Phân lập và định tên chủng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase trong ruột mối

Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Lê Thanh Hà tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ suốt trình học tập, nghiên cứu hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tới thầy cô giáo cán công tác Viện Công nghệ sinh học thực phẩm, Viện đào tạo sau đại học – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội dạy dỗ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập trường Và cuối cùng, xin chân thành cảm ơn động viên, giúp đỡ gia đình, bạn bè bạn đồng nghiệp trình học tập, nghiên cứu hoàn thiện luận văn Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày ….tháng… năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Láng Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Kết luận văn kết nghiên cứu nhóm nghiên cứu thực hướng dẫn khoa học PGS.TS.Lê Thanh Hà, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, với giúp đỡ tập thể cán nghiên cứu, nghiên cứu sinh, học viên, sinh viên học tập làm việc phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Nội dung luận văn có tham khảo sử dụng tài liệu, thông tin đăng tải ấn phẩm, tạp chí trang web theo danh mục tài liệu tham khảo luận văn Hà Nội, ngày tháng Tác giả năm 2016 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội MỤC LỤC CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu cellulose 1.2 Cellulase chế phân giải cellulose 1.2.1 Cấu trúc cellulase chế phân giải cellulose enzyme cellulase 1.2.2 Sinh tổng hợp cellulase vi sinh vật 1.3 Tổng quan mối .11 1.3.1 Giới thiệu chung mối 11 1.3.2 Hệ vi sinh vật ruột mối 13 1.3.3 Các nghiên cứu phân lập VSV phân giải cellulase ruột mối 17 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 21 2.1 Vật liệu 21 2.1.1 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 21 2.1.2 Dụng cụ hóa chất 21 2.1.3 Môi trường 22 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .22 2.2.1 Phương pháp lấy mẫu 22 2.2.2 Phương pháp xử lý mẫu 22 2.2.3 Phương pháp vi sinh 22 2.2.4 Phương pháp xác định hoạt lực cellulase 24 2.2.5 Phương pháp hóa sinh 27 2.2.6 Phương pháp sinh học phân tử 28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Phân lập, sàng lọc tuyển chọn chủng vi khuẩn phân giải cellulose 31 3.1.1 Phân lập 31 3.1.2 Sàng lọc chủng có hoạt tính cellulase cao 40 3.2 Đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng G4, CG4, CG2 TM17-1 46 3.2.1 Chủng G4 46 3.2.2 Chủng CG4 49 3.2.3 Chủng CG2 52 3.2.4 Chủng TM1-7-1 54 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội 3.3 Định tên chủng tuyển chọn phƣơng pháp sinh học phân tử 56 3.3.1 Chủng G4 56 3.3.2 Chủng CG4 58 3.3.3 Chủng CG2 59 3.3.4 Chủng TM1-7-1 60 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 4.1 Kết luận .62 4.2 Kiến nghị 62 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký tự Chú giải CMC carboxymethyl cellulose DNS 3,5 – Dinitrosalicylic EG Endoglucanase CBH Cellobiohydrolase (exoglucanase) βG β-glucosidase FB Filter paper - cellulase αA α-amylase Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase [48] 10 Bảng 1.2 Các vi sinh vật phân lập từ ruột mối hoạt tính enzyme chúng (EG: Endoglucanase; FP: Filter paper – cellulase; βG: β-glucosidase; CBH – Cellobiohydrolase; αA: α-amylase) [8] 16 CBH,βG,EG 16 Bảng 2.1 Thành phần chất tham gia phản ứng enzyme 25 Bảng 3.1 Hình thái khuẩn lạc phân lập từ môi trường làm giàu M1 với chất CMC giấy lọc pH 31 Bảng 3.2 Hình thái khuẩn lạc phân lập từ MT làm giàu M1với chất CMC giấy lọc pH 11 34 Bảng 3.3 Hình thái khuẩn lạc chủng phân lập môi trường M2 với chất CMC pH7 11 35 Bảng 3.4 Hình thái khuẩn lạc phân lập đượợc từ môi trường làm giàu M3 pH 37 Bảng 3.5 Khả sinh cellulase khuẩn lạc phân lập 38 Bảng 3.6 Kích thước vòng phân giải phương pháp cấy chấm điểm (D/d) phương pháp khuyếch tán enzyme (D-d) 41 Bảng 3.7 Đặc điểm tế bào chủng sàng lọc 45 Bảng 3.8 Một số đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng G4 47 Bảng Một số đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng CG4 50 Bảng 3.10 Một số đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng CG2 53 Bảng 3.11 Một số đặc tính sinh lý, sinh hóa chủng TM1-7-1 55 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc phân tủ cellulose tạo đơn vị cellobiose với đầu khủ (bên phải) đầu không khủ (bên trái) Các đơn phân glucose tạo với góc 180o[24] Hình 1.2 Cấu trúc phân tử cellulose bó vi sợi cellulose [16] Hình 1.3 Cấu trúc vùng kết tinh vùng vô định hình Hình 1.6 Quá trình phân giải cellulose hệ cellulase [17] Hình 1.7 Sơ đồ phân loại mối [43] 11 Hình 1.8 Cấu tạo ruột mối (Ruột trước (Foregut), ruột (midgut) ruột sau (Hindgut))[47] 12 Hình 3.1 Hình ảnh thử hoạt tính phương pháp cấy chấm điểm số chủng phân lập 39 Hình 3.2 Hình ảnh thử hoạt tính phương pháp đục lỗ thạch số chủng 42 Hình 3.3 Hoạt lực CMCase FPase chủng tuyển chọn môi trường CMC 43 Hình 3.4 Hoạt lực CMCase FPase chủng tuyển chọn môi trường bột giấy 43 Hình 3.5 Hình thái khuẩn lạc (bên trái),hình thái tế bào(bên phải) chủng G4 46 Hình 3.7 Hình thái khuẩn lạc (bên trái) hình thái tế bào (bên phải) chủng CG4 50 Hình 3.9 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc hình thái tế bào chủng CG2 52 Hình 3.11 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc (bên trái) hình thái tế bào (bên phải) chủng TM1-7-1 54 Hình 3.6 Các chủng có độ tương đồng cao với chủng G4 57 Hình 3.8 Các chủng có độ tương đồng cao với chủng CG4 58 Hình 3.10 Các chủng có độ tương đồng cao với chủng CG2 59 Hình 3.12 Các chủng có độ tương đồng cao với chủng TM1-7-1 60 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội LỜI MỞ ĐẦU Cellulose với hemicellulose lignin thành phần hữu chủ yếu tạo nên thành tế bào thực vật bậc cao tạo nên nguồn nguyên liệu lingocellulose tự nhiên Nó nguồn tài nguyên sinh học phong phú trái đất mà tái sử dụng (chiếm 100 tỉ khối lượng khô/năm) Khoảng nửa hợp chất cacbon cellulose sinh hệ thống enzyme môi trường phân giải trình diễn chậm không hoàn toàn Tuy nhiên, số hệ vi sinh vật lại có khả phân giải cellulose tới 60 – 65% Đặc biệt hệ vi sinh vật ruột mối phân giải cellulose gỗ tới 90% Cellulose thường phân hủy hệ enzyme cellulase cách tác dụng vào liên kết 1,4 – glycoside Cellulase enzym ứng dụng nhiều công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giấy công nghiệp dệt… nhằm thủy phân nguyên liệu giàu cellulose với mục đích nâng cao hiệu trình chiết suất, cải thiện chất lượng sản phẩm Gần ứng dụng quan trọng cellulase tham gia vào trình thủy phân nguyên liệu rơm rạ, bã mía, bột giấy… thành loại đường đơn Mối nhóm côn trùng sử dụng gỗ làm nguồn thức ăn để sinh sống phát triển Để tiêu thụ gỗ, mối phải có hệ enzyme cellulase mối cellulase sinh tổng hợp vi sinh vật sống cộng sinh ruột mối Các nghiên cứu cho thấy nhiều loại vi khuẩn nấm có khả sinh tổng hợp cellulase hemicellulase phân lập từ ruột mối Nguồn vi sinh vật sinh cellulase ruột mối kỳ vọng ứng dụng rộng rãi công nghiệp khai thác nguồn gene để sản xuất enzyme tái tổ hợp Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Tuy nhiên, Việt Nam nghiên cứu hệ vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase ruột mối hạn chế Do đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: ”Phân lập định tên chủng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase ruột mối” Với nội dung nghiên cứu nhƣ sau: Phân lập, sàng lọc tuyển chọn chủng vi khuẩn có khả phân giải cellulose cao Mô tả đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa chủng vi khuẩn tuyển chọn Đinh tên dựa đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa phương pháp sinh học phân tử Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu cellulose Cellulose với hemicellulose lignin polysaccharide chủ yếu thành tế bào thực vật bậc cao tạo nên nguồn nhiên liệu lignocellulose tự nhiên Nó nguồn tài nguyên sinh học phong phú giới mà tái sử dụng Chúng thành phần loài động vật Cellulose không tan nước, axit loãng hay ankan loãng nhiệt độ thường Mặc dù thành phần cấu trúc thành phần tế bào loại thực vật khác hàm lượng cellulose thường chiếm từ 35 – 50% khối lượng khô, chí gần 100% [32] Cellulose gluxit có công thức hóa học (C6H10O5)n với thành phần Cacbon chiếm 44 – 45%, Hydro – 6.5%, lại oxy với 49.39%.Cellulose polysaccharide mạch thẳng D-glucose liên kết với liên kết β1,4 – glucoside [24] Hình 1.1 Cấu trúc phân tủ cellulose tạo đơn vị cellobiose với đầu khủ (bên phải) đầu không khủ (bên trái) Các đơn phân glucose tạo với góc 180o[24] Một phân tử cellulose có chứa từ 1.400 – 10.000 gốc glucose, phân tử lượng dao động khoảng giới hạn rộng từ 5.104 tới 106 Da [7] Các đơn vị Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội library from the gut microbiota of the termite Reticulitermes santonensis”, chủng vi khuẩn phân lập thuộc loài Klebsiella sp có hoạt tính β-glucosidase [38] 3.3.3 Chủng CG2 Sản phẩm khuếch đại đoạn gen 16s rRNA tinh trước gửi giải trình tự Kết trình tự đoạn gen 16S chạy chương trình Blast để xem mức độ tương đồng với chủng ngân hàng gen Kết thu thể Hình 3.10 Hình 3.11 Các chủng có độ tương đồng cao với chủng CG2 Từ kết cho thấy, chủng CG2 có độ tương đồng 99% với Trabulsiella guamensis Dựa vào đặc điểm hình thái, đặc điểm tế bào sinh học phân tử chủng CG2 khảo sát phía khẳng định chủng CG2 thuộc loài Trabulsiella guamensis, gọi loài Trabulsiella guamensis CG2 Trong nghiên cứu phân lập từ trước tới nay, chưa có nghiên cứu công bố phân lập vi khuẩn Trabulsiella guamensis ruột mối Trabulsiella guamensis thành viên chi Gammaproteobacteria họ Enterobacteriaceae Năm 2007, nghiên cứu Chou cộng 59 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội “Traubulsiella odontotermitis sp.nov., isolated from the gut of the termite Odontotermes formosanus Shiraki”, phân lập chủng Trabulsiella odontotermitis loài Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu công bố khả phân giải cellulose chủng 3.3.4 Chủng TM1-7-1 Sản phẩm PCR 16s rRNA chủng TM1-7-1 sau tinh tiến hành gửi giải trình tự Kết so sánh mức độ tương đồng chương trình Blast thể Hình 3.12 Hình 3.12 Các chủng có độ tương đồng cao với chủng TM1-7-1 Nhìn vào kết Hình 3.12 cho thấy chủng TM1-7-1 có độ tương đồng 99% với loài Pseudomonas aeruginosa Kết hợp với đặc điểm hình thái, đặc điểm tế bào khẳng đinh chủng TM1-7-1 thuộc loài Pseudomonas aeruginosa, gọi Pseudomonas aeruginosa TM1-7-1 Trong nghiên cứu tác giả Porramezan Z cộng Sự (2012), ông phân lập chủng vi khuẩn thuộc loài Pseudomonas sp tiến hành phân lập đối tượng ruột mối Micocerotermes diversus Với đặc tính enzyme phân tích thuộc hai loại endoglucanase FP-cellulase [56] Trong nghiên cứu gần tác giả 60 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Bholay A.D, cộng (2014), “Exploration of cellulolytic potential of Termite gut flora for sustainable development”, tiến hành phân lập đối tượng ruột mối Flora tuyển chọn chủng Pseudomonas aeruginosa cho hoạt tính cellulase cao pH 7.0 30oC [14] 61 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Chƣơng KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Đã phân lập đánh giá khả sinh tổng hợp cellulase 59 chủng vi khuẩn ruột mối Từ đó, chọn 11 chủng vi khuẩn có khả phân giải cellulose để tiến hành tuyển chọn Bằng việc xác định khả phân giải CMC phương pháp cấy chấm điểm, đục lỗ thạch kết hợp với xác định hoạt lực CMCase FPase thu 6/11 chủng có hoạt tính cellulase cao với hoạt tính CMCase từ 0,02 – 0,29IU/ml FPase từ 0.015 – 0.027 FPU/ml Đã định tên kỹ thuật 16S rDNA chủng G4 Bacillus subtilis với 100% tương đồng, CG2 Trabulsiella guamensis với độ tương đồng 99%, CG4 Klebsiella sp với 100% độ tương đồng, TM1-7-1 Pseudomonas aeruginosa với 99% độ tương đồng 4.2 Kiến nghị Tiếp tục nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để tối ưu trình sinh tổng hợp cellulase chủng: G4, CG2, CG4, TM1-71 Kiểm tra khả phân giải cellulose chủng với chất khác cám gạo, bột giấy, bã mía 62 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Nguyễn Văn Cần, Phân lập xác định khả phân hủy cellulose số chủng vi khuẩn ruột mối Đồng Tháp, Bến Tre Sóc Trăng Luận văn tốt nghiệp - Đại Học Cần Thơ, 2014 Nguyễn Lân Dũng, Quyết Ngô Định, and Ty Phạm Văn, Vi sinh vật học 1998 Trần Thị Thúy Kiều, Phân lập khảo sát khả phân hủy celulose số chủng vi khuẩn ruột mối Thạch Trị - Sóc Trăng Luận văn tốt nghiệp - Đại Học Cần Thơ, 2014 Võ thị Mỹ Loan, Phân lập khảo sát khả thủy phân cellulose số chủng vi khuẩn ruột mối Luận văn tốt nghiệp - Đại Học Cần Thơ, 2014 Nghiêm Ngọc Minh, et al., Nghiên cứu đặc điểm phân loại xác định hoạt tính cellulase chủng vi khuẩn chịu nhiệt BSS2 phân lập bãi rác Nam Sơn, Hà Nội Tạp chí Công nghệ Sinh học, 2008 6(4) Nguyễn Trúc Ngân and Lan Phạm Thị Ngọc, Tìm hiểu khả phân giải cellulose vi sinh vật phân lập từ chất thải rắn nhà máy Fococev Tạp chí Khoa Học Công Nghệ, Trường ĐH Khoa Học Huế, 2014 Lê Ngọc Tú, Hóa sinh công nghiệp Nhà xuất khoa học kỹ thuật, 2002 TÀI LIỆU TIẾNG ANH 10 11 Julien Bauwens, et al., Review – The termite gut as a source of new enzymes: an approach by microbiological and “omics” techniques Soumis la revue World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2014 Brune A, Microbial Symbioes in the Digestive Tract of Lower Termites In Beneficial Microorganisms in Multicellular Life Form, E Rosenberg and U Gophna, eds springer Berlin Heidelberg, 2010: p - 25 Brune A and A Ohkuma, Diversity, structure and evolution of the termite gut microbial comminity In: Biology of termite: A modern Synthesis Dordrecht: Springer, 2010 Brune A and U Stingl, Prokaryotic symbionts of Termite Gut Flagellates: Phylogenetic and Metabolic Implications of a Tripartile Symbiosis Preogress in Molecular and Subcellular Biology 2006 41 63 Luận văn tốt nghiệp 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Freraz A, M Cordova A., and A Machuca, Wood biodegradation and enzyme production by Ceriporiopsis subvermispora during solid-state fermentation of Eucalyptus grandis Enzyme Microb Technol., 2003 32 Imms A, On the Structure and Biology of Archotermopis, Together with Descriptions of New Species of Intestinal Protozoa and General Observations on the Isoptera Royal Society of London, 1920 Bholay A.D, et al., Exploration of cellulolytic potential of Termite gut flora for sustainable development IOSR Journal of Environmental Science, Toxicology and Food Technology, 2014 8: p 71-76 Bholay A.D, et al., Exploration of cellulolytic potential of Termite gut flora for sustainable development Journal of Environmental Science, Toxicology and Food Technology, 2014: p 71 - 76 Horn et al, Novel enzymes for the degradation of cellulose Biotechnology for Biofuels, 2012 Valdeir Arantes and Saddler Jack N, Access to cellulose limits the efficiency of enzymatic hydrolysis: the role of amorphogenesis Biotechnology for Biofuels, 2010 A Brune, Methanogens in the Digestive Tract of Termites In (Endo)symbiotic Methanogenic Archaea, J.H.P Hackstein, ed springer Berlin Heidelberg, 2010: p 81 - 100 Matteotti C, et al., Idetification and characterization of a new xylanase from Gram-positive bacteria isolated from termite gut (Reticulitermes santonensis) Protein Expression and Purification, 2012 2012(83): p 117127 Tarayre C, et al., Isolation and cultivation of a xylanolytic Bacillus subtilis extracted from the gut of the termite Reticulitermes santonensis Appiedl Biochemistry and Biotechnology, 2013 171: p 225-245 Bignell D, Morphology, Physiology, Biochemistry and Functional Design of the Termite Gut: An Evolutionary Wonderland In: Biology of Termite: a Modern Systhesis New York: Springer, 2010 Thayer D.W, Facultative wood-digesting bacteria from the hind-gut of the termite Reticulitermes hesperus Journal of General Microbiology, 1976 96: p 287-296 T K Ghose, Measurement of cellulase activities International Union Of Pure And Applied Chemistry, 1987 59: p 257-268 Mari Granström, Cellulose Derivatives: Synthesis, Properties and Applications Helsinki University Printing House 2009 64 Luận văn tốt nghiệp 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Pratima Gupta, Samant Kalpana, and Sahu Avinash, Isolation of CelluloseDegrading Bacteria and Determination of Their Cellulolytic Potentiial International Journal of Microbiology, 2011 Konig H, Bacillus species in the intestine of termites and other soil invertebrates J Appl Microbiol, 2006 101 Trinh Van Hanh, et al., Species composition and damage levels of termites in three World Cultural Heritage sites, Complex of Hue Monuments, Hoi An Ancient Town, and My Son Sanctuary Proceeding of the 10th Pacific- Termite Research Group Confernce, Malaysia, 2014 Pierre Hethener, Brauman Alain, and Garcia and Jean-Louis, Clostridium termitidis sp nov., a Cellulolytic Bacterium from the Gut of the Woodfeeding Termite, Nasutitermes lujae Systematic and Applied Microbiology, 1992 15: p 52-58 Shengwei Huang, Sheng Ping, and Zhang and Hongyu, Isolation and Identification of Cellulolytic Bacteria from the Gut of Holotrichia parallela Larvae (Coleoptera: Scarabaeidae) International Journal of Molecular Sciences, 2012 13 Claudia Huseneder, et al., Bug in Bugs The Microbial Diversities of the Termite gut Proc Hawallan Entomol Soc, 2007 39: p 143 - 144 Breznak J and A Brune, Role of Microorganisms in the Digestion of Lignocellulose by Termites Annual Review of Entomology, 1994 39 Prof Dr Dieter Klemm, Schmauder Prof Dr Hans-Peter, and Prof Dr Thomas Heinze, Cellulose Chemical Industry Press, 2014: p 275 - 287 Yung-Chung Lo, et al., Biohydrogen production from pure and natural lignocellulosic feedstock with chemical pretreatment and bacterial hydrolysis International Journal of Hydrogen Energy, 2011 36: p 1395513963 Cho M-J, et al., Symbiotic adaptation of bacteria in the gut of Reticulitermes speratus: low endo-beta-1,4-glucanase activity Biochemical and Biophysical Research Communications, 2010 395: p 432-435 Ohkuma M and T Kudo, Phylogenetic diversity of the intestinal bacterial community in the termite Reticulitermes speratus Appl Environ Microbiol, 1996 62 Ramin M, A Alimon, and N Abdullah, Identification of cellulolytic bacteria isolated from the termite Coptermes curvignathus (Holmgren) Journal of Rapid Methods and automation in Microbiology 2009 17: p 103 - 116 Wenzel M, et al., Aerobic and facultatively anaerobic cellulolytic bacteria from the gut of the termite Zootermopsis angusticollis Journal of Applied Microbiology 2002 92: p 32-40 65 Luận văn tốt nghiệp 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Mattéotti, et al., New glucosidase activities identified by functional screening of a genomic DNA library from the gut microbiota of the termite Reticulitermes santonensis Microbiological Research 2011 166: p 629-642 Prajna Mishra, Production of lignocellulosic ethanol from Lantana camara by bacterial cellulase of termite symbionts Master of science in life sciencDepartment of life science national institute of technology Rourkela-769008, Orissa, , 2013 S B Oyeleke and and Okusanmi T A, Isolation and characterization of cellulose hydrolysing microorganism from the rumen of ruminants African Journal of Biotechnology 2008 (10) Maria B Pasti and Belli Maria L., Cellulolytic activity of Actinomycetes isolated from termites (Termitidae) gut FEMS Microbiology Letters, 1985 26: p 107-112 J Pe´rez, et al., Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose and lignin: an overview Int Microbiol, 2002 Yves Roisin, Termites: Evolution, Sociality, Symbioses, Ecology ResearchGate, 2000 Nado S, et al., Endosymbiotic Bacteroidales Bacteria of the Flagellated Protist Pseudotrichonympha grassii in the gut of the termite Coptotermes formosanus Appl Environ Microbiol, 2012 71 NYI Mekar Saprarini and Indriyati Wiwiek, Isolation of cellulolytic bacteria from termites with cellulose of corn cobs as a carbon source International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2014 6(4) NYI Mekar Saptarini and Indriyati Wiwiek, Isolation of cellulolytic bacteria from termites with cellulose of corn cobs as a carbon source International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences 2014 6(4) Michael E Scharf and Tartar Aurélien, Termite digestomes as sources for novel lignocellulases Biofuels Bioprod and Biorefining, 2008 Rajeev K Sukumaran, Singhania Reeta Rani, and Pandey and Ashok, Microbial cellulases: Production, applications and challenges Journal of Scientific & Industrial Research 2005 64 Kudo T, Termite-microbe symbiotic system and efficient degradation of lignocellulose Biosci Biotechnol Biochem, 2009 73 Nobre T, et al., Dating the fungus-growing termites'mutualism shows a mixture between ancient codiversification and recent symbiont dispersal across divergent hosts Molecular Ecology 2011 20: p 2619 - 2627 Fumiaki Taguchi, et al., Isolation of a hydrogen-producing bacterium, Clostridium beijerinckii strain AM21B, from termites Revue canadienne de microbiologie, 1993 39: p 726-730 66 Luận văn tốt nghiệp 52 53 54 55 56 57 Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Subodh K Upadhyaya, et al., Isolation and Characterization of Cellulolytic Bacteria from Gut of Termite Rentech Symposium Compendium, 2012 Yoshio Watanabe, Shinzato Naoya, and Fukatsu Takema, Isolation of Actinomyces from Termits' Gut Biosci Biotechnol Biochem., 2003 67 (8): p 1797 - 1801 Hongoh Y, Diversity and genomes of unculturel microbial symbionts in the termite gut Biosci Biotechnol Biochem., 2010 74: p 1145 - 1151 Weiping Yang, et al., Isolation and identi fi cation of a cellulolytic bacterium from the Tibetan pig's intestine and investigation of its cellulase production Electronic Journal of Biotechnology, 2014 17 Pourramezan Z, et al., Screening and Idenfication of Newly Isolated Cellulose Degrading Bacteria from the Gut of Xylophagous Termite Microcerotermes diversus (Silvestri) Microbiology, 2012 81: p 736-742 Xiao-Zhou Zhang and Zhang Yi-Heng Percival, Cellulase: Charaterics, Sources, Production and Appications Bioprocessing Technologies in Biorefi nery for Sustainable Production of Fuels, Chemicals, and Polymers, 2013 67 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội PHỤ LỤC Môi trƣờng - - Môi trường M1: [46] Thành phần Khối lƣợng (g/l) NaNO3 2.5 KH2PO4 MgSO4 0.2 NaCl 0.1 CaCl2.6H2O 0.1 CMC pH 2.5 Môi trường M2: Thành phần Khối lƣợng (g/l) NaNO3 2.5 K2HPO4 MgSO4 0.5 KCl Peptone CMC pH 68 Luận văn tốt nghiệp - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Môi trường M3 (cám gạo): Thành phần Khối lƣợng (g/l) Cám gạo 20 Casein 10 Bột đậu nành 10 NaCl 10 pH - Môi trường phân lập: Thành phần Khối lƣợng (g) KH2PO4 0.5 MgSO4 0.25 Peptone Agar 18 CMC Phƣơng trình đƣờng chuẩn Glucose Nồng độ 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 OD540 0.246 0.412 0.5535 0.74 0.859 1.015 69 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội Đƣờng chuẩn Glucose 1,2 y = 1,5357x - 0,0534 R² = 0,9978 OD540 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,2 0,4 Glucose (mg/ml) 0,6 0,8 Hoạt lực enzyme CMCase FPase môi trƣờng CMC bột giấy Chủng Hoạt độ enzyme môi trường Hoạt độ enzyme môi CMC trường bột giấy CMCase FPase (U/ml) (U/ml) CMCase FPase (U/ml) (U/ml) CM2-4 0.097 0.027 0.018 0.017 CG2 0.025 0.02 0.037 0.015 CG4 0.034 0.023 0.015 0.018 CG4-1-2 0.047 0.024 0.035 0.017 D1-3 0.038 0.018 0.016 0.017 70 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội D1-7 0.037 0.023 0.019 0.017 D1-8 0.027 0.017 0.024 0.017 D1-12 0.064 0.023 0.023 0.015 T2-11 0.15 0.041 0.03 0.016 TM1-7-1 0.021 0.016 0.015 0.016 G4 0.286 0.026 0.018 0.017 Trình tự gen 16s rRNA chủng G4 GGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTA GCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAG AACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTC TGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATT TGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAG TGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGG GACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCAC CTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAG GATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACA TGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTT GCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTA AGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCAC Trình tự gen 16s rRNA chủng CG4 CGGTAGCACAGAGAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGG GTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGA AACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCT 71 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội TCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTGGTAGGTG GGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGA CCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAG CAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGC GTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAA GGCGGTGAGGTTAATAACCTCATCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGC ACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGC GTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGT CGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGC AGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAA ATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGA CAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAG ATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCC CTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGA GTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACA AGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCT GG Trình tự gen 16s rRNA chủng CG2 AGCGGCAGCGGGGGAAAGCTTGCTTTCCCGCCGGCGAGCGGCGG ACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACT GGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCTACGGACCAAAGTGGGGGA CCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAG GTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGA TGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGG CAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATG CCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGA GGAAGGTGTTGTGGTTAATAACCAGAGCAATTGACGTTACCCGCAGAAG AAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGC AAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTC AAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCGAAAC TGGCAGGCTTGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGT 72 Luận văn tốt nghiệp Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội GAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCT GGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGT GCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGG GGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGC ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTA CCTGGTCTTGACATCCACAGAACCCTGTAAAGATACGGGGGGTGCCTTC CG Trình tự gen 16r RNA chủng TM1-7-1 GATGAAGGGAGCTTGCTCCTGGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGT AATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGATAACGTCCGGAAACGGG CGCTAATACCGCATACGTCCTGAGGGAGAAAGTGGGGGATCTTCGGACC TCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAA GGCCTACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCA CACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGG GAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTG AAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAGGAAGGGCAGT AAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCT AACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCG GAATTACTGGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCAGCAAGTTGGATGTG AAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCCAAAACTACTGAGCTAGA GTACGGTAGAGGGTGGTGGAATTTCCTGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA TATAGGAAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACCACCTGGACTGATACTG ACACTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGG TAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTAGCCGTTGGGATCCTTGAGATC TTAGTGGCGCAGCTAACGCGATAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCG CAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGA GCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGAC ATGCTGAGAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTCCGACA 73 ... enzyme cellulase mối cellulase sinh tổng hợp vi sinh vật sống cộng sinh ruột mối Các nghiên cứu cho thấy nhiều loại vi khuẩn nấm có khả sinh tổng hợp cellulase hemicellulase phân lập từ ruột mối. .. vi sinh vật sinh tổng hợp cellulase ruột mối hạn chế Do đó, tiến hành nghiên cứu đề tài: Phân lập định tên chủng vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase ruột mối Với nội dung nghiên cứu nhƣ sau: Phân. .. hành phân lập vi khuẩn sinh tổng hợp cellulase ruột mối tỉnh Sóc Trăng, Đồng Tháp, Bến Tre Kết cho thấy với mẫu mối Thạch Trị - Sóc Trăng phân lập 23 chủng vi khuẩn có khả phân giải CMC với chủng