khả lên men axit lactic từ xylose 21 1.5.4 Nhu cầu dinh dƣỡng vi khuẩn lactic 23 1.5.4.1 Nguồn dinh dƣỡng carbon .23 1.5.4.2 Nguồn dinh dƣỡng nitơ 24 1.5.4.3 Nguồn dinh dƣỡng vitamin 24 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 1.5.4.4 Các hợp chất khoáng 24 1.5.4.5 Các hợp chất hữu khác 25 1.5.5.Ảnh hƣởng yếu tố môi trƣờng đến sinh trƣởng, phát triển khả lên men tạo axit lacticcủa vi khuẩn lactic 25 1.5.5.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 25 1.5.5.2 Ảnh hƣởng pH 25 1.5.5.3 Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng 26 1.5.5.4 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống 26 1.6 Tình hình nghiên cứu vi khuẩn có khả lên men tạo axit lactic từ Xylose nƣớc giới 26 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU – PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 Vật liệu, hóa chất thiết bị máy móc 28 2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu .28 2.1.2 Dụng cụ hóa chất 28 2.1.3 Môi trƣờng 29 2.2 Các phƣơng pháp nghiên cứu 29 2.2.1 Phƣơng pháp phân lập chủng vi sinh vật 29 2.2.2 Phƣơng pháp tuyển chọn 29 2.2.2.1 Phƣơng pháp cấy chấm điểm 29 2.2.2.2 Phƣơng pháp đục lỗ thạch 29 2.2.2.3 Phƣơng pháp định tính axit lactic 30 2.2.2.4 Phƣơng pháp định lƣợng axit lactic 30 2.2.3 Xác định đặc tính sinh lý – sinh hóa chủng đƣợc chọn 31 2.2.3.1 Quan sát mô tả đặc điểm hình thái khuẩn lạc tế bào 31 2.2.3.2 Quan sát mô tả đặc điểm sinh lý 32 2.2.4 Định tên vi sinh vật phƣơng pháp sinh học phân tử 32 2.2.4.1 Tách chiết DNA tổng số 32 2.2.4.2 Phƣơng pháp điện di gel agarose .33 2.2.4.3 Phản ứng PCR nhân đoạn gen 16S rRNA 34 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 2.2.4.4 Giải trình tự 34 2.3 Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến khả tổng hợp axit lactic chủng vi khuẩn 35 2.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 35 2.3.2 Ảnh hƣởng pH 35 2.3.3 Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng 35 2.3.4 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống 36 2.4 Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy theo phƣơng pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai Box-Behnken 36 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ 39 3.1 Phân lập chủng vi khuẩn có khả lên men tạo axit lactic từ Xylose .39 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả lên men tạo axit lactic cao 41 3.2.1 Định tính axit lactic 41 3.2.2 Xác định lƣợng axit chủng 42 3.2.4 Định lƣợng axit lactic sinh từ hai chủng Y5 Y6 phƣơng pháp HPLC 44 3.3 Đặc điểm sinh lý – sinh hóa chủng Y6 45 3.4 Định tên phƣơng pháp sinh học phân tử 45 3.4.1.Tách DNA tổng số 45 3.4.2 PCR nhân đoạn gen 16S rRNA 46 3.4.3 Giải trình tự DNA 47 3.5 Khảo sát ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy đến khả tổng hợp axit lactic chủng Y6 50 3.5.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 50 3.5.2 Ảnh hƣởng pH 51 3.4.3 Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng .52 3.4.4 Ảnh hƣởng tỷ lệ cấp giống .54 3.6 Tối ƣu quy hoạch thực nghiệm sử dụng phần mềm DX .56 3.7 Động học trình lên men tổng hợp axit lactic chủng Y6 điều kiện tối ƣu 61 CHƢƠNG KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ .63 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 4.1 Kết luận 63 4.2 Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO .64 PHỤ LỤC I LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 16SF Mồi xuôi 16SR Mồi ngƣợc ADP Adenosine diphosphate ATP Adenosine triphosphate Ca Canxi DNA Deoxylribonucleic axit EDTA Ethylenediaminetetraacetic Axit g/L Gam/lít g/g Gam/gam G- Gram âm G+ Gram dƣơng PCR PLA Polymerase Chain Reaction Polylactic axit RNA Ribonucleic Axit SDS Sodium dodecyl sulfate v/p Vòng/ phút v/v Thể tích/ thể tích LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1 Cấu tạo hóa học axit lactic Hình Hai đồng phân quang học axit lactic Hình Quá trình lên men glucose vi khuẩn lactic .6 Hình Sơ đồ chuyển hoá glucose thành axit lactic lên men đồng hình .7 Hình Cấu trúc lignocelluloses Hình Các loại cấu trúc tiêu biểu hemicelluloses .12 Hình Phân tử xylan chế chuyển đổi sang Xylose 13 Hình Sơ đồ tổng hợp axit lactic từ sinh khối thực vật 14 Hình Cấu tạo đƣờng Xylose .15 Hình 10 Cơ chế lên men lactic từ đƣờng Xylose 18 Hình 11 Vi khuẩn Latobacillus brevis 21 Hình 12 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum .22 Hình 13 Vi khuẩn Streptococcus lactis .22 Hình 14 Vi khuẩn Lactobacillus fermentum .23 Hình Kết thử thuốc thử Uffelmann……………………………… 41 Hình Kết cấy chấm điểm chủng đƣợc chọn 42 Hình 3 Kết đục lỗ thạch chủng đƣợc chọn 43 Hình Hàm lƣợng axit tạo thành chủng 43 Hình Hình thái vi bào chủng Y6 .45 Hình Kết điện di tách DNA tổng số 46 Hình Kết điện di sản phẩm sau PCR 46 Hình 8.Cây phân loại độ tƣơng đồng chủng Y6 với chủng thuộc loài Lactobacillus fermentum 47 Hình 9.Kết thử dịch lên men môi trƣờng có glucose thuốc thử Uffelmann 49 Hình 10 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến hàm lƣợng axit tạo thành 50 Hình 11 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng tới hàm lƣợng axit lactic tạo thành 51 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hình 12 Ảnh hƣởng nồng độ dịch đƣờng đến hàm lƣợng axit lactic tạo thành 53 Hình 13 Ảnh hƣởng tỷ lệ giống đến lƣợng axit lactic tạo thành 54 Hình 14 Biểu đồ bề mặt đáp ứng nhiệt độ, pH thay đổi, nồng độ chất giá trị trung bình 59 Hình 15 Biểu đồ bề mặt đáp ứng nhiệt độ, nồng độ chất thay đổi, pH giá trị trung bình 59 Hình 16 Biểu đồ bề mặt đáp ứng pH, nồng độ chất thay đổi, nhiệt độ giá trị trung bình 60 Hình 17 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ƣu để sinh tổng hợp axit 60 Hình 18 Kết thí nghiệm so sánh hàm lƣợng axit lactic điều kiện nuôi cấy L fermentum Y6 61 Hình 19 Động thái trình sinh axit chủng L fermentum Y6 62 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1 Các thành phần lignocellulose 10 Bảng Các biến số khoảng chạy chúng……………………………… 37 Bảng 2 Ma trận thực nghiệm theo quy hoạch thực nghiệm Box - Behnken 37 Bảng Thống kê chủng phân lập đƣợc từ nguồn…………………39 Bảng Kết tuyển chọn chủng vi khuẩn .44 Bảng 3 Kết định lƣợng axit lactic phƣơng pháp HPLC .44 Bảng Bảng thể đặc tính sinh lý – sinh hóa chủng Y6 45 Bảng Các nghiên cứu khác sử dụng vi khuẩn lên men axit lactic từ Xylose 48 Bảng Kết định lƣợng axit lactic HPLC chủng Y6 .55 Bảng Ma trận thực nghiệm Box-Behnken hàm lƣợng axit lactic thu đƣợc 57 Bảng Kết phân tích phƣơng sai mô hình ƣu phần mềm DX7.1.5 58 Bảng Kết phân tích phù hợp mô hình với thực nghiệm 59 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bảng Kết phân tích phù hợp mô hình với thực nghiệm Thông số Giá trị Thông số Giá trị Độ lệch chuẩn 0,63 R2 0,9906 Giá trị trung bình 8,42 R2 hiệu chỉnh 0,9785 Hệ số biến thiên % 7,50 R2 dự đoán 0,9103 Tổng bình phƣơng phần dự 26,63 Độ xác phù hợp 23,066 đoán (PRESS) (Adeq Precision) Bảng 3.9 kết phân tích phù hợp có ý nghĩa mô hình với thực nghiệm Kết phân tích ANOVA cho thấy giá trị R2 0,9906 (R-Squared) bảng 3.9 gần 1, chứng tỏ giá trị OD đo đƣợc từ thực nghiệm gần với giá trị dự đoán mô hình Để tìm vùng tối ƣu cho trình, xây dựng bề mặt đáp ứng trình tác động yếu tố: Hình 14 Biểu đồ bề mặt đáp ứng nhiệt độ, pH thay đổi, nồng độ chất giá trị trung bình Hình 15 Biểu đồ bề mặt đáp ứng nhiệt độ, nồng độ chất thay đổi, pH giá trị trung bình HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 59 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Hình 16 Biểu đồ bề mặt đáp ứng pH, nồng độ chất thay đổi, nhiệt độ giá trị trung bình Biểu đồ đáp ứng bề mặt thể tƣơng tác yếu tố, giá trị đỉnh biểu đồ vùng màu đỏ cho hàm lƣợng axit lactic cao Tối ưu hóa điều kiện sinh tổng hợp axit lactic Sử dụng phƣơng pháp hàm kỳ vọng để tối ƣu hóa hàm lƣợng axit lactic thu đƣợc phần mềm Design-Expert Kết tìm đƣợc 43 phƣơng án thí nghiệm phƣơng án tốt để cực đại hàm mục tiêu dự đoán là: nhiệt độ 37,310C, pH 6,17 nồng độ đƣờng 12,84 g/l Dựa vào phƣơng án đƣợc đƣa ra, xét theo điều kiện thí nghiệm phòng thí nghiệm, đƣa phƣơng án thí nghiệm nhƣ sau: nhiệt độ 37 oC, pH 6,2 nồng độ đƣờng 13 g/L Khi đó, hàm lƣợng axit đạt đƣợc 14,18g/L Kết có độ tƣơng thích cao so với kết kiểm tra thực nghiệm đƣợc thể hình 3.17 Hình 17 Hàm kỳ vọng điều kiện tối ƣu để sinh tổng hợp axit HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 60 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Tiến hành xây dựng biểu đồ thể hàm lƣợng axit từ phân lập tối ƣu yếu tố quy hoạch thực nghiệm chủng Y6, kết cho hình Hàm lƣợng axit (g/L) 3.18 14.18 15 10.64 12 8.78 Hàm lƣợng axit g/L Trƣớc tối ƣu Sau khảo sát Tối ƣu QHTN Hình 18 Kết thí nghiệm so sánh hàm lƣợng axit lactic điều kiện nuôi cấy chủng L fermentum Y6 Từ hình 3.18, ta thấy rõ thay đổi hàm lƣợng axit lactic trƣớc sau tối ƣu Ta thấy chủng L fermentum Y6 thích hợp phát triển nhiệt độ cao, thời gian sinh trƣởng dài Sau khảo sát yếu tố tối ƣu quy hoạch thực nghiệm để xác định tác động đồng thời yếu tố ảnh hƣởng tới khả sinh tổng hợp axit lactic chủng L fermentum Y6 thu đƣợc hàm lƣợng cao 10,64 g/L 14,18 g/L Nhƣ chủng L fermentum Y6 đƣợc tiến hành lên men sinh tổng hợp axit điều kiện: nhiệt độ 37οC; pH 6,2; nồng độ đƣờng 13 g/L tỷ lệ cấp giống 10% 3.7 Động học trình lên men tổng hợp axit lactic chủng Y6 điều kiện tối ƣu Sau tiến hành kiểm tra độ tƣơng thích thực nghiệm trình sinh tổng hợp axit kết cho thấy có sai khác nhỏ, tiến hành xác định động thái trình lên men tổng hợp axit lactic chủng Y6 Trong trình lên men gián đoạn theo mẻ chất dinh dƣỡng không đƣợc bổ sung không thu nhận sản phẩm trao đổi chất Nên sinh trƣởng, phát triển quần thể vi khuẩn bị gián đoạn, tuân theo quy luật bắt buộc qua giai đoạn: pha lag (pha thích ứng), pha log (phát triển lũy tiến), pha cân pha suy vong HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 61 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Đối với trình lên men sinh tổng hợp axit, mẫu L fermentum Y6 đƣợc lên mentrong môi trƣờng: YE – Xylose dịch thể có nồng độ đƣờng xylose 13 g/L, pH = 6,2; cấp giống 10%, khử trùng 110oC 30 phút atm, nuôi tĩnh 37 oC Tiến hành nuôi 168 giờ, sau 24 tiến hành lấy mẫu xác định khối lƣợng sinh khối ƣớt hàm lƣợng axit 16 14 12 10 1.4 14,18 1.2 0.8 0.6 0.4 OD 600 Hàm lƣợng axit (g/L) Kết đƣợc biểu diễn hình 3.19 phụ lục P.9: Axit (g/L) OD 0.2 0 Thời gian (ngày) Hình 19 Động thái trình sinh axit chủng L fermentum Y6 Kết cho thấy, pH dịch lên men giảm dần theo thời gian, tƣơng ứng với tăng lên hàm lƣợng axit sinh dịch nuôi Tiến hành xác định hàm lƣợng axit mẫu chuẩn độ NaOH đến ngày thứ đạt 14,18g/L Từ kết nhận thấy thời điểm thích hợp để thu lƣợng axit lactic lớn cuối pha log, đầu pha cân (ngày thứ 5) trình sinh trƣởng phát triển mẫu L fermentum Y6 HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 62 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI CHƢƠNG KẾT LUẬN & KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Từ kết nghiên cứu, ta rút đƣợc kết luận sau: Từ 20 mẫu thí nghiệm phân lập đƣợc 26 chủng, từ chọn đƣợc chủng cho khả lên men lactic cao - Tuyển chọn: dựa theo phƣơng pháp tuyển chọn, chọn đƣợc chủng Y6 có khả sinh tổng hợp axit lactic cao - Định tên: Tiến hành định tên phƣơng pháp: sinh lý- sinh hóa sinh học phân tử, xác đinh đƣợc chủng Y6 có độ tƣơng đồng 100% so với loài L fermentum Vậy chủng Y6 chủng thuộc loài L fermentum đƣợc gọi chủng Y6 Tiến hành khảo sát đƣợc số yếu tố ảnh hƣởng tới sinh axit lactic mẫu L fermentum Y6: Nhiệt độ:37oC , pH 6, nồng độ đƣờng Xylose 10 g/L tỷ lệ cấp giống 10% sau 120 nuôi cấy hàm lƣợng axit thu đƣợc cao phƣơng pháp chuẩn độ NaOH 10,64 g/L, lƣợng axit lactic 6,5 g/L (xác định phƣơng pháp HPLC) Tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy sinh tổng hợp axit lactic chủng Y6 quy hoạch thực nghiệm bậc 2Box – BenKen cho đƣợc điều : Nhiệt độ 37 oC, pH 6,2 nồng độ đƣờng 13 g/L sau 120 nuôi cấy hàm lƣợng axit thu đƣợc phƣơng pháp chuẩn độ NaOH 14,18 g/L HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 63 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 4.2 Kiến nghị Từ nghiên cứu này, em bƣớc đầu đạt đƣợt thành việc tìm chủng vi khuẩn có tính ứng dụng lên men tạo lactic từ đƣờng Xylose Em mong muốn đề tài đƣợc tiếp tục đƣợc phát triển thời gian tới nhằm hƣớng tới ứng dụng thực tế Dƣới số kiến nghị em cho việc phát triển đề tài: - Tiếp tục khảo sát thêm điều kiện nuôi cấy chủng L.fermentum Y6 nhằm tìm điều kiện tối ƣu cho chủng sinh trƣởng phát triển tốt mang lại lợi ích kinh tế - Tăng thêm nguồn mẫu phân lập để thu thập đƣợc thêm nhiều mẫu cho khả lên men thu lƣợng axit lactic cao - Tiến hành lên mên quy mô lớn với chất dịch thủy phân thực vật đặc biệt rơm rạ sử dụng tác nhân chủng Y6 nhằm sản xuất axit lactic Nâng cao hiệu suất trình lên men, áp dụng vào thực tế HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 63 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI TÀI LIỆU THAM KHẢO O TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Thị Việt Anh (2010), Nghiên cứu công nghệ thiết bị sản xuất chế phẩm vi sinh vật ứng dụng sản xuất thực phẩm lên men truyền thống kiểu công nghiệp, Viện công nghiệp thực phẩm Kiều Hữu Ảnh (1999), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB Khoa học kỹ thuật Phạm Thị Trân Châu (2007), Hóa sinh học, NXB Giáo Dục Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1997), Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Nguyễn Thị Hiền, Rỉ đường mía ứng dụng công nghiệp lên men nước ta, Lƣơng thực thực phẩm (LTTP) số 4/1979/ trang 23-26 Nguyễn Đức Lƣợng cộng (1996), Vi sinh vật công nghiệp – tập 2, Trƣờng Đại Học Bách Khoa TP.HCM Nguyễn Đức Lƣợng, Phan Thị Huyền Nguyễn Ánh Tuyết, 2003, Thí nghiệm công nghệ sinh học, tập 2, thí nghiệm Vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc Gia TP.Hồ Chí Minh, trang 72-73, 414-434, 450-461 Phan Thanh Tâm (2008), Nghiên cứu số giải pháp sinh học công nghệ sản xuất nem chua, Đại học Bách Khoa Hà Nội Trần Minh Tâm (2000), Công nghệ vi sinh ứng dụng NXB Nông nghiệp,111-115 10 Khuất Hữu Thanh (2006), Kỹ thuật gen: Nguyên lý ứng dụng NXB Khoa học Kỹ thuật 11 Trần Linh Thƣớc (2012), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm, NXB Giáo dục Việt Nam TÀI LIỆU TIẾNG ANH 12 Abdel-Rahman, M.A Tashiro, Y., Zendo, T., Hanada, K., Shibata, K, Sonomoto, K., (2011), Efficient homofermentative L-(+)-lactic axit production from xylose by a novel lactic axit bacterium, Enterococcus mundtii QU 25 Appl Environ Microbiol 77, 1892-1985 13 Bevilacqua A.E., Califano A.N (1989), Determination of organic axits in dairy products by high performance liquid chromatography J Food Sci 54: 1076-1079 HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 64 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI 14 Datta, R., et al (1995), Technological and economic potential of poly(lactic axit) and lactic axit derivatives FEMS Microbiology Reviews, 16(2-3): p 221-231 15 Fengel D, Wegener G (1985), Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions, Walter de Gruyter, Berlin and New York 16 Garde Arvid, Gunnar Jonsson, Anette S Schmidt, Birgitte K Ahring (February 2002), Lactic axit production from wheat straw hemicellulose hydrolysate by Lactobacillus pentosus and Lactobacillus brevis Bioresource Technology, Volume 81, Issue 3, Pages 217–223 17 John P Buyondo, Shijie Liu (2011), Lactic axit production by Lactobacillus pentosus from wood extract hydrolysates Journal od Science & Technology for Forest Products and Processes: Vol.1, No.3: 38-47 18 Laopaiboon, P., Thani, A., Leelavatcharamas, V., Laopaiboon, L (2010), Axit hydrolysis of sugarcane bagasse for lactic axit production Bioresour Technol 101, 1036 – 1043 19 Laura J Fooks, Glenn R Gibson (2003), Mixed culture fermentation studies on the effects of synbiotics on the human intestinal pathogens Campylobacter jejuni and Escherichia coli, Anaerobe, 9, p: 231 – 242 20 Michael Malveda, M.B., Takashi Kumamoto (September 2009), Lactic Axit, Its Salts and Esters In Chemical Economics Handbook 21 Milind A.Patel, Mark S Ou, Roberta Harbruker, Henry C.Aldrich, Marian L.Buszko, Lonnie O.Ingram, and K.T Shanmugam (2006), Isolation and characterization of axit tolerant, thermophilic bacteria for Effective Fermentation of biomass- derived sugars to lactic axit 22 Mohamed Ali Abdel - Rahman, Yukihiro Tashiro, Keni Sonomoto, Lactic axit production from lignocelluloses – derived sugars using lactic axit bacteria: Overview and limits 23 Niju Narayanan, P.K.R., Aradhana Srivastava (August 15, 2004), L (+) lactic axit fermentation and its product polymerization, Electronic Journal of Biotechnology, Vol No 2( Issue of August 15, 2004) 24 Ohara, H., Owaki, M., Sonomoto, K., (2006), Xylooligosaccharide fermentation with Leuconostoc lactic J Biosci Bioeng 101, p: 415 – 420 25 Okana, K., Yoshida, S., Yamda, R., Tanaka, T., Ogino, C., Fukuda, H., Kondo, A., (2009), Improved production of homo-D-lactic axit via xylose fermentation by introduction of xylose assimilation genes and redirection of the phosphoketolase pathway to pentose phosphate pathway in L-lactate HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 65 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI dehydrogenase gen-deficient Lactobacillus plantarum Appl Environ Microbiol 75, p: 7858 – 7861 26 Saga, B C., (2003), Hemicellulose bioconversion J Ind Microbiol Biotechnol 30, p: 279 – 291 27 Tanaka K., Komiyama, A., Sonomoto, K., Ishizaki, A., Hall, S.J., Stanbury, P.F (2002), Two different pathway for D-xylose metabolism and the effect of xylose concentration on the yield coefficient of L-lactic axit in mixed-axit fermentation by the lactic axit bacterium Lactococcus lactis Appl Microbiol Biotechnol 60:160–167 28 Taniguchi, M., Hoshina, K., Tanabe, S., Higuchi, Y., Sakai, K., Ohtsubo, S., Hoshino, K Tanaka, T (2005), Production of L-lactic axit by simultaneous saccharification and fermentation using unsterilized defatted rice bran as a carbon source and nutrient component Food Sci Technol Res 11, p: 400 – 406 29 Université de Kasetsart, I.P.d.H., CIRAD (2009), Description détaillée du projet: Valorisation des amidons d’Asie du Sud-Est pour la production de maltodextrines et d’axite lactique Institut Asiatique de Technologie 30 Vazquez M.J, Alonso J.L, Domiguez H, Parajo J.C (2000), Xylooligosaccharides: manufacture and applications Trends in Food Science and Technology, 11, p: 387 – 393 31 Zhu, Y M., Lee, Y.Y., Elander, R.T (2007), Conversion of aqueous ammonia-treated corn stover to lactic axit by simultaneous saccharification and cofermentation Appl Biochem Biotechnol 137-140, 721-738 32 Wenyu Zhang, Zhong Xu, Quanhui Wang, Yongzhen Ji, Juan Xiang, Xiao Zhang (2012), Effect of parameters on L-Lactic axit fermentation from soybean straw hydrolysate Uncorrected proof TRANG WEB 33 https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Lactobacillus_brevis 34 https://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Lactobacillus_plantarum_and_its _biological_implications 35 http://pixgood.com/streptococcus-lactis.html 36 http:// www Eereenergy.gov.biomass 37 http://en.wikipedia.org 38 http://www.sinhhocvietnam.org 39 http:// www Triplepundit.com HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 66 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI PHỤ LỤC Kết giải trình tự DNA chủng Y6: ATTTCTGTCACTTAGGCGGCTGGCTCTAAAGGTTACCCCACCGACTTTGG GTGTTACAAACTCTCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGA ACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCGACTT CGTGCAGGCGAGTTGCAGCCTGCAGTCCGAACTGAGAACGGTTTTAAGA GATTTGCTTGCCCTCGCGAGTTCGCGACTCGTTGTACCGTCCATTGTAGC ACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATCTGACGTCGTCCCC ACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCACTAGAGTGCCCAACTTAAT GCTGGCAACTAGTAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAAC ATCTCACGACACGAGCTGACGACGACCATGCACCACCTGTCATTGCGTT CCCGAAGGAAACGCCCTATCTCTAGGGTTGGCGCAAGATGTCAAGACCT GGTAAGGTTCTTCGCGTAGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTT GTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAACCTTGCGGTCGTACTCC CCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTCCGGCACTGAAGGGCGGAAAC CCTCCAACACCTAGCACTCATCGTTTACGGCATGGACTACCAGGGTATC TAATCCTGTTCGCTACCCATGCTTTCGAGTCTCAGCGTCAGTTGCAGACC AGGTAGCCGCCTTCGCCACTGGTGTTCTTCCATATATCTACGCATTCCAC CGCTACACATGGAGTTCCACTACCCTCTTCTGCACTCAAGTTATCCAGTT TCCGATGCACTTCTCCGGTTAAGCCGAAGGCTTTCACATCAGACTTAGA AAACCGCCTGCACTCTCTTTACGCCCAATAAATCCGGATAACGCTTGCC ACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGACTTTCTG GTTAAATACCGTCAACGTATGAACAGTTACTCTCATACGTGTTCTTCTTT AACAACAGAAGCTTTACGAAGCCGAAACCCTTTCTTCACTCACGCCGTG GTTGCTTCCTTCAGGGTTTGCGCCCCATTGGTGGAAAAATTCCCTTACTG GCTGCCCTCCCCGTAGGGAGT Hình P1: Kết giải trình tự Nucleotit chủng Y6 HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 I LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Kết chạy HPLC xác định axit lactic từ dịch lên men chủng Y6 Đƣờng chuẩn (g/L) Xylose Rt = 11,96 Axit lactic Rt = 12,958 Axit acetic Rt = 15,214 Hình P.2: Pick chuẩn chạy HPLC chất Tốc độ dòng: 0,6 ml/ phút Axit lactic Axit acetic Hình P.3 Kết xác định axit lactic chủng Y6 lên men ban đầu theo phƣơng pháp HPLC HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 II LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Tốc độ dòng: 0,5 ml/ phút Axit lactic Axit acetic Hình P.4: Kết xác định axit lactic chủng Y6 sau khảo sát theo phƣơng pháp HPLC Các yếu tố ảnh hƣởng đến khả tạo axit lactic chủng Y6 Bảng P.5 Kết đo hàm lượng axit lactic theo ngày khảo sát yếu tố nhiệt độ (g/L) Hàm lƣợng axit sau 24 nuôi cấy ( g/L) Nhiệt độ 24 48 72 96 120 144 30 oC 2,16 2,90 3,06 3,59 3,80 4,64 4,45 35 oC 2,16 3,72 4,54 6,49 7,01 7,88 6,55 37 oC 2,16 4,26 5,56 7,01 7,58 8,82 8,09 40 oC 2,16 3,50 4,47 6,11 6,28 7,49 6,36 45 oC 2,16 1,45 1,43 1,81 1,53 1,22 1,16 HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 III LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bảng P.6 Kết đo hàm lượng axit lactic theo ngày khảo sát yếu tố pH (g/L) Hàm lƣợng axit sau 24 nuôi cấy ( g/L) pH 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 1,53 ± 0,15 2,61 ± 0,11 2,43 ± 0,22 2,25 ± 0,18 2,07 ± 0,25 1,89 ± 0,06 1,71 ± 0,31 1,53 ± 0,26 24 2,34 ± 0,16 3,81 ± 0,1 3,36 ± 0,26 3,78 ± 0,16 3,87 ± 0,09 4,8 ± 0,09 5,58 ± 0,23 4,53 ± 0,05 HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 48 3,21 ± 0,36 6,39 ± 0,21 6,42 ± 0,10 7,61 ± 0,32 7,59 ± 0,14 6,36 ± 0,16 6,48 ± 0,06 6,15 ± 0,23 72 3,39 ± 0,29 6,81 ± 0,09 7,08 ± 0,14 8,13 ± 0,09 8,37 ± 0,25 7,65 ± 0,23 6,87 ± 0,09 7,14 ± 0,05 96 4,62 ± 0,29 7,35 ± 0,34 7,53 ± 0,23 8,7 ± 0,14 8,85 ± 0,17 8,67 ± 0,36 7,47 ± 0,34 7,65 ± 0,96 120 144 5,73 5,46 ± ± 0,34 0,10 7,65 5,1 ± ± 0,50 0,50 8,28 7,98 ± ± 0,18 0,1 9,75 9,36 ± ± 0,34 0,16 9,42 10,47 ± ± 0,05 0,61 9,09 6,3 ± ± 0,59 0,61 8,64 7,68 ± ± 0,09 0,18 8,43 6,75 ± ± 0,45 0,18 IV LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bảng P.7 Kết đo hàm lượng axit lactic theo ngày khảo sát ảnh hưởng nồng độ đường (g/L) Nồng độ đƣờng g/L 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 Hàm lƣợng axit sau 24 nuôi cấy ( g/L) 72 3,51 ± 0,41 8,28 ± 0,16 9,27 ± 0,18 11,34 ± 0,16 10,32 ± 0,10 9,66 ± 0,23 HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 96 4,35 ± 0,23 9,39 ± 0,10 10,53 ± 0,16 10,92 ± 0,23 10,08 ± 0,16 10,56 ± 0,10 120 5,22 ± 0,48 10,55 ± 0,18 11,82 ± 0,27 11,85 ± 0,21 10,32 ± 0,14 11,1 ± 0,10 144 5,04 ± 0,24 8,76 ± 0,10 8,88 ± 0,05 9,54 ± 0,16 8,82 ± 0,18 9,12 ± 0,11 V LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI Bảng P.8 Kết đo hàm lượng axit lactic theo ngày khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống (g/L) Hàm lƣợng axit sau 24 nuôi cấy ( g/L) Tỷ lệ cấp giống % 48 2,76 ± 0,05 3,48 ± 0,10 4,17 ± 0,10 6,9 ± 0,21 4,56 ± 0,05 5% 10% 15% 20% 25% 72 3,84 ± 0,14 6,27 ± 0,19 6,66 ± 0,32 8,91 ± 0,16 ± 0,10 96 4,65 ± 0,19 8,88 ± 0,29 ± 0,41 9,75 ± 0,23 6,75 ± 0,45 120 5,13 ± 0,16 10,64 ± 0,16 10,8 ± 0,18 10,89 ± 0,16 7,62 ± 0,14 144 4,65 ± 0,21 9,63 ± 0,78 9,3 ± 023 9,96 ± 0,14 7,29 ± 0,00 Bảng P.9 Kết đo OD hàm lượng axit lactic theo ngày(g/L) OD Axit (g/L) 0,358 0,489 0,702 1,8 5,4 8,1 HV: Nguyễn Thị Thùy_CB130718 Thời gian (ngày) 0,81 1,004 1,202 11,25 12,62 14,18 1,186 1,199 1,201 13,86 13,23 12,6 VI ... tuyển chọn tối ƣu hóa điều kiện nuôi cấy chủng vi khuẩn có khả sinh axit lactic từ Xylose Nội dung nghiên cứu gồm: - Phân lập tuyển chọn chủng vi khuẩn sinh tổng hợp axit lactic cao từ Xylose. .. tên chủng vi khuẩn có khả tạo axit lactic từ xylose cao - Khảo sát yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp axit lactic từ đƣờng Xylose - Tối ƣu hóa số yếu tố ảnh hƣởng tới chủng vi khuẩn sinh. .. lactic từ Xylose .39 3.2 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả lên men tạo axit lactic cao 41 3.2.1 Định tính axit lactic 41 3.2.2 Xác định lƣợng axit chủng 42 3.2.4 Định lƣợng axit lactic