Phân lập và tuyển chọn chủng nấm men sinh tổng hợp beta carotene

Mặt khác cùng với Vitamin E, Vitamin c và Selen hữu cơ, [3 - Carotene còn được chứng minh là chất chống oxy hoá antioxidant quan trọng và đang được sử dụng rộng rãi trong y học hiện đại

®MlMMSẩềÉẼ-ằ ỆMềếỂỂỆẾÊếế 'ÂM MỆẩỀìÊlễêẩềềÊềiãấẵễĩỂẵMâ1 - & M '1

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

(KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ 1998-2003)

Giáo viên hướng dẫn

Nơi thực hiện Thời gian

: TS Vũ Nguyên Thành

GVC Nguyễn Lệ Phi : Viện Công nghiệp thực phẩm 24/2 - 24/5/03

I

OA /7;

/ o / 3 M

^ ỵ y s ỵ i Ỉ Ị đ ì c i

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với:

TS Vũ Nguyên Thành GVC Nguyễn Lệ Phi

Là những thầy cô đã tận tình chỉ bảo, trực tiếp hướng dẫn tôi làm khoá luận này

Tôi xin chân thành cảm ơn các cán bộ kỹ thuật viên bộ môn Vi sinh - Viện Công nghiệp Thực phẩm, bộ môn Vi sinh - Trường Đại học Dược Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài

Tôi cũng xin cảm ơn PGS.TS Trần Tử An, DS Lê Hồng Dũng

người đã có những đóng góp quý báu cho tôi trong quá trình thực hiện

MỤC LỤC

Đặt vấn đ ề 1

Phần I: Tổng quan 2

1 Khái quát về Carotenoid 2

1.1 Khái niệm : 2

1.2 Cấu trúc 2

1.3 Trạng thái tự nhiên, tính chất lý hoá 5

1.4 Tác dụng sinh h ọc 5

1.5 Tầm quan trọng 8

2 Đại cương vê nấm m en 9

2.1 Khái niệm 9

2.2 Dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men 9

2.3 Sinh sản của nấm men 10

2.4 Úng dụng của nấm men 10

3 Sinh tổng hợp ị3- carotene 11

Phần II: Thực nghiệm và kết quả 14

2.1 Nguyên vật liệu, thiết b ị 14

2.2 Phương pháp nghiên cứu 15

2.2.1 Phân lập nấm men từ lá cây 15

2.2.2 Tuyển chọn sơ bộ nấm men cho màu đậm nhất 16

2.2.3 Tuyển chọn nấm men tổng hợp tốt Carotenoid trên các môi trường có nguồn Nitơ, Cacbon khác nhau 16

2.2.4 Xác định thành phần Carotenoid 17

2.3 Tiến hành và kết quả 18

2.3.1 Phân lập và thuần khiết 18

2.3.2 Sơ bộ tuyển chọn nấm men tổng hợp nhiều Carotenoid 19

2.3.3 Xác định sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Nitơ 19

2.3.4 Ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng Cacbon 22

2.3.5 Tách chiết Carotenoid từ nấm m en i 24

2.3.6 Định lượng Carotenoid toàn phần bằng đo độ hấp thụ UV-VIS 25

2.3.7 Xác định thành phần Carotenoid và p - Carotene bằng HPLC 26

Phần n i: Kết luận và đề xuất 33

3.1 Kết luận 33

3.2 Đề xuất 33

Phụ lục 34

Tài liệu tham khảo 36

ĐẬT VẤN ĐỀ

p - carotene, một dạng thực phẩm thuốc với vai trò là tiền vitamin A cung cấp khoảng 80% nhu cầu vitamin A của con người Tuy nhiên quá trình chế biến của người dân đã làm mất đi một lượng lớn họfp chất này ưong thức ăn

Vi thế bệnh thiếu vitamin A vẫn còn rất phổ biến ở Việt Nam mặc dù chúng

ta đã có chương trình quốc gia phòng chống thiếu Vitamin A được triển khai rộng rãi vài năm gần đây [12]

Mặt khác cùng với Vitamin E, Vitamin c và Selen hữu cơ, [3 - Carotene còn được chứng minh là chất chống oxy hoá (antioxidant) quan trọng và đang được sử dụng rộng rãi trong y học hiện đại để điều trị các bệnh về lão hoá, tim mạch, suy giảm miễn dịch, ung thư Tuy nhiên, việc sản xuất các chế phẩm chứa hợp chất này thay thế thuốc nhập ngoại ở Việt Nam vẫn còn nhiều khó khăn

Đe góp phần tìm kiếm nguồn cung cấp p - Carotene mới, đáp ứng một phần nhu cầu nguyên liệu trong các lĩnh vực công nghiệp thực phẩm, dược phẩm và dinh dưỡng, chúng tôi tiến hành đề tài: “Phân lập và tuyển chọn

nấm men sinh tổng hợp p - Carotene” với các mục tiêu:

• Phân lập nấm men sinh Carotenoid

• Khảo sát sự ảnh hưởng của nguồn dinh dưỡng tới sinh tổng hợp Carotenoid

• Thiết lập quy trình tách chiết Carotenoid từ nấm men

• Xác định các thành phần Carotenoid và Ị3 - Carotene

ở tảo (Dunaniella) , vi khuẩn (Agrobacterium), nấm mốc (Blakeslea trispora),

và đặc biêt có nhiều ở một số loại nấm men (Rhodoturola, Phaffia)

1.2 Cấu trúc của Carotenoỉd

Cấu trúc cơ bản của các Carotenoid là một mạch thẳng, gồm 40 cacbon được cấu thành từ 8 đon vị isoprenoid chứa 5-cacbon liên kết nhau, đối xứng qua trung tâm Điểm nổi bật và đặc biệt trong cấu trúc là hệ thống nối đôi liên hợp, xen kẽ nối đơn, nối đôi tạo chuỗi polyen Chính cấu trúc này đã tạo nên các đặc tính quan trọng như: dễ bị oxi hoá , đồng phân hoá, hấp thụ ánh sáng (đặc biệt là ánh sáng tử ngoại) và thể hiện màu của hợp chất ( màu càng đậm khi hệ thống dây nối đôi càng dài) [14] Khung cấu trúc cơ bản:

Cấu trúc cơ bản này có thể biến đổi theo các cách: Cộng hợp H2 hoặc dehydro hóa, hydroxyl hoá, cacboxyl hoá, di chuyển nối đôi, đóng vòng, cắt thành nhiều chuỗi nhỏ Tạo nên một lượng lớn các cấu trúc khác nhau Kết

quả là có khoảng 600 hợp chất khác nhau, đã được tách chiết và xác định đặc tính Một số cấu trúc chính được trình bày dưới đây [8,14]:

Phytofluene

^-Carotene

Lycopene

Trong nhóm này a, Y, P-carotene và Cryptoxanthin là những tiền chất Vitamin A quan trọng, cho cơ thể người và động vật Một phân tử Y, a- carotene và Cryptoxanthin khi vào cơ thể động vật thuỷ phân cho một phân tử Vitamin A, |3-carotene thuỷ phân cho hai phân tử Vitamin A Chính vì vậy

ị3-carotene được đánh giá là chất có hoạt tính sinh học mạnh và quan trọng nhất của carotenoid

1.3 Trạng thái tự nhiên, tính chất lý hóa

Trang thải tư nhierv trong thực vật, động vật P-Carotene có thể ở dạng

tinh thể, chất rắn vô định hình, tan trong dung môi dầu béo thành dung dịch, phân tán keo hoặc tạo phức với Protein trong môi trường nước

Tính chất vật lý : ị3-carotene tạo tinh thể hình kim, màu nâu đỏ tan trong

dầu và các dung môi hữu cơ như aceton, alcohol, ethyl-ether, tetrahydroíuran, dầu ether và hexan, không tan trong nước[14 ]

Nhờ có hệ thống dây nối đôi liên hợp dài mà p-carotene có ái lực mạnh với oxy đơn bội ('0 2 ), dễ bị oxy hoá, đồng phân hoá trong điều kiện tiếp xúc với không khí, ánh sáng, nhiệt độ Tính chất của Carotenoid được khái quát trong

sơ đồ

1.4 Tác dụng sinh học

Các Carotenoid tự nhiên trong cơ thể sinh vật do chúng tự tổng họp nhằm mục đích bảo vệ, chống lại các tác động bất lợi của nội môi, ngoại môi Nội môi có thể là các gốc tự do, ngoại môi như là tia tử ngoại của ánh sáng mặt trời

Một số Carotenoid là tiền Vitamin A ở động vật có vú, chúng giữ chức năng sinh học quan trọng trong quá trình phát triển cá thể như : phát triển thính giác, vị giác, tăng đáp ứng miễn dịch, tăng sự sinh sản và tạo tinh trùng Tác động chủ yếu của carotenoid không chỉ là chống oxy hoá mà còn trao đổi thông tin từ tế bào đến tế bào, tác động tới cấu trúc và chức năng của màng tế bào, tăng cường sự đáp ứng miễn dịch của cơ thể Vì vậy mà carotenoid được xác định là chất điều hoà dinh dưỡng [14].

Đặc biệt P-carotene không độc với cơ thể khi sử dụng liều cao và kéo dài Ngược lại dùng vitamin A liều cao và kéo dài sẽ gây rối loạn thị giác, rối loạn chức năng gan Nguyên nhân là do cơ thể có khả năng chuyển hoá 1/6 lượng ị3-carotene thành vitamin A khi có nhu cầu [7]

2

Vitamin A

Theo một số tài liệu gần đây thì căn nguyên của các bệnh ung thư, tim mạch, sự thoái hoá, lão hóa là do các gốc tự do được sinh ra theo những cơ chế khác nhau trong cơ thể Các gốc tự do này được giải phóng trong quá trình chuyển hoá, tích tụ và tấn công liên tục vào vật chất di truyền (ADN, ARN), màng tế bào, các tế bào miễn dịch làm phát sinh bệnh và lão hóa

Cơ chế chống oxy hoả : [11,8,1]

Trong cơ thể, carotenoid nói chung và Ị3 -carotene nói riêng có khả năng chống lại các gốc tự do, dập tắt chuỗi phản ứng dây truyền Nhờ có hệ thống dây nối đôi liên hợp, nó vô hiệu hóa các phân tử oxy bị kích hoạt(1Ơ2) Một phân tử ị3-carotene có thể hấp thụ năng lượng của hàng ngàn phân tử '0 2 rất nguy hiểm rồi giải phóng năng lượng ấy dưới dạng nhiệt vô hại Người ta gọi

đó là cơ chế giải tỏa năng lượng

!Ơ2 + p - carotene —» p - carotene* +3Ơ2

(3 - carotene* —» |3 - carotene + nhiệt vô hạiNăm 1994, Mayne và cộng sự đã khảo sát trên 413 đối tượng cả nam và nữ không hút thuốc nhận thấy ăn nhiều rau quả chứa P-carotene và vitamin E đã

có tác dụng phối họp làm giảm nguy cơ ung thư phổi cho cả nam và nữ Bendich và cộng sự đã nghiên cứu trên người và động vật thử nghiệm nhận thấy p-carotene và carotenoid đều có khả năng làm tăng đáp ứng miễn dịch Khi sử dụng liều cao P-carotene trên bệnh nhân nhiễm HIV đã làm tăng tỉ lệ

tế bào CD4 : CD8, tác động kìm hãm sự phát triển của virus [19]

Tác dụng sinh học của P-carotene được tóm tắt theo sơ đồ

1.5 Tầm quan trọng

Nhu cầu hàng ngày về vitamin A đối với người lớn khoảng 1 - 2,5 mg và ị3- carotene là 2 - 5 mg Nhu cầu với trẻ em còn cao hơn do khả năng nhạy cảm với việc thiếu vitamin A cao hon người lớn Sự thiếu hụt Vitamin A sẽ dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng tới sức khoẻ của con người.[1,8]

Đối với con người vitamin A được cung cấp từ hai nguồn chính là từ các sản phẩm động vật như: gan, cá, thịt, sữa và các sản phẩm từ sữa Những nguồn này thường cung cấp trực tiếp vitamin A cho cơ thể Tuy vậy những sản phẩm này có hạn chế là giá thành cao Khoảng 60% Vitamin A trong thức ăn được cung cấp dưới dạng tiền vitamin A trong thực vật Ở các nước đang phát triển, tỷ lệ này là 82% với lý do dễ kiếm sẵn có quanh năm và giá

rẻ [14]

Áp lực công việc cùng YỚi vấn đề ô nhiễm môi trường ngày càng xuất hiện thêm nhiều bệnh nan y như ung thư, bệnh tim mạch, thoái hoá làm tăng nhu cầu sử dụng |3-carotene ở dạng dược chất tinh khiết Tại Việt Nam mới chỉ có chế phẩm Vinaga làm từ dầu gấc chứa ị3-carotene song chưa được mọi người

sử dụng rộng rãi Chế phẩm Belaf, Cigelton của Hàn Quốc chứa 30 mg Ị3- carotene và một số thành phần chống oxy hoá khác đang được ưa dùng hiện nay ừong chống lão hoá, nâng cao sức đề kháng Điều này đòi hỏi ngành dược nước ta cần có sự quan tâm hon nữa để nghiên cứu và sản xuất được những sản phẩm đáp ứng nhu cầu của người dân ngoài chế phẩm Vinaga [7].Trên thị trường quốc tế hiện nay có khoảng 25 biệt dược chứa ị3-carotene [16] chuyên luận P-carotene mới chỉ có trong ƯSP24-2000, UP 97, BP98

Dược điển Việt Nam III -2002 chưa đề cập tới hợp chất này ở dạng tinh khiết, mới chỉ có chuyên luận về dầu gấc có chứa p-carotene.[23,15]

II -Đại cương về nấm men

2.2 - Dinh dưỡng và các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men

Nấm men thuộc nhóm vi sinh vật dị dường, rất dễ phát triển trong môi trường nuôi cấy mà không có đòi hỏi khắt khe về dinh dưỡng như vi khuẩn Nguồn dinh dưỡng cacbon chủ yếu của nấm men là c ác loại hydratcacbon (monosaccarit, oligosaccarit, polysaccarit), các dẫn xuất hydratcacbon, cácloại rượu, acid hữu cơ, acid amin, protein, lipid [3; 4]

Nguồn dinh dưỡng nitơ bao gồm cả nguồn nitơ vô cơ và nitơ hữu cơ như muối amoni, muối nitrat, urê Vì thế thành phần môi trường nuôi cấy cần có

đủ thức ăn cacbon, nitơ, các chất khoáng, vi lượng và các chất sinh trưởng.Trong quá trình sống tế bào nấm men tiến hành trao đổi chất không ngừng với môi trường xung quanh Tuy có kích thước nhỏ nhưng vì hấp thụ các chất dinh dưỡng và thải các sản phẩm trao đổi chất qua toàn bộ bề mặt theo cơ chế khuyếch tán, thẩm thấu, hấp phụ cho nên cường độ trao đổi chất là rất lớn [2]

Các yếu tố như nhiệt độ, độ pH nguồn oxy của môi trường cũng ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình phát triển của nấm men Điều này sẽ gây ảnh hưởng tới quá trình tăng sinh khối cũng như các sản phẩm được tạo ra từ quá trình trao đổi chất [3,6].

2.3 Sinh sản của nấm men

Nảy chồi : là hình thức sinh sản đơn giản và phổ biến nhất của nấm men

Te bào mẹ nảy sinh ra một chồi nhỏ rồi lớn dần lên sau đó tách ra , đôi khi tế bào con có thể vẫn dính trên tế bào mẹ và lại tiếp tục nảy chồi làm cho nấm men có dạng cây xương rồng [6]

Phân c ắ t: là hình thức sinh sản của Schizosaccharrromyces Te bào mẹ dài

ra ở hai đầu, ở giữa hình thành vách ngăn chia tế bào ra làm hai phần tương đương nhau mỗi tế bào có một nhân Bào tử bắn thường gặp ở chi

Sporobolomyces, Bullera, Aessosporon Bào tử bắn là loại bào tử sau khi

được hình thành nhờ năng lượng của té bào bắn mạnh về phía đối diện Loại bào tử này có hình thận sinh ra trên một cuống nhỏ mọc ở các tế bào dinh dưỡng hình trứng

Sinh sản hữu tính: do hai tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành họp

tử Hợp tử phân chia thành các tế bào nằm trong nang, nang chín được phát tán ra ngoài Nếu hai tế bào nấm men có hình thái, kích thước giống nhau tiếp hợp với nhau được gọi là tiếp hợp đẳng giao, nếu hai tế bào có hinh thái, kích thước khác nhau được gọi là tiếp họp dị giao [10]

2.4 ứng dụng của nấm men

2.4.1 Những ứng dụng chung

Đã từ lâu, con người đã biết sử dụng nấm men và các sản phẩm của nó

trong công nghiệp thực phẩm Điển hình là Saccharromyces cerevisiae được

sử dụng trong việc sản xuất bánh mỳ, bia, rượu, chế glycerol hoặc men

invertaza S.fragilis do khả năng lên men lactose nên đóng vai trò quan trọng

trong công việc sản xuất sữa và các sản phẩm từ sữa [9]

Sử dụng nấm men sản xuất các acid amin (đặc biệt là các acid amin không

thay thế), protein, các vitamin ngày càng có ý nghĩa Hiện nay đã có “Nấm

men thực phẩm ” được sử dụng làm chất dinh dưỡng cho con người, (đã được

dùng nhiều trong các chiến dịch chống đói ở Ấn Độ, Angieri)

Ngoài ra nấm men còn được sử dụng nhiều trong chăn nuôi, sử dụng các phụ phẩm của các ngành công nghiệp khác (rỉ đường, dịch thuỷ phân gỗ, parafin ) để làm chất dinh dưỡng cho vật nuôi, tăng ữọng và nâng cao chất lượng thịt [6]

2.4.2 Những ứng dụng trong lĩnh vực Y- Dược

Rất nhiều loại nấm men có khả năng siêu tổng họp ngoại bào tức là sản sinh ra một lượng enzym ngoại bào vượt xa so với nhu cầu sử dụng trong trao đổi chất của chúng Chính vì vậy những loài này là đối tượng của công nghiệp sản xuất các chế phẩm enzym như: Amylase, glucoamylase, lipase : dùng làm thuốc hỗ trợ tiêu hoá [3]

Nhiều nước trên thế giới đã và đang sử dụng các chế phẩm đông khô của

nấm men Saccharomyces boulardi như Bioflor, Ultra - Levue để điều trị một

số trường hợp.[6]

- ỉa chảy nhiễm trùng cấp tính do vi khuẩn, vi rút, nấm

- Điều trị và dự phòng ỉa chảy do sử dụng kháng sinh

- Điều trị hội chứng kích thích ruột (thường gọi là viêm đại tràng cơ năng)

^ 3 Sinh tổng hợp p-carotene

|3-carotene có thể được tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhau như: Thực vật, tảo, vi khuẩn, nấm mốc, nấm men trong đó nguồn sinh tổng họp Ị3-carotene được nghiên cứu nhiều nhất là từ nấm mốc và nấm men Bởi những ưu việt

trong công nghệ vi sinh Nấm mốc, điển hình là Blakeslea tripora hiệu quả, khả năng tổng hợp (3-carotene cao nhưng điều kiện nuôi cấy, tách chiết phức tạp nên ng ười ta chú ý tới nấm men nhiều hơn do có những ưu điểm như: cấu tạo đơn bào, ổn định và rất dễ phát triển trên các môi trường nuôi cấy.

Trên thế giới nhiều nghiên cứu về nấm men sinh tổng hợp các hợp carrotcarotennoid đã được ứng dụng vào sản xuất, tạo nguồn nguyên liệu cho

thực phẩm và sản xuất thuốc Một số nấm men thuộc chi Rhodotorula

Phaffia, đã được công bố như ở bảng 1 [18, 23, 22]

Bảng 1 Các chủng nấm men sinh tổng hợp ị3-carotene đã được công bố

Tổng lượng Lượng ị3-caroteneChủng Carotenoid jug/ g sinh khối

|xg/ g sinh khối khô khô

cứu về sự ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy như: nguồn dinh dưỡng Nitơ, Cacbon, các nguyên tố khoáng, vi lượng, pH, nhiệt độ nhằm tối ưu hóa các điều kiện sinh tổng họp của nấm men trong sản xuất đã được nghiên cứu [21;22] Việc lai ghép, chuyển gen sinh tổng họp Carotenoid cũng đã được thực hiện trên

Candida utỉlis, tăng hiệu suất sinh tổng họp và thu được loại Carotenoid có tác

dụng sinh học cao như lycopene, ị3-carotene, Astaxanthin Đặc biệt sử dụng kỹ thuật gây đột biến đã tạo ra chủng đột biến có hiệu suất sinh tổng hợp ị3-carotene gấp 200 lần chủng ban đầu và chiếm 80% tổng số Carotenoid Dưới đây là sơ đồ quá trình tổng hợp carotenoid ở nấm men Rhodotorula glutinis CBS20 [21]

Hinh 1: Sơ đồ qúa trình chuyển hoá các Carotenid ở Rhodotoruỉa glutỉnỉs CBS20

PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị.

2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất.

- Ethyl acetat (Trung Quốc)

- Kali nitrat (Việt Nam)

- Glucose (Việt Nam)

- Amonium sulfat (Trung Quốc)

- Methanol (Đức)

- Acetonitril (Đức)

- Diclometan (Đức)-Các loại lá cây lấy ở vườn thực vật Đại học Dược, thị trấn Quốc Oai, thị trấn Gia Lâm

Universal 16 (Hettich)

LG (Hàn Quốc)Eclipse E600-Nikon (Nhật) Jenway 6300 spectrophotometer Alliance-Water (Mỹ)

- Đĩa peptri, pipetman các loại, ống ependorf, ống falcon, đầu côn các loại

2.1.3.MÔÍ số môi trường sử dụng trong nghiên cứu.

Môi trường 1: Môi trường Malt- glucose 2 °Bx

Môi trường 3: Malt- glucose 2 °Bx có bổ xung thạch.2 %

Môi trường 4: Môi trường cơ bản (Base Medium)

Các môi trường đều hấp ở latm, 121°c trong 20 phút

2.2 Phương pháp nghiên cứu:

2.2.1 Phân lập nấm men sắc tố từ lá cây.

Phân lập nấm men có sắc tố vàng đến đỏ từ lá cây trên môi trường (2) theo hai phương pháp là

Phương pháp pha loãng: Cân 5g lá mẫu rồi cắt nhỏ vào ống fancol chứa 20

ml nước cất đã thanh trùng, ngâm và lắc trong 15 phút Tuỳ vào lượng tế bào trong dịch sau khi soi trên kính hiển vi pha loãng ở nồng độ thích hợp Sau

đó cấy lên môi trường (2) Dùng que gạt trải đều trên mặt thạch sau đó để ở 25°c trong 5 ngày

Phương pháp bào tử bắn: Dùng một lượng lá có diện tích gần bằng diện tích mặt thạch, cố định lá trên nắp hộp peptri bằng băng dính hai mặt, mặt dưới của lá hướng mặt thạch Hàng ngày đổi đĩa thạch Các đĩa thạch nuôi cấy

ở 25°c trong 5 ngày rồi quan sát

Các mẫu nấm men sắc tố từ vàng đến đỏ sau khi phân lập được tiến hành thuần khiết trên môi trường số (3) bằng cách cấy zic zac nhiều lần cho đến khi thu được chủng thuần khiết.Sau đó được giữ giống trong ống eppendorf ở nhiệt độ 5 0 c

2.2.2 Tuyển chọn sơ bộ nấm men cho màu đậm nhất.

Môi trường thử: môi trường số (3), dùng pipetman hút 100 |il nước cất vô trùng vào từng ô của bàn chấm có 21 lỗ Sau đó một lượng tế bào tương tự nhau được hoà tan nhẹ nhàng vào nước chứa trong các ô từ 1~>21

Dùng bàn chấm nhúng vào khoang chứa dịch nấm men sau đó chấm lên mặt thạch Đĩa thạch có 21 chủng được cấy chiếu sáng liên tục trong 5 ngày Dựa vào màu sắc, kích thước của khuẩn lạc xác định độ đậm màu của các chủng và chọn lựa chủng cho màu đậm

2.2.3 Tuyển chọn nấm men tổng hợp carotenoid tốt nhất trên các môi

trường có nguồn Nitơ và nguồn Cacbon khác nhau.

■ Với ỴỊguồn Nỉtơ: Môi trường thử là môi trường số (4) và số (5)

Trên môi trường đặc (thêm 2 % thạch): Các chủng tuyển chọn ở 2.2.2

được cấy trên cùng một đĩa môi trường, để ở nhiệt độ phòng và chiếu sáng liên tục trong 5 ngày rồi quan sát màu sắc, hình thái và kích thước khuẩn lạc.Trên môi trường lỏng: đóng trong mỗi ống nghiệm có nắp đã tiệt trùng 5

ml dịch môi trường rồi cấy các chủng nấm men và lắc trên máy lắc ống nghiệm với tốc độ lắc 320 vòng/1 phút, nhiệt độ 25° c chiếu sáng liên tục trong năm ngày Kết hợp cả hai môi trường đặc và lỏng chọn ra mẫu tốt nhất trên môi trường có nguồn Nitơ tưng ứng

Với nguon Cacbon.

Môi trường thử: môi trường số (1, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ), cách điều chế tương tự mục 2 1.3, số lượng môi trường là 100ml Bốn chủng nấm men cấy một lượng tế bào tương đương nhau vào bình tam giác dung tích 500 ml có chứa 100ml dịch môi trường tương ứng Sau đó bình tam giác được lắc và chiếu sáng liên tục trong 8 ngày, tốc độ lắc 140 vòng/1 phút, nhiệt độ 25°c

Hàng ngày quan sát sự biến đổi màu của các mẫu và hút lml dịch nuôi cấy

để lưu mẫu, theo dõi sự phát triển trên các môi trường có nguồn dinh dưỡng Cacbon khác nhau Xác định thời điểm tổng lượng carotenoid lớn nhất, thời điểm bắt đầu suy thoái và nguồn Cacbon tốt nhất trong các nguồn đã thử thể hiện qua sự biến đổi độ đậm mầu của dịch nuôi cấy

2.2.4 Xác định thành phần carotenoid.

Tách chiết cgrrotenoid: lên men sinh khối rồi phá vỡ màng tế bào và tách

chiết carrotenoid bằng dung môi hữu cơ

Đinh lương_ carotenoid bằng, đo quang phổ hấp thu

Nguyên tắc: Các hợp chất carotenoid cho độ hấp thụ cực đại ở 480 nm Định lượng carotenoid bằng phương pháp đo màu với máy đo quang phố Jenway6300 Spectrophotometer.[22]