Phân lập và tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - Phạm Thị Huyền Nhung PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN NẤM MỐC SINH ENZYME HỌ GH61 HỖ TRỢ THỦY PHÂN LIGNOCELLULOSE Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS VŨ NGUYÊN THÀNH Hà Nội - 2012 Lời cảm ơn Trong suốt trình học tập nghiên cứu, em nhận nhiều giúp đỡ, bảo, động viên thầy cô, gia đình bạn bè Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Vũ Nguyên Thành người thầy tận tình hướng dẫn, bảo, tạo điều kiện giúp em thực khóa luận Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán Bộ môn Vi sinh, Viện Công nghiệp Thực phẩm bảo, tạo điều kiện giúp em hoàn thành tốt công việc Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên tận tình dạy dỗ chúng em suốt năm học qua Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân bạn bè người động viên, khích lệ em đường học tập Hà Nội, ngày 12 tháng 12 năm 2012 Học viên Phạm Thị Huyền Nhung DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Thành phần lignocellulose Hình 1.2: Cấu trúc cellulose: kiểu nhiều sợi nhỏ hợp thành (Fringed fibrillar) kiểu chuỗi gấp khúc (Folding chain) Hình 1.3: O – acetyl4 – O – methyl – D – glucuronoxylan từ Hạt kín Hình 1.4: Arabino – – O – methylglucuronoxylan từ Hạt trần Hình 1.5: Glucomannan từ Hạt kín (theo Dekker 1985) Hình 1.6: O – acetylgalactoglucomannan từ Hạt trần Hinh 1.7: loại tiền chất để tổng hợp lignin .11 Hình 1.8: Cấu trúc hóa học lignin .12 Hình 1.9: Phân loại enzyme glycosyl hydrolase 14 Hình 1.10 Hoạt động enzyme GH61 15 Hình 1.11 Sản phẩm oxy hóa C1 từ glucose 16 Hình 1.12: sợi nấm cấu trúc vách tế bào sợi nấm (Samson et al, 1995) 18 Hình 1.13: Bào tử động (theo Samson et al, 1995) 19 Hình 1.14: Bào tử túi (b) Mucor circinelloides, (a) Cuống bào tử túi .19 Hình 1.15: Các kiểu cuống bào tử đính Aspergillus 20 Hình 1.16: Bào tử đính cuống bào tử đính Penicillium chrysogenum 21 Hình 1.17 Cuống bào tử phân nhánh Trichoderma a T viride, b T koningii, c T polysporum, d T citrinoviride 21 Hình 1.18: bào tử đính Fusarium eumartii 22 Hình 1.19 Bào tử đốt 23 Hình 3.1 Phổ điện di SDS – PAGE Zymogram chủng FEC 514, FEC 515, FEC 516 .48 Hình 3.2 Phổ điện di SDS – PAGE Zymogram chủng FEC 519, FEC 523, FEC 534 .49 Hình 3.3 Phổ điện di SDS – PAGE Zymogram chủng FEC 544, FEC 550 50 Hình 3.4 Phổ điện di SDS – PAGE Zymogram chủng FEC 551, FEC 552 51 Hình 3.5 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 514 .54 Hình 3.6 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 519 .54 Hình 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 523 .54 Hình 3.8 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 534 .55 Hình 3.9 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 550 .55 Hình 3.10 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FEC 551 55 Hình 3.11 Phổ fingerprinting 19 chủng nấm mốc phân lập 55 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Thành phần lignocellulose rác thải phế phụ liệu nông nghiệp phổ biến .3 Bảng 3.1 Các chủng nấm mốc phân lập 40 Bảng 3.2 Hoạt tính xylanse 40 chủng phân nấm mốc phân lập 41 Bảng 3.3 Hoạt tính cellulase 40 chủng nấm mốc phân lập 43 Bảng 3.4 Hoạt tính enzyme xylanase cellulase 10 chủng nấm mốc loại chất carbon khác 45 Bảng 3.5 Hàm lượng protein (µg/ml) 10 chủng nấm mốc nuôi môi trường carbon khác 46 Bảng 3.6 Hàm lượng D – gluconic acid chủng nấm mốc phân lập 52 Bảng 3.7 Phân loại chủng nấm mốc dựa vào hình thái khuẩn lạc tế bào 56 Bảng 3.8: Kí hiệu chủng finger printing 57 Bảng 3.9 Kết phân nhóm 19 chủng nấm mốc kĩ thuật finger printing 58 CÁC CHỮ VIẾT TẮT CMC: Carboxyl Methy Cellulose DNS: Dinitrosalicylic Acid dNTPs: Deoxyribonucleotide triphosphate IU: International Unit (là đơn vị đo lường cho giá trị chất, dựa hoạt động sinh học) GH: Glycoside Hydrolase PDA: Potato Dextro Agar PCR: Polymerase Chain Reaction SDS – PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lignocellulose .2 1.1.1 Cellulose 1.1.2 Hemicellulose 1.1.3 Lignin 1.2 Họ GH 61 (Glycoside Hydrolase 61) 12 1.2.1 Glycoside hydrolase 12 1.2.2 Họ GH 61 .15 1.3 Giới thiệu chung nấm mốc 16 1.3.1 Định nghĩa .16 1.3.2 Hình thái cấu trúc 17 1.3.3 Sinh sản nấm mốc 18 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 Đối tượng 24 2.2 Hóa chất, trang thiết bị máy móc 24 2.2.1 Hóa chất 24 2.2.2 Dụng cụ trang thiết bị máy móc: .25 2.3 Thành phần môi trường dùng nghiên cứu .25 2.3.1 Môi trường Czapeck bột giấy 25 2.3.2 Môi trường PDA 26 2.3.3 Môi trường nuôi cấy tách chiết enzyme 26 2.3.4 Môi trường YM 27 2.4 Phương pháp nghiên cứu 27 2.4.1 Phương pháp phân lập 27 2.4.2 Làm giống 28 2.4.3 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào: .28 2.4.4 Tách chiết enzyme 28 2.4.5 Xác định hoạt tính cellulase (IU) DNS 29 2.4.6 Xác định hoạt tính Xylanase theo phương pháp DNS 30 2.4.7 Định lượng protein theo phương pháp Lowry .32 2.4.8 Điện di protein 33 2.4.9 Phương pháp finger printing 35 2.4.10 Phương pháp phân tích D – gluconic acid 37 Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .40 3.1 Kết phân lập 40 3.2 Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase, xylanase phương pháp DNS 41 3.3 Phân tích hoạt tính enzyme cellulase xylanase loại chất carbon khác 44 3.4 Định lượng protein phương pháp Lowry 46 3.5 Phân tích thành phần protein hệ enzyme 47 3.6 Xác định có mặt enzyme GH61 phân tích D – gluconic acid 52 3.7 Phân nhóm dựa vào hình thái khuẩn lạc, tế bào kỹ thuật fingerprinting 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO 60 MỞ ĐẦU Ngày với phát triển xã hội, ngành công – nông – lâm nghiệp … phát triển cách mạnh mẽ Bên cạnh phát triển lượng chất thải từ ngành thải môi trường ngày nhiều, làm ô nhiễm môi trường sống không sinh vật mà gây ảnh hưởng nghiêm trọng tới người Ngoài chất thải nhân tạo khó bị phân hủy có số chất thải có nguồn gốc từ sinh vật khó bị phân hủy điều kiện thường hay sinh vật thông thường chintin, lignocellulose, pectin… Trong lingocellulose chủ yếu Sự tồn đọng lignocellulose môi trường gây ô nhiễm môi trường mà làm đứt quãng chu trình tuần hoàn vật chất tự nhiên Do việc phân giải lignocellulose có vai trò quan trọng không môi trường mà sinh vật Nhiều nghiên cứu chứng minh khả triển vọng sử dụng enzyme vào việc biến đổi sinh học chất thải lignocellulose để tạo đường đơn hữu ích từ phế phụ liệu chứa lignocellulose [3] Tuy nhiên, lignocellulose chất khó bị phân giải điều kiện thường, có số sinh vật có khả phân hủy chúng Bên cạnh đó, trình đòi hỏi tham gia nhiều enzyme khác đặc biệt enzyme họ Glycoside Hydrolase Nhằm mục đích tăng suất trình thủy phân lignocellulose thành đường đơn, đường đôi từ phế phụ phẩm nông – lâm nghiệp, để từ đưa vào ứng dụng rộng rãi sản xuất sản phẩm có giá trị đời sống người vật nuôi (nhiên liệu sinh học, thức ăn chăn nuôi…), thực đề tài: Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc sinh enzyme họ GH61 hỗ trợ thủy phân lignocellulose CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Lignocellulose Lignocellulose thành phần cấu trúc thành tế bào thực vật Thành phần chủ yếu lignocellulose cellulose, hemicellulose lignin (Hình 1.1) Cellulose hemicellulose đại phân tử cấu tạo từ gốc đường khác nhau, lignin polymer dạng vòng tổng hợp từ tiền phenylpropanoid Thành phần cấu tạo hàm lượng polymer thực vật khác loài Ngoài ra, tùy thuộc vào độ tuổi, giai đoạn sinh trưởng, phát triển điều kiện môi trường Thành phần lignocellulose trình bày bảng 1.1 [10] Hình 1.1: Thành phần lignocellulose KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Sau trình nghiên cứu thu kết sau: Phân lập 40 chủng nấm mốc thu từ mẫu địa bàn khác Hà Nội, Sơn Tây, Hưng Yên Tuy Hòa Trong có 19 chủng có hoạt tính xylanase cao (IU/ml >5) Các chủng nấm mốc phát triển môi trường có chất carbon bã lúa mì tốt so với chất hỗn hợp avicel Hàm lượng protein dịch chiết enyme 10 chủng nấm mốc (có IU/ml > 10) cao với số lượng băng protein nhiều (trừ FEC 523, FEC 544) Các chủng khác nuôi chất carbon khác cho số lượng băng cellulase xylanase khác Phân nhóm định tên chi 19 chủng nấm mốc dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc, tế bào phổ finger printing Từ chọn 10 nhóm nấm mốc khác thuộc chi: Penicillium, Aspergillus, Fumarium / Acremonium, Trichoderma chi chưa rõ Các chủng nấm mốc phân lập chứa enzyme GH61 KIẾN NGHỊ Cần tiến hành giải trình tự để xác định xác tên loài 10 nhóm nấm mốc phân lập Cần tiếp tục phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh enzyme họ GH61 59 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Văn Bá cs (2005), “Giáo trình nấm học”, trường Đại học Cần Thơ, Viện nghiên cứu phát triển công nghệ sinh học Nguyễn Huy Phiêu, Phùng Ngọc Bộ – Nghiên cứu cấu tạo lignin bồ đề tre nứa Tạp chí Hoá học ứng dụng số 3-2002 tr.17 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007),”Tương lai ứng dụng Enzyme xử lý phế thải”, Tạp chí Khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 23: 75-85 Tài liệu tiếng anh Arja M O (2004), Trichoderma reesei strains for production of cellulases for the textile industry, Espoo 2004, VTT Publication 550 Chandrakant P, Bisaria V.S (1998), “Simultaneous Bioconversion of Cellulose and Hemicellullose to Ethanol”, Critical Reviews in Biotechnology, 18 (4), pp 295-331 Crawford, R L (1981), “Lignin biodegradation and transformation”, John Wiley and Sons, New York David Cannella et al, (2012), “Biotechnology for Biofuels”, Frederksberg C, Denmark 60 E Sjöström (1993), Wood Chemistry: Fundamentals and Applications, Academic Press G Buschle-Diller, C Fanter, F Loth (April 1999), “Structural changes in hemp fibers as a result of enzymatic hydrolysis with mixed enzyme systems", Textile Research Journal 69 (4), 244-251 10 Higuchi T (1978) “Lignin structure and morphological distribution in plant cell walls”, Lignin Biodegradation: Microbiology, Chemistry, and Potential Applications, 1, 1-17 11 Howard R.L., Abotsi E., Jansen van Rensburg and Howard S (2003) “Lignocellulose biotechnology: issues of bioconversion and enzyme production” African Journal of Biotechnology, 2, 602 – 619 12 J Pe´rez et al (2002) “Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicelluloses and lignin: an overview”, Int Microbiol 5, 53–63 13 Joshi, S; Agte, V (1995) "Digestibility of dietary fiber components in vegetarian men", Plant foods for human nutrition (Dordrecht, Netherlands) 48 (1), 39–44 14 Klemm, Dieter; Brigitte Heublein, Hans-Peter Fink, Andreas Bohn (2005) "Cellulose: Fascinating Biopolymer and Sustainable Raw Material, ChemInform 36 (36) 15 Lebo, Stuart E Jr.; Gargulak, Jerry D and McNally, Timothy J (2001), “Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology”, John Wiley & Sons 16 Martone, Pt; Estevez, Jm; Lu, F; Ruel, K; Denny, Mw; Somerville, C; Ralph, J (2009), "Discovery of Lignin in Seaweed Reveals Convergent Evolution of Cell-Wall Architecture", Current biology, CB 19 (2): 169–75 17 Paul V Harris et al (2010) “Stimulation of Lignocellulosic Biomass Hydrolysis by Proteins of Glycoside Hydrolase Family 61: Structure and Function of a Large, Enigmatic Family”, Biochemistry, 49 (15) 61 18 Sinnott, M L (1990) "Catalytic mechanisms of enzymatic glycosyl transfer" Chem Rev, 90, 1171-1202 19 Slavin, JL; Brauer, PM; Marlett, JA (1981) "Neutral detergent fiber, hemicellulose and cellulose digestibility in human subjects", The Journal of Nutrition, 111 (2): 287–97 20 Thomas W Jeffries “Biodegradation (1994), of lignin and hemicelluloses”, Biochemistry of Microbial Degradation, 233-277.hemi4 21 Updegraff DM (1969) "Semimicro determination of cellulose in biological materials".Analytical Biochemistry, 32 (3): 420–424 22 W Boerjan, J Ralph, M Baucher (2003), "Lignin bios", Ann Rev Plant Biol, 54 (1), 519–549 Các nguồn khác 23 http://en.wikipedia.org/wiki/Cellulose 24 http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html 25 http://en.wikipedia.org/wiki/Lignin 62 PHỤ LỤC 1: ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ NGUỒN GỐC CỦA 40 CHỦNG NẤM MỐC PHÂN LẬP ĐƯỢC STT Kí hiệu chủng FEC 500 Địa điểm ĐHSP Môi trường Nguồn gốc Mẫu phân hủy PDA FEC 501 Lá nhãn phân hủy PDA FEC 502 Vỏ trấu phân hủy PDA FEC 504 FEC 505 Đất mùn Thân mục Czapeck Czapeck FEC 507 FEC 508 FEC 509 Thân mục Lá nhãn phân hủy Vỏ trấu phân hủy PDA PDA Czapeck FEC 511 Rơm phân hủy PDA 10 11 FEC 512 FEC 513 Rơm phân hủy Rơm phân hủy Czapeck PDA 63 Đặc điểm khuẩn lạc Sợi trắng dài, thạch có màu đen để lâu Sợi trắng dài, phía màu vàng chanh Sợi trắng, phía có màu đen, thạch chuyển màu Dạng sợi màu trắng, phía thạch có màu tím nhạt (ít) Dạng hạt màu rêu xám Sợi trắng dài, phía màu vàng chanh Dạng hạt, màu vàng chanh Dạng sợi màu trắng Màu xám, bề mặt gồ ghề, mép khuẩn lạc nhăn nheo Dạng sợi màu trắng, phía thạch có màu tím nhạt Sợi bông, trắng 12 13 14 FEC 514 FEC 515 FEC 516 Rơm phân hủy Rơm phân hủy Đất mùn PDA PDA Czapeck 15 16 17 FEC 517 FEC 518 FEC 519 Đất mùn Đất mùn Đấ tmùn Czapeck Czapeck Czapeck 18 19 20 FEC 520 FEC 521 FEC 523 Thân mục Rơm phân hủy Rơm phân hủy PDA Czapeck Czapeck 21 FEC 531 Cành mục PDA 22 FEC 532 cànhcâymục PDA 23 FEC 534 Cây mục PDA 24 FEC 535 vỏ khô Czapeck 25 FEC 536 vỏ khô Czapeck 26 27 FEC 537 FEC 538 vỏ khô vỏ khô PDA Czapeck Thành cổ SơnTây 64 Dạng len xốp, màu xanh lá, thạch chuyển màu nâu đỏ Dạng len xốp, màu xanh Dạng hạt, màu xanh nhạt Dề mặt dạng hạt, màu xám đen, phía màu đen Dạng hạt, màu xanh nhạt Dạng hạt, màu xanh nhạt Sợi trắng, sau chuyển phần sang màuxanh Dạng hạt, màu xanh nhạt Bề mặt sợi trắng, phía màu tím Màu xám, bề mặt gồ ghề, mép khuẩn lạc nhăn nheo Bề mặt gồ ghề, màu xanh, thạch chuyển màu vàng xanh Bề mặt ghồ ghề, màu xanh, thạch chuyển sang vàng Bề mặt dạng sợi màu trắng, phía màu đen Bề mặt dạng hạt, màu xám đen, phía màu đen Xanh rêu, có sợi trắng,thạch chuyển màu nâu Bề mặt dạng hạt, màu xám đen, phía 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 FEC 540 FEC 543 FEC 544 FEC 545 FEC 546 FEC 447 FEC 548 FEC 550 FEC 551 FEC 552 FEC 553 FEC 554 FEC 556 Hưng Yên Lá mục Gỗ mục Gỗ mục Gỗ mục Gỗ mục Gỗ mục Gỗ mục Tuy Hòa Gỗ mục Czapeck Czapeck PDA Czapeck Czapeck PDA PDA PDA PDA PDA PDA PDA PDA 65 màu đen Dạng hạt nhỏ, màu be Bề mặt gồ ghề, màu trắng Sợi bông, trắng Đen, tạo khối Dạng hạt, màuxanhnhạt Màu xám, hạt nhỏ Sợi bông, trắng Đen, hạt Nâu đồng, dạng hạt Xanh nhạt, thạch chuyển màu vàng Xanh xám Đen, xám, dạng hạt Đen, tạo thành khối PHỤ LỤC 2: HÌNH THÁI KHUẨN LẠC VÀ TẾ BÀO CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC FEC 504 FEC 513 FEC 515 66 FEC 516 FEC 518 FEC 519 67 FEC 520 FEC 521 FEC 523 68 FEC 532 FEC 538 FEC 544 69 FEC 546 FEC 548 70 PHỤ LỤC 3: KẾT QUẢ ĐO OD540 (XYLANASE) THEO PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH DNS STT 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 Kí hiệu chủng FEC 514 FEC 514A FEC 514W FEC 515 FEC 515A FEC 515W FEC 516 FCE 516A FEC 516w FEC 519 FEC 519A FEC 519W FEC 523 FEC 523A FEC 523W FEC 534 FEC 534A FEC 534W FEC 544 FEC 544A FEC 544W FEC 550 FEC 550A FEC 550W FEC 551 FEC 551A FEC 551W FEC 552 FEC 552A FEC 552W Độ pha loãng 90 100 70 150 150 100 50 50 80 50 70 40 10 50 50 70 20 20 50 60 40 80 60 60 80 50 70 OD mẫu thí nghiệm 0.471 0.705 0.658 0.551 0.532 0.636 0.43 0.211 0.673 0.233 0.442 0.64 0.322 0.422 0.535 0.431 0.4 0.566 0.698 0.371 0.387 0.25 0.164 0.987 0.474 0.232 0.206 0.311 0.28 0.571 71 OD mẫu đối chứng 0.116 0.078 0.079 0.026 0.061 0.119 0.103 0.095 0.094 0.1 0.068 0.134 0.062 0.104 0.092 0.175 0.111 0.156 0.134 0.092 0.116 0.117 0.058 0.162 0.134 0.104 0.129 0.129 0.122 0.132 IU/ml 25.05 49.16 31.78 61.74 55.39 40.53 12.82 4.55 36.31 5.21 0.29 27.77 8.15 2.49 17.37 10.04 0.23 22.50 8.84 4.37 10.62 6.26 3.32 51.74 15.99 6.02 4.83 7.13 0.12 24.09 PHỤ LỤC 4: KẾT QUẢ ĐO OD660 THEO PHƯƠNG PHÁP LOWRY Đường chuẩn BSA: BSA (µg/ml) OD 660 nm 0 50 0.139 100 0.192 200 0.461 300 0.51 400 0.769 500 0.881 STT Kết đo OD STT Kí hiệu chủng Độ pha loãng OD 660 µg/ml FEC 514 10 0.459 4590 FEC 514A 10 0.393 3930 FEC 514W 10 0.552 5520 FEC 515 10 0.543 5430 FEC 515A 10 0.238 2380 FEC 515W 10 0.537 5370 FEC 516 10 0.424 4240 72 FCE 516A 10 0.39 3900 FEC 516w 10 0.511 5110 10 FEC 519 10 0.452 4520 11 FEC 519A 10 0.426 4260 12 FEC 519W 10 0.457 4570 13 FEC 523 10 0.3 3000 14 FEC 523A 10 0.248 2480 15 FEC 523W 10 0.313 3130 16 FEC 534 10 0.368 3680 17 FEC 534A 10 0.229 2290 18 FEC 534W 10 0.392 3920 19 FEC 544 10 0.304 3040 20 FEC 544A 10 0.381 3810 21 FEC 544W 10 0.463 4630 22 FEC 550 10 0.411 4110 23 FEC 550A 10 0.253 2530 25 FEC 551 10 0.581 5810 26 FEC 551A 10 0.445 4450 27 FEC 551W 10 0.424 4240 28 FEC 552 10 0.424 4240 29 FEC 552A 10 0.399 3990 30 FEC 552W 10 0.316 3760 73 [...]... Nói chung, nấm mốc sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính Trong sinh sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái a Sinh sản vô tính 18 The Alexopoulos và Mims (1979), nấm mốc sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng... 1.9: Phân loại enzyme glycosyl hydrolase a)Theo cấu trúc hóa học lập thể của phản ứng b)Theo exo/endo 14 1.2.2 Họ GH 61 Trong số các họ glycoside hydrolase xúc tác thủy phân cellulose và hemicellulose, thì vai trò chức năng của họ 61 (GH61) vẫn còn nhiều điều chưa được làm sáng tỏ cho đến gần đây Đặc tính của GH61 protein được mô tả đầu tiên vào năm 1992 Ban đầu họ glycoside hydrolase 61 được phân. .. dựa vào việc đo lường hoạt động của endo-1,4-β-D-glucanase của một số thành viên trong họ mặc dù hoạt động của enzyme này là rất yếu Khác với các enzyme GH khác, enzyme họ GH61 không có khả năng thủy phân liên kết glycoside hoặc rất yếu [17], vai trò chính của nó là oxy hóa cellulose tạo ra các đầu hở, tạo điều kiện cho các enzyme cellulase bám vào hoạt động [7] Hình 1.10 Hoạt động của enzyme GH61. .. của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn (Hình 1.12) Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc... trên tế bào nội mô Enzyme lactase cần thiết cho sự phân giải lactose sữa Enzyme O – GlcNAcase liên quan đến việc loại bỏ các nhóm Nacetylglucoamine từ serine và threonine thừa trong tế bào chất và nhân tế bào Glycoside hydrolase còn tham gia vào quá trình sinh tổng hợp và phân giải glycogen trong cơ thể [18] Glycoside hydrolase được phân thành nhóm EC 3.2.1 là enzyme xúc tác thủy phân của O- hoặc S-glycoside... làm sạch 2-3 lần đến khi thu được chủng nấm mốc tinh sạch 2.4.3 Quan sát hình thái khuẩn lạc, tế bào: Các chủng nấm mốc được nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa PDA ở 30 oC sau 3 - 5 ngày lấy ra quan sát hình dạng, kích thước, màu sắc khuẩn lạc Làm tiêu bản và quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi ở vật kính 40x 2.4.4 Tách chiết enzyme Các chủng nấm mốc phân lập được nuôi cấy trên ống thạch nghiêng... diệp lục, sống dị dưỡng (hoại sinh, ký sinh, cộng sinh) , vách tế bào được cấu tạo chủ yếu là chitin, có hoặc không có cellulose Màu sắc của nấm mốc được xác định bởi các bào tử do nó sinh ra như màu xanh, vàng, trắng, đen, nâu… Nhiều loài nấm mốc có khả năng ký sinh trên động vật, thực vật, và trên con người Một số chúng là tác nhân gây bệnh, làm hư hại lương thực, thực phẩm và các đồ dùng, thiết bị Tuy... sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm 17 Hình 1.12: sợi nấm và cấu trúc vách tế bào sợi nấm (Samson et al, 1995) Một bào tử rơi xuống gặp môi trường thuận lợi sẽ nảy mầm tạo khuẩn lạc Sợi nấm hút thức ăn làm nhiệm vụ nuôi dưỡng gọi là khuẩn ty cơ chất Sợi mang cuống bào tử làm nhiệm vụ sinh sản gọi là khuẩn ty khí sinh 1.3.3 Sinh sản của nấm mốc. .. CỨU 2.1 Đối tượng Chúng tôi tiến hành nghiên cứu 40 chủng nấm mốc phân lập được từ các mẫu: cây mục, lá mục, gỗ mục và mẫu đất… từ các khu vực khác nhau như: Hà Nội, Hưng Yên và Tuy Hòa 2.2 Hóa chất, trang thiết bị máy móc 2.2.1 Hóa chất Hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều là các hóa chất tinh khiết và chuyên dụng Các hóa chất dùng cho sinh học phân tử phần lớn có nguồn gốc từ các hãng: Sigma (Mỹ),... và nhóm hydroxyl tận cùng của rượu β – coumaryl [22] 11 Hình 1.8: Cấu trúc hóa học của lignin 1.2 Họ GH 61 (Glycoside Hydrolase 61) 1.2.1 Glycoside hydrolase Glycoside hydrolase (còn gọi là glycosidase hoặc glycosyl hydrolase) xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết glycoside để tạo thành các phân tử đường nhỏ hơn Chúng là enzyme rất phổ biến trong tự nhiên, có vai trò như phân giải sinh khối sinh