Phân lập, tuyển chọn, khảo sát đặc điểm chủng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase từ bã dong riềng sau khi trồng nấm và ứng dụng cho sản xuất phân

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -*** NGUYỄN PHƢƠNG ANH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ BÃ DONG RIỀNG SAU KHI TRỒNG NẤM VÀ ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT PHÂN BÓN LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM HÀ NỘI, 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -*** NGUYỄN PHƢƠNG ANH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ BÃ DONG RIỀNG SAU KHI TRỒNG NẤM VÀ ỨNG DỤNG CHO SẢN XUẤT PHÂN BĨN Chun ngành: Cơng nghệ thực phẩm LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS ĐẶNG MINH HIẾU HÀ NỘI, 2018 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nỗ lực thân, nhận ủng hộ, giúp đỡ hướng dẫn tận tình thầy giáo, gia đình bạn bè đồng nghiệp Trước tiên tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Đặng Minh Hiếu PGS.TS Trần Liên Hà công tác Bộ môn Vi sinh - Hóa sinh - Sinh học phân tử - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, thầy cô người hướng dẫn, giúp đỡ tơi tận tình, chu đáo suốt trình nghiên cứu thực luận văn Đồng thời cảm ơn sinh viên Trương Thị Phượng – K58 khoa Công nghệ Sinh học - Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội tơi thực q trình nghiên cứu luận văn Cuối xin gửi lời cảm ơn chân thành tới bạn bè, đồng nghiệp gia đình giúp đỡ suốt thời gian vừa qua Xin chân thành cảm ơn! Hà Nôi, ngày tháng năm 2018 Nguyễn Phương Anh LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Kết luận văn kết nghiên cứu nhóm nghiên cứu chúng tơi thực hướng dẫn khoa học PGS.TS Trần Liên Hà TS Đặng Minh Hiếu công tác trường Đại học Bách khoa Hà Nội, giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên học tập làm việc phịng thí nghiệm Vi sinh – Hóa sinh Sinh học Phân tử, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, trường Đại học Bách khoa Hà Nội Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải tác phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu kham khảo luận văn Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm với cam đoan Hà Nội, ngày tháng năm 2018 Nguyễn Phương Anh LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG BIỂU MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN .3 Tình hình sử dụng dong riềng Việt Nam Thực trạng môi trường làng nghề sản xuất miến dong .4 Khả tái sử dụng bã thải dong riềng 3.1 Thành phần bã thải 3.2 Những nghiên cứu tái sử dụng bã thải dong riềng Enzyme cellulase vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase 10 4.1 Enzyme cellulase 10 4.2 Vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase 13 Tình hình sử dụng phân bón hữu Việt Nam 14 Vai trò vi khuẩn phân giải cellulose phân bón hữu 16 Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng phân bón hữu 17 CHƢƠNG - VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 Đối tượng nghiên cứu 19 Thiết bị, dụng cụ hóa chất 19 2.1 Thiết bị dụng cụ 19 2.2 Hóa chất mơi trường 19 Phương pháp nghiên cứu .21 3.1 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn 21 3.2 Phương pháp tuyển chọn chủng có hoạt tính cellulase 21 3.3 Định danh vi khuẩn 23 3.3.1 Phương pháp định danh dựa đặc tính sinh lý, sinh hóa 23 3.3.2 Định danh phương pháp sinh học phân tử 25 3.4 Phương pháp xác định khả sinh chất kích thích sinh trưởng IAA 26 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng phát triển chủng .26 4.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 27 4.2 Ảnh hưởng pH 27 4.3 Ảnh hưởng tỉ lệ cấp giống 27 4.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc .27 4.5 Ảnh hưởng hàm lượng pepton 27 Ứng dụng vi khuẩn ủ phân bón hữu 27 5.1 Quy trình thử nghiệm ủ phân bón 27 5.2 Phương pháp phân tích số tiêu phân bón 28 5.2.1 Xác định nhiệt độ 28 5.2.2 Phương pháp xác định độ ẩm 28 5.2.3 Phương pháp xác định pH .28 5.2.4 Phương pháp xác định nitơ tổng phân bón 28 5.2.5 Phương pháp xác định hàm lượng cacbon hữu phân bón 29 CHƢƠNG - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 Kết phân lập 31 Tuyển chọn chủng vi khuẩn có hoạt tính cellulase .32 2.1 Tuyển chọn dựa phương pháp cấy chấm điểm .32 2.2 Tuyển chọn dựa phương pháp đục lỗ thạch 34 2.3 Tuyển chọn dựa phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase 34 Định tên chủng vi khuẩn tuyển chọn .35 3.1 Đặc tính hình thái sinh lý – sinh hóa chủng NDK5 35 3.2 Định danh sinh học phân tử 36 Xác định khả sinh chất kích thích sinh trưởng 3-indol acetic acid (IAA) 38 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng tới sinh trưởng phát triển chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 .39 5.1 Ảnh hưởng nhiệt độ 39 5.2 Ảnh hưởng pH 41 5.3 Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống .42 5.4 Ảnh hưởng tốc độ lắc .43 5.5 Ảnh hưởng nồng độ pepton 44 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ứng dụng vi khuẩn ủ phân bón hữu 45 6.1 Độ sụt giảm thể tích 46 6.2 Nhiệt độ 47 6.3 pH 48 6.4 Độ ẩm .48 6.5 Hàm lượng Cacbon tổng số 49 6.6 Hàm lượng Nitơ tổng số 49 KẾT LUẬN 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHỤ LỤC BẢNG 58 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Chú thích BOD Biochemical Oxygen Demand CMC Cacboxyl methyl cellulose C/N Tỷ lệ Cacbon / Nitơ COD Chemical Oxygen Demand DNA Deoxyribonucleic Acid DNS 3,5-dinitrosalicylic IAA Acid 3-indol acetic PCR Polymerase Chain Reaction TCCP Tiêu chuẩn cho phép TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam QCVN Quy chuẩn Việt Nam LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1 Nguyên liệu đầu vào bã thải rắn làng nghề Dương Liễu .5 Bảng 1.2 Thành phần bã dong Bảng 1.3 Khả tái sử dụng bã thải rắn làng nghề Dương Liễu Bảng 3.1: Các chủng phân lập từ nguồn bã dong riềng sau trồng nấm khác 31 Bảng 3.2: Khả phân giải cellulose chủng chọn lọc thông qua phương pháp cấy chấm điểm 33 Bảng 3.3: Khả phân giải cellulose qua phương pháp đục lỗ thạch 34 Bảng 3.4: Hoạt lực enzyme chủng tuyển chọn 35 Bảng 3.5: Đặc tính sinh lý - sinh hóa chủng NDK5 .36 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ SINH HỌC DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1 Hiện trạng mơi trường làng nghề sản xuất miến dong Hình 1.2 Mơ hình enzyme cellulase 11 Hình 1.3 Ba loại phản ứng xúc tác cellulose 12 Hình 3.1: Các chủng tuyển chọn theo phương pháp cấy chấm điểm .33 Hình 3.2: Các chủng tuyển chọn theo phương pháp đục lỗ thạch 34 Hình 3.3: Hình thái khuẩn lạc chuỗi bào tử chủng vi khuẩn NDK5 .35 Hình 3.4: Sản phẩm PCR chủng NDK5 (Với: -ve:mẫu nước; +ve: chủng E.coli) 37 Hình 3.5: Tương quan cấu trúc 16S rRNA chủng NDK5 với chủng khác 38 Hình 3.6 Thử định tính khả sinh IAA chủng NDK5 39 Hình 3.7: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 theo thời gian 40 Hình 3.8: Ảnh hưởng nhiệt độ đến sinh trưởng phát triển chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 thời điểm 48 .40 Hình 3.9: Ảnh hưởng pH đến khả sinh trưởng chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 .41 Hình 3.10: Ảnh hưởng pH đến sinh trưởng phát triển chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 thời điểm 48 .42 Hình 3.11: Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến khả sinh trưởng chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 .42 Hình 3.12: Ảnh hưởng tỷ lệ cấp giống đến sinh trưởng phát triển chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 thời điểm 48 .43 Hình 3.13: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh trưởng chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 .44 Hình 3.14: Ảnh hưởng tốc độ lắc đến khả sinh trưởng chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 thời điểm 24 .44 Hình 3.15:Ảnh hưởng nồng độ pepton đến khả sinh trưởng chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 thời điểm 24 .45 Hình 3.16: Sự thay đổi thể tích q trình ủ .47 Hình 3.17: Sự thay đổi nhiệt độ trình ủ 47 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đặng Kim Chi (2005), Làng nghề Việt Nam môi trường, Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999),Nghiên cứu sản xuất cellulase số chủng vi sinh vật ưu nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội pp 790-797 Tăng Thị Chính, 2007, Nghiên cứu sản xuất chế phẩm vi sinh vật ứng dụng để xử lý ô nhiễm môi trường, Viện Công nghệ môi trường, Viện KH&CN Việt Nam Nguyễn Lân Dũng, Ngơ Đình Quyết, Phạm Văn Ty (2009), Vi sinh vật học, Nhà xuất Giáo dục Hà Nội Võ Bích Hạnh & cộng (2005), “Nghiên cứu sản xuất chế phẩm BIO-F sản xuất phân bón hữu vi sinh từ rác thải sinh hoạt” Báo cáo khoa học đề tài, Viện Sinh học Nhiệt đới Đặng Minh Hằng (1999),Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật để xử lý rác Báo cáo khoa học, Hội nghị Cơng nghệ Sinh học tồn quốc, NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội pp 333-339 Trịnh Đình Khá, Quyền Đình Thi, Nguyễn Sỹ Lê Thanh (2007), Tuyển chọn nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng Penicillium SP DTQ-HK1, tạp chí cơng nghệ sinh học 5(3): 355-362 Nguyễn Đức Lượng số tác giả (2004) Công nghệ enzyme NXB Đại học quốc gia TP.HCM Đào Thị Lượng, Nguyễn Thị Anh Đào, Nguyễn Thị Kim Quy, Trần Thị Lệ Quyên, Dương Văn Hợp, Trần Quốc Việt, Ninh Thị Len, Bùi Thị Thu Huyền (2010): “ Phân lập tuyển chọn vi khuẩn lactic dùng chế biến bảo quản thức ăn thô xanh phụ phẩm nông nghiệp cho gia súc nhai” Di truyền học ứng dụng – Chuyên san Công nghệ sinh học Số 6, p.1-6 53 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 10 Nguyễn Như Ngọc, Nguyễn Văn Cách, Lê Thị Lan, Trần Liên Hà (2017), “Nghiên cứu tái sử dụng bã thải dong riềng để trồng nấm sò trắng (Pleurotus florida)”, Tạp chí KH & CN Việt Nam 11 Võ Văn Phước Quệ Cao Ngọc Điệp, (2011) Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải cenlulose Tạp chí Khoa học Đại học Cần Thơ, 18a, 177-184 12 Đỗ Thị Qúy (2013), Giáo trình modun “Sản xuất tinh bột dong riềng”, Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn 13 TCVN 10784:2015, Vi sinh vật – Xác định khả sinh tổng hợp axit 3-indolaxetic (IAA) 14 TCVN 5979:2007, Chất lượng đất – Xác định pH (Tiểu Ban kỹ thuật Tiêu chuẩn TCVN/TC190/SC3 “Phương pháp hóa học” biên soạn, Tổng cục tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố) 15 TCVN 8557:2010, Phân bón – Phương pháp xác định nitơ tổng số (Viện TNNH soạn, Bộ NN&PTNN đề nghị, Bộ Khoa học Cơng nghệ cơng bố) 16 TCVN 9294:2012, Phân bón – Xác định cacbon hữu tổng số phương pháp Walkley – Black (Viện TNNH soạn, Bộ NN&PTNN đề nghị, Bộ Khoa học Công nghệ công bố) 17 Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng Phạm Văn Toàn, 2003 Giáo trình cơng nghệ vi sinh vật nơng nghiệp xử lý ô nhiễm môi trường NXB Nông nghiệp, Hà Nội: 105 trang 18 Hoàng Toàn Thắng Cs (2013), Đề tài nghiên cứu cấp Bộ Gíao dục Đào tạo: “Nghiên cứu sử dụng bã dong riềng làm thức ăn chăn ni trâu, bị làng nghề vùng núi Đông Bắc Việt Nam” 19 Nguyễn Thị Thu Thủy , Trần Thị Xuân Phương , Cao Thị Dung , Lê Thị Hương Xuân , Trương Thị Hồng Hải (2017), “Phân lập, tuyển chọn số chủng vi sinh vật có khả phân giải cellulose bước đầu ứng dụng xử lý phế phụ phẩm nông nghiệp làm phân hữu vi sinh”, Tạp chí KH & CN Lâm Nghiệp Đại học Lâm Nghiệp, tập I (1) 20 Trần Linh Thước (2010), Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mĩ phẩm, Nxb Giáo dục, TPHCM 54 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 21 Nguyễn Thị Ngọc Trúc, (2015) Phân lập, tuyển chọn đinh danh vi khuẩn phân giải xenlulo từ cành Thanh Long Báo cáo khoa học hội thảo quốc gia khoa học trồng lần thứ 2, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 972982 22 Trịnh Thành Trung, Phan Lạc Dũng, Trần Lệ Quyên, Dương Văn Hợp, Đào Thị Lương (2013), “Đặc điểm sinh học tiềm ứng dụng chủng vi khuẩn Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum sp 1910 phân lập Rừng Quốc gia Hồng Liên ”, Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa Tự nhiên Công nghệ, Tập 29 số 3(2013) Tr 59-7 23 Viện Thổ nhưỡng Nơng hóa (1998), Sổ tay phân tích đất, nước, phân bón, trồng, NXB Nông nghiệp Tiếng Anh 24 Ariffim H., Abdulah N., Kalsom M.S., Shirai Y., Hassam M.A (2006), Production and characterisation of cellulase by Bacillus pulmilus EB3 International Journal of Engineering and Technology, 3(1), pp 47-53 25 A.V Yao, H Bochow, S Karimov, U Boturov, S Sanginboy & K Sharipov Effect of FZB42 Bacillus subtilis as a biofertilizer on cotton yields in field tests Arch Phytopathol Plant Prot 39(2006) 323–328 26 Behera B C., Parida S., Dutta S K., Thatoi H N., (2014) Isolation and Identification of xenlulo degrading bacteria from mangrove soil of Mahanadi River Delta and their cellulase production ability American Journal of Microbiological Research, 2(1), 41-46 27 B Fan, R Borriss, W Bleiss & X Wu, Grampositive rhizobacterium Bacillus amyloliquefaciens FZB42 colonizes three types of plants in different patterns J Microbiol 50(2012) 38-44 28 Coughlan, M.P., Folan, M.A., 1979 Cellulose and Cellulase: Food for thought, food for future? International Journal of Biochemistry, 10(2): 103-168 29 Domingues F.C., Queiroz J.A., Cabral J.M.S., Fonseca L.P (2000), The influence of culture conditions on mycelial structure and cellulase production by Trichoderma reesei RUT C-30, Enzyme Microbial Technol, 26; 394-401 55 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 30 Deng S.B., Bai R.B., Hu X.M., Luo Q (2003), “Characteristics of a bioflocculant produced by Bacillus mucilaginosus and its use in starch wastewater treatment”, Appl Microbiol Biotechnol, 60(5), pp 588–593 31 Doppelbauer R., Esterbauer H., Steiner W., Lafferty R., Steinmuller H (1987),The use of cellulosic wastes for production of cellulases by Trichoderma reesei, Appl Microbiol Biotechnol , 26,pp 485–494 32 E.E Idriss, O Makarewicz, A Farouk, Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45 contributes to its plant-growth-promoting effect Microbiology 148(2002) 2097-2109 33 Haug R.T, 1980 Compost enginering principles and practice Ann Arbor Science publisher: 18 -19 34 Nguyen Phuong Hanh, Chu Thi Thu Ha (2012),Investigation of the pollution status and the waste reusing ability in trade village Duong Lieu, Hoai Duc, Hanoi Journal of Vietnamese Enviroment, 3(2), pp 87 – 91 35 Howard R.L., Abotsi E., Rensburg E.L.J., Howard S (2003), "Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production", Afr J Biotechnol, 2(12),pp 602-619 36 Immanuel G., Dhanusa R., Prema P., Palavesam A (2006), Effect of different growth parameters on endoglucanase enzyme activity by bacteria isolated from coir retting effluents of estuarine environment Int J Environ Sci Tech 3(1), pp 25-34 37 Landaud S., Piquerel P., Pourquie’ J (1995), Screening for bacillus producing cellulolytic enzyme active in the neutral pH range Letters in Applied Microbiology, 21, pp 319-321 38 Lynd L.R., Weimer p.J., Zyl W.H.V., Pretorius I.S (2002),Microbial cellulose utilization: Fundamentals and biotechnology Microbiol Mol Biol Rev 66, pp 506-577 39 Miller G.L (1959), Analytical Chemistry 31, p 426 40 Rajoka M.I., Malik K.A (1997),Cellulase production by Cellulomonas biazotea cultured in media containing different cellulosic substrates, Biores Technol, 59, pp 21-27 56 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 41 Vipul V., Alpika V., Akhilesh K.(2012), Isolation & production of cellulase enzyme from bacteria isolated from agricultural fields in district Hardoi, Uttar Pradesh, India, Pelagia Research Library Advances in Applied Science Research,3(1), pp 171-174 42 Walke R., 1975 The preparation, characterization and agricultural use of barksewage compost Ph.D dessertation, University of New Hampshire, Durham 43 Yang Ling Liang, Zheng Zhang, Min Wu and Jia Xun Feng, (2014) Isolation, screening and identification of cellulolytic bacteria from natural reserves in the subtropical region of china and optimization of cellulose production by Paenibacillus terrae ME27-1 BioMed Research International Volume 2014, Article ID 512497 Internet 44 http://danviet.vn/kinh-te-nong-nghiep/lang-trieu-phu-dong-rieng-515893.html 45 http://www.baobackan.org.vn/channel/1121/201311/chu-dong-tieu-thu-dongrieng-2272510/ 46 http://www.baotuyenquang.com.vn/kinh-te/nong-lam-nghiep/nguoi-dan-trongche-bien-dong-rieng-can-duoc-tu-van-ho-tro-32727.html 57 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM PHỤ LỤC BẢNG Bảng PL 1: OD600nm chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 khảo sát nhiệt độ Thời gian (giờ) OD 600nm 250C 300C 350C 400C 450C 500C 0,031±0,051 0,035±0,058 0,037±0,055 0,040±0,085 0,040±0,065 0,035±0,011 0,060±0,083 0,081±0,064 0,110±0,093 0,149±0,049 0,101±0,026 0,101±0,054 12 0,092±0,013 0,208±0,023 0,312±0,011 0,534±0,056 0,518±0,012 0,340±0,068 18 0,121±0,049 0,401±0,056 0,503±0,023 0,991±0,093 0,901±0,016 0,600±0,079 24 0,373±0,065 0,578±0,087 0,911±0,057 1,301±0,014 1,053±0,075 0,876±0,080 30 0,491±0,002 0,686±0,077 1,136±0,049 1,471±0,055 1,344±0,014 1,101±0,083 36 0,579±0,022 0,980±0,030 1,203±0,076 1,759±0,067 1,402±0,019 1,262±0,024 42 0,860±0,069 1,148±0,067 1,543±0,077 2,011±0,081 1,733±0,048 1,356±0,095 48 0,916±0,014 1,321±0,084 1,806±0,094 2,008±0,051 1,834±0,026 1,436±0,102 60 0,876±0,058 1,211±0,043 1,701±0,016 1,980±0,034 1,800±0,073 1,295±0,086 58 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Bảng PL 2: OD600nm chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 khảo sát pH Thời gian OD 600nm 6.5 0,021±0,038 0,022±0,021 0,024±0,031 0,030±0,038 0,030±0,038 0,026±0,028 0,020±0,035 0,110±0,025 0,197±0,032 0,293±0,035 0,367±0,044 0,357±0,032 0,293±0,027 0,206±0,038 12 0,190±0,031 0,232±0,025 0,635±0,024 0,795±0,045 0,749±0,027 0,670±0,035 0,555±0,027 18 0,311±0,035 0,401±0,051 0,865±0,028 1,003±0,042 0,991±0,025 0,901±0,028 0,625±0,028 24 0,574±0,025 0,792±0,034 1,260±0,032 1,360±0,023 1,317±0,035 1,171±0,027 0,826±0,029 30 0,681±0,042 0,801±0,032 1,517±0,027 1,637±0,028 1,602±0,038 1,202±0,035 0,932±0,030 36 0,754±0,045 0,842±0,021 1,659±0,032 1,809±0,024 1,763±0,043 1,491±0,042 1,156±0,031 42 0,801±0,041 1,169±0,021 1,828±0,027 2,010±0,034 1,954±0,045 1,622±0,041 1,156±0,028 48 0,873±0,035 1,187±0,025 1,901±0,027 2,092±0,019 2,001±0,042 1,683±0,038 1,156±0,035 60 0,501±0,028 1,010±0,028 1,773±0,026 1,902±0,028 1,827±0,038 1,450±0,028 1,156±0,031 (giờ) 59 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Bảng PL 3: OD600nm chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 khảo sát tỷ lệ cấp giống Thời gian OD 600nm (giờ) 1% 3% 5% 7% 10% 0,036±0.035 0,037±0.028 0,036±0.031 0,062±0.029 0,065±0.035 0,061±0.028 0,204±0.069 0,295±0.095 0,499±0.034 0,600±0.064 12 0,071±0.037 0,563±0.012 0,751±0.046 0,836±0.055 1,121±0.079 18 0,495±0.032 0,711±0.005 0,976±0.058 1,103±0.069 1,201±0.011 24 0,600±0.035 1,095±0.066 1,202±0.029 1,237±0.071 1,154±0.056 30 1,012±0.072 1,312±0.026 1,576±0.045 1,306±0.082 1,081±0.077 36 1,092±0.065 1,687±0.093 1,972±0.046 1,291±0.086 1,001±0.086 42 0,980±0.039 1,701±0.014 2,100±0.032 1,163±0.091 0,908±0.093 48 0,806±0.055 1,572±0.057 2,107±0.023 1,001±0.096 0,913±0.021 60 0,512±0.096 1,430±0.034 1,900±0.037 0,977±0.087 0,811±0.034 60 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Bảng PL 4: OD600nm chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 khảo sát tốc độ lắc Thời OD 600nm gian (giờ) 0v/ph 50v/ph 100v/ph 150v/ph 200v/ph 250v/ph 0,108±0,059 0,103±0,011 0,104±0,038 0,105±0,025 0,106±0,086 0,101±0,018 0,193±0,084 0,405±0,023 0,501±0,055 0,550±0,037 0,557±0,034 0,550±0,037 12 0,587±0,041 1,131±0,015 1,253±0,064 1,334±0,062 1,182±0,103 1,201±0,044 18 0,901±0,053 1,720±0,097 1,987±0,087 2,013±0,021 1,971±0,097 1,701±0,093 24 1.303±0,040 2,135±0,102 2,400±0,045 2,617±0,050 2,354±0,096 2,117±0,098 30 1,581±0,046 2,201±0,106 2,402±0,018 2,612±0,077 2,356±0,089 2,101±0,056 36 1,877±0,069 2,174±0,091 2,389±0,039 2,600±0,054 2,308±0,077 2,186±0,012 42 1,937±0,074 2,130±0,087 2,309±0,048 2,583±0,062 2,300±0,045 2,170±0,076 48 1,952±0.059 2,112±0,006 2,300±0,045 2,578±0,063 2,239±0,069 2,128±0,038 61 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Bảng PL 5: OD600nm chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 khảo sát nồng độ pepton Thời OD 600nm gian (giờ) 0% 0.10% 0.30% 0.50% 0.70% 1.00% 1.20% 0,065±0.056 0,063±0.023 0,067±0.026 0,062±0.040 0,064±0.011 0,066±0.078 0,061±0.022 0,197±0.034 0,189±0.057 0,201±0.034 0,223±0.055 0,254±0.037 0,301±0.064 0,243±0.041 12 0,345±0.071 0,457±0.011 0,689±0.022 0,893±0.026 0,983±0.038 0,834±0.059 0,892±0.059 18 0,533±0.017 0,695±0.098 0,934±0.047 1,132±0.012 1,073±0.102 1,932±0.032 1,586±0.056 24 0,595±0.028 0,723±0.065 1,148±0.086 1,625±0.016 1,778±0.093 2,602±0.049 2,798±0.043 30 0,689±0.075 1,127±0.023 1,204±0.053 1,841±0.020 2,151±0.107 2,608±0.036 2,771±0.037 36 0,937±0.069 1,235±0.018 1,395±0.041 1,789±0.063 2,025±0.023 2,616±0.021 2,608±0.041 42 0,585±0.098 0,814±0.097 1,209±0.065 1,623±0.059 1,994±0.087 2,602±0.038 2,585±0.069 48 0,574±0.011 0,783±0.054 1,157±0.039 1,587±0.046 1,899±0.062 2,579±0.074 2,479±0.080 Bảng PL6: Độ sụt giảm thể tích trình ủ Mẫu B (đối chứng) Mẫu A (bã bổ sung chủng) Số ngày Chiều cao đống ủ (cm) Thể tích đống ủ (cm3) Chiều cao đống ủ (cm) Thể tích đống ủ (cm3) 10,2±0,1 6168,45±0,1 10,2±0,1 6168,45±0,1 9,8±0,2 5926,55±0,2 10,1±0,1 6107,98±0,1 10 9,5±0,1 5745,13±0,1 9,9±0,1 5987,03±0,1 15 8,2±0,1 4958,95±0,1 9,4±0,1 5684,65±0,1 20 7,4±0,1 4475,15±0,1 8,9±0,2 5382,29±0,2 25 7,1±0,2 4294,73±0,2 8,5±0,1 5140,38±0,2 28 7,1±0,1 4294,73±0,1 8,5±0,2 5140,38±0,2 62 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Bảng PL7: Sự thay đổi nhiệt độ trình ủ Nhiệt độ (0C) Số ngày Mẫu A (bã bổ sung chủng) Mẫu B (đối chứng) 25±10C 25±10C 25±10C 25±10C 25±10C 25±10C 25±10C 25±10C 25±10C 25±10C 25±10C 25±10C 26±10C 25±10C 26±10C 26±10C 27±10C 26±10C 10 27±10C 27±10C 11 28±10C 27±10C 12 28±10C 27±10C 13 28±10C 28±10C 14 31±10C 28±10C 15 31±10C 28±10C 16 31±10C 29±10C 17 31±10C 29±10C 18 32±10C 29±10C 19 33±10C 29±10C 20 33±10C 29±10C 21 33±10C 29±10C 22 33±10C 29±10C 23 30±10C 28±10C 24 30±10C 28±10C 63 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 25 29±10C 28±10C 26 29±10C 27±10C 27 29±10C 27±10C 28 29±10C 27±10C Bảng PL8: Kết đo pH trình ủ pH Số ngày Mẫu A (bã bổ sung chủng) Mẫu B (đối chứng) 8,7±0,1 8,9±0,1 8,4±0,1 8,7±0,2 10 7,9±0,2 8,3±0,1 15 7,3±0,1 7,9±0,1 20 6,8±0,1 7,8±0,2 25 6,7±0,1 8,0±0,2 28 7,4±0,2 8,1±0,1 Bảng PL9 Kết đo độ ẩm trình ủ Số ngày 10 ngày 15 ngày 20 ngày 25 ngày 28 ngày Độ ẩm (%) Mẫu A (bã bổ sung chủng) Mẫu B (đối chứng) 58,5±0,13 57,9±0,10 58,3±0,10 57,6±0,11 57,9±0,10 57,7±0,12 57,9±0,10 56,1±0,10 55,8±0,10 55,5±0,10 56,0±0,11 55,7±0,12 55,2±0,10 55,8±0,11 64 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Bảng PL10 Hàm lƣợng Cacbon tổng trƣớc sau ủ Mẫu B (%) Thời gian Mẫu A (%) Ban đầu 15,48±0,21 15,75±0,18 Sau ủ 28 ngày 11,67±0,15 13,82±0,10 Bảng PL11 Hàm lƣợng Nitơ tổng trƣớc sau ủ Mẫu B (%) Thời gian Mẫu A (%) Ban đầu 0,71±0,01 0,72±0,01 Sau ủ 28 ngày 1,13±0,02 0,80±0,01 65 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM PHỤ LỤC HÌNH 60 y = 160.45x + 0.4291 R² = 0.9964 OD 540nm 50 40 30 20 10 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Nồng độ đường glucose (mg/ml) Hình PL 1: Đƣờng chuẩn dựa hàm lƣợng đƣờng glucose GCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACA TTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCC GATGGGAGC TGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGC TGTAAGAC ACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTA ATGGTTCAG TGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGA GCTAGTTGG CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATC TCGGCCACA GGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGAT TTCCGCAAT CTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGG CGTAAAGCT AGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGC TACCTAACC CCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTG AAGCGTTGT CGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGA AAAGCCCC AATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGG GGAGAGTGG CTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAG CGAAGGCGA CCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCG GATTAGATA TGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGAC CCCCTTAG AAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGA TGAAACTCA AAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTC AGCAACGCG GGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGT CCCTTCGG GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCA TGGGTTAA TGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCAT CTCTAAGG GACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACC GCCCCTTAT AGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACT GCGAGGTTA CTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGG GCGTGAAG CACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGT GCCTTGTA GGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATTGGGGTGAAGTCGTAAC AACCTTTTA >NDK5_1488bp Hình PL 2: Trình tự gen chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 66 12 180 24 30 36 42 48 54 60 66 72 78 84 90 96 102 108 114 120 126 132 138 144 148 LUẬN VĂN THẠC SỸ KỸ THUẬT CƠNG NGHỆ THỰC PHẨM Hình PL 3: 10 chủng có độ tƣơng đồng cao với chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 Phân giải loại đường Các tính chất sinh hố Hình PL 4: Một số tính chất sinh hóa chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp plantarum NDK5 67 ... DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI -*** NGUYỄN PHƢƠNG ANH PHÂN LẬP, TUYỂN CHỌN, KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM CHỦNG VI KHUẨN SINH TỔNG HỢP CELLULASE TỪ BÃ DONG RIỀNG SAU KHI TRỒNG NẤM... vệ sinh cho trồng, vật nuôi người, hạn chế chất độc hại tồn dư trồng Chính tơi lựa chọn đề tài ? ?Phân lập, tuyển chọn, khảo sát đặc điểm chủng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase từ bã dong riềng sau. .. - Mẫu bã dong riềng sau trồng nấm đầu khỉ - Bã dong riềng sau trồng nấm đầu khỉ nấm rơm - Mẫu bã mùn cưa sau trồng nấm linh chi - Mẫu bã mùn cưa sau trồng nấm linh chi nấm sò Thiết bị, dụng cụ